本發(fā)明涉及細(xì)胞的分離方法，具體涉及一種鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離方法。

背景技術(shù)：

淋巴細(xì)胞參與特異性免疫反應(yīng)，在免疫應(yīng)答中起主要作用。魚類的淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞中數(shù)量最多的一類，通常占白細(xì)胞總量的90％左右，其個(gè)體小，含有較大的細(xì)胞核。與哺乳動(dòng)物類似，魚類淋巴細(xì)胞包括t淋巴細(xì)胞和b淋巴細(xì)胞兩種，其中，t淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫并在免疫應(yīng)答中起調(diào)節(jié)作用，而b淋巴細(xì)胞在體液免疫中參與抗體的合成。對(duì)淋巴細(xì)胞功能及活化機(jī)制等方面的研究一直是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，而制備高活性和高純度的淋巴細(xì)胞是進(jìn)行這些研究的先決條件。

密度梯度離心法是利用不同細(xì)胞沉降系數(shù)有差異的原理，使細(xì)胞在一定離心力作用下以各自的速度沉降，從而形成區(qū)帶，使得不同類型的細(xì)胞得以分離和純化。淋巴細(xì)胞分離液是基于密度梯度離心原理設(shè)計(jì)的淋巴細(xì)胞分離試劑，利用淋巴細(xì)胞分離液能夠獲得高純度的淋巴細(xì)胞。但是分離不同種屬外周血中的淋巴細(xì)胞要求使用不同質(zhì)量濃度的分離液。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，針對(duì)鱘魚的淋巴細(xì)胞分離液及淋巴細(xì)胞分離方法尚未建立。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離方法。

本發(fā)明提供的鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離方法包括如下步驟：將鱘魚外周血加入淋巴細(xì)胞分離液中，離心，離心管內(nèi)液體出現(xiàn)分層，由上至下分別為血漿層、淋巴細(xì)胞富集層、淋巴細(xì)胞分離液層和紅細(xì)胞堆積層；收集所述淋巴細(xì)胞富集層，得到鱘魚外周血淋巴細(xì)胞；

所述淋巴細(xì)胞分離液的制備方法如下：將percoll原液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.5％的nacl水溶液按照體積比為9:1的比例混勻，得到100％percoll液，再將所述質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％的nacl水溶液與所述100％percoll液按照體積比為3:7的比例混勻，得到淋巴細(xì)胞分離液。

上述方法中，所述鱘魚外周血與所述淋巴細(xì)胞分離液的體積比為2:1。所述鱘魚外周血為抗凝鱘魚外周血，所述抗凝鱘魚外周血是將鱘魚外周血與抗凝劑混勻得到的，所述抗凝鱘魚外周血中的鱘魚外周血與抗凝劑的體積比為1:1，所述抗凝劑具體為肝素鈉溶液。

上述方法中，所述收集淋巴細(xì)胞富集層的方法為用移液器逐層吸取。具體方法如下：使用移液器吸取最上層的血漿層，棄血漿層，然后吸取淋巴細(xì)胞富集層。

上述方法中，所述離心的條件為500g離心40min。

上述方法中，所述鱘魚為小體鱘。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述方法的新用途。

本發(fā)明提供了上述方法在提高鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的回收率中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述方法在提高鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的存活率中的應(yīng)用。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述淋巴細(xì)胞分離液。

上述淋巴細(xì)胞分離液在鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種分離鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的分離鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的產(chǎn)品其包括上述淋巴細(xì)胞分離液。

本發(fā)明的方法包括如下步驟：將鱘魚外周血加入淋巴細(xì)胞分離液中，離心，離心管內(nèi)液體出現(xiàn)分層，由上至下分別為血漿層、淋巴細(xì)胞富集層、淋巴細(xì)胞分離液層和紅細(xì)胞堆積層；收集所述淋巴細(xì)胞富集層，得到鱘魚外周血淋巴細(xì)胞；所述淋巴細(xì)胞分離液的濃度為1.092g/ml。本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)便、回收率高和淋巴細(xì)胞存活率高的特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為不同比重淋巴細(xì)胞分離液分離鱘魚淋巴細(xì)胞的效果對(duì)比圖。

圖2為淋巴細(xì)胞分離液分離鱘魚淋巴細(xì)胞結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的全部試劑均需進(jìn)行滅菌處理，試劑混合需在無(wú)菌操作環(huán)境下進(jìn)行。

下述實(shí)施例中的percoll原液購(gòu)自寶如億(北京)生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為ge17-0891-01。

下述實(shí)施例中的肝素鈉溶液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％的nacl水溶液，溶質(zhì)為肝素鈉，肝素鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。

下述實(shí)施例中的濃度為1.075g/ml、1.080g/ml、1.086g/ml和1.092g/ml的淋巴細(xì)胞分離液中的濃度是指實(shí)際密度。

實(shí)施例1、一種鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離方法

一、不同比重的percoll工作液的配制

配制不同比重的percoll工作液，并置于無(wú)菌尖頭離心管中。具體步驟如下：

(1)55％的percoll工作液(濃度為1.075g/ml的淋巴細(xì)胞分離液)

55％的percoll工作液的具體配制方法如下：將percoll原液(percoll原液的密度為1.131g/ml)與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.5％的nacl水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.5％的nacl水溶液的密度為1.099g/ml)按照體積比為9:1的比例混勻，配制成100％percoll液，再將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％的nacl水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％的nacl水溶液的密度為1.0099g/ml)與100％percoll液按照體積比為9:11的比例混勻，配制成55％的percoll工作液。

(2)60％的percoll工作液(濃度為1.080g/ml的淋巴細(xì)胞分離液)

60％的percoll工作液的具體配制方法如下：將percoll原液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.5％的nacl水溶液按照體積比為9:1的比例混勻，配制成100％percoll液，再將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％的nacl水溶液與100％percoll液按照體積比為4:6的比例混勻，配制成60％的percoll工作液。

(3)65％的percoll工作液(濃度為1.086g/ml的淋巴細(xì)胞分離液)

65％的percoll工作液的具體配制方法如下：將percoll原液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.5％的nacl水溶液按照體積比為9:1的比例混勻，配制成100％percoll液，再將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％的nacl水溶液與100％percoll液按照體積比為7:13的比例混勻，配制成65％的percoll工作液。

(4)70％的percoll工作液(濃度為1.092g/ml的淋巴細(xì)胞分離液)

70％的percoll工作液的具體配制方法如下：將percoll原液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.5％的nacl水溶液按照體積比為9:1的比例混勻，配制成100％percoll液，再將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％的nacl水溶液與100％percoll液按照體積比為3:7的比例混勻，配制成70％的percoll工作液。

二、鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離

1、實(shí)驗(yàn)材料

以3尾小體鱘外周血為實(shí)驗(yàn)材料，外周血均為抗凝外周血，抗凝外周血中小體鱘外周血和抗凝劑(肝素鈉水溶液)的體積比為1:1。

2、外周血淋巴細(xì)胞的分離

將1.2ml抗凝外周血沿管壁分別緩慢加入到含有0.6ml不同比重(55％、60％、65％和70％)的percoll工作液的無(wú)菌尖頭離心管中，擰緊離心管蓋，使用水平轉(zhuǎn)子(eppendorf5804r臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，a-4-44水平轉(zhuǎn)子)500g離心40min。

水平離心后觀察發(fā)現(xiàn)，離心管內(nèi)液體明顯分為4層(圖1和圖2)，由上至下依次如下：最上層略偏黃色的血漿層、第2層灰白呈膜狀的淋巴細(xì)胞富集層、第3層無(wú)色透明的淋巴細(xì)胞分離液層以及最下層紅色的紅細(xì)胞堆積層。

2、外周血淋巴細(xì)胞的收集

使用移液器吸取最上層的血漿層，棄血漿層，然后吸取淋巴細(xì)胞富集層。

3、淋巴細(xì)胞回收率的統(tǒng)計(jì)

利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)淋巴細(xì)胞富集層中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算淋巴細(xì)胞回收率。淋巴細(xì)胞回收率＝從外周血中回收的淋巴細(xì)胞數(shù)量/同體積外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量×100％，即表1中的分離的淋巴細(xì)胞數(shù)量與血液中淋巴細(xì)胞數(shù)量的比值。

結(jié)果如表1所示。從表1中結(jié)果可知，70％的percoll工作液，即濃度為1.092g/ml的淋巴細(xì)胞分離液，可以從鱘魚外周血中分離出較多的淋巴細(xì)胞，平均回收率為89.62+8.08％。

表1、不同密度淋巴細(xì)胞分離液的分離效果

4、淋巴細(xì)胞存活率的統(tǒng)計(jì)

臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)淋巴細(xì)胞存活率。具體步驟如下：將淋巴細(xì)胞液(步驟2中吸取的淋巴細(xì)胞富集層)與0.4％臺(tái)盼藍(lán)染液(碧云天，貨號(hào)c0011)按照體積比1:1混勻，在3-5min內(nèi)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，被染成藍(lán)色的是死細(xì)胞，無(wú)色的為活細(xì)胞，并計(jì)算回收后的淋巴細(xì)胞的存活率。

結(jié)果表明：回收后的淋巴細(xì)胞存活率均大于99％。