本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說(shuō)，涉及正調(diào)控橡膠樹(shù)花青素合成的r2r3-myb轉(zhuǎn)錄因子hban1及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

早在1994年馬來(lái)西亞的arokiaraj等使用基因槍法，獲得世界上第一株橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株，然而，至今為止均以nptii為篩選標(biāo)記，gus或gfp為報(bào)告基因，篩選效率均較低，需要發(fā)展新型的橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)基因篩選基因?；ㄇ嗨赝ǔ３始t色或紫色，由于肉眼直接可辨，已被應(yīng)用于玉米、煙草、西紅柿、紅薯、葡萄、蘋(píng)果等轉(zhuǎn)基因體系的可視化篩選標(biāo)記及病毒侵染示蹤、硼元素缺乏實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，其主要受由r2r3-myb、bhlh和wd40三類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成mbw(myb-bhlh-wd40)復(fù)合體調(diào)控，其中wd40在mbw復(fù)合體中主要起到骨架作用，r2r3-myb/bhlh蛋白，直接結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子，激活結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，因此，r2r3-myb轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控花青素合成的關(guān)鍵因子。

控制植物花青素累積r2r3-myb轉(zhuǎn)錄因子在分子結(jié)構(gòu)上具有很強(qiáng)保守性，它具有r2、r3兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，且r3具有與bhlh互作結(jié)構(gòu)域，這為同源克隆和識(shí)別提供了分子特征。同時(shí)，r2r3-myb也具有特異結(jié)構(gòu)，使得r2r3-myb在花青素合成調(diào)控具有物種和組織特異性。如蘋(píng)果控制花青素合成的r2r3-myb主要包括mdmyb1、mdmyba、mdmyb10和mdmyb110a，其中，mdmyb1和mdmyba主要調(diào)控果皮花青素的生物合成，mdmyb10參與果皮、果肉以及葉片中花青素的調(diào)控，而果實(shí)外皮層組織的花青素合成則由與mdmyb10同源的md110a調(diào)控。同樣的myb基因轉(zhuǎn)入不同的植物中，誘導(dǎo)花青素的合成積累存在較大差異。蘋(píng)果r6：mdmyb10過(guò)表達(dá)使蘋(píng)果的愈傷組織、芽、植株均可用肉眼觀察到紅色花青素，而只能使草莓的葉片和根部觀察到紅色花青素積累，馬鈴薯芽或根需要酸性甲醇提后，才能觀察到花青素累積。煙草myb類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子ntan2能使煙草花器官累積花青素，蒺藜苜蓿的myb類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子lap1能使蒺藜苜蓿、紫花苜?；ㄇ嗨乩鄯e。這意味著物種自身來(lái)源的花青素累積r2r3-myb轉(zhuǎn)錄因子，能夠通過(guò)自身過(guò)表達(dá)實(shí)現(xiàn)花青素累積量增加。

橡膠樹(shù)古銅期葉片以及暗培養(yǎng)下植株莖稈均為紫紅色，同時(shí)，橡膠樹(shù)胚狀體在茉莉酸誘導(dǎo)時(shí)也會(huì)變紅，這些組織的顏色均由花青素-矢車(chē)菊素累積造成，說(shuō)明橡膠樹(shù)自身具有花青素合成的完整的代謝途徑，為利用花青素基因結(jié)構(gòu)保守性克隆橡膠樹(shù)花青素r2r3-myb調(diào)控基因，以及發(fā)展橡膠樹(shù)花青素篩選標(biāo)記基因提供了可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種正調(diào)控橡膠樹(shù)花青素合成的r2r3-myb轉(zhuǎn)錄因子hban1及其編碼基因與應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了正調(diào)控橡膠樹(shù)花青素合成的r2r3-myb轉(zhuǎn)錄因子hban1，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

第二方面，本發(fā)明提供了前述轉(zhuǎn)錄因子hban1的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，前述轉(zhuǎn)錄因子可正調(diào)控橡膠樹(shù)花青素的合成，能夠通過(guò)自身過(guò)表達(dá)實(shí)現(xiàn)花青素累積量增加。

因此，所述編碼基因在與橡膠樹(shù)合成花青素相關(guān)的方面具有良好的應(yīng)用前景。

鑒于此，含有本發(fā)明所述編碼基因的表達(dá)載體、工程菌及其他利用基因工程手段所使用的含有所述編碼基因的工具也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了用于特異性擴(kuò)增所述編碼基因的引物，其核苷酸序列如seqidno.3～4所示。

第三方面，本發(fā)明還提供了所述編碼基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

以及，所述編碼基因在橡膠樹(shù)健康監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用。所述監(jiān)測(cè)包括但不限于監(jiān)測(cè)橡膠樹(shù)病毒侵染，和/或營(yíng)養(yǎng)元素缺乏等。

本發(fā)明首次從橡膠樹(shù)中分離出調(diào)控花青素合成r2r3-myb轉(zhuǎn)錄因子hban1的編碼基因序列，并明確其功能及應(yīng)用范圍。

本發(fā)明將hban1與其他物種10個(gè)花青素合成相關(guān)r2r3-myb蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，hban1不但具有r2r3-myb兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)，在r3中具有與bhlh互作結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是花青素合成myb調(diào)控因子的特征結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明以古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期等4個(gè)時(shí)期葉片及暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)嫩莖為材料，設(shè)計(jì)熒光定量pcr引物，進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，hban1隨著葉片老化及花青素逐漸褪去，其表達(dá)量逐漸下降，同時(shí)，暗培養(yǎng)嫩莖中hban1表達(dá)要高于光照培養(yǎng)嫩莖，這與花青素含量正相關(guān)。

將hban1克隆到pcambia2301中，以35s作為啟動(dòng)子，nos作為終止子，然后，轉(zhuǎn)化到gv3101中用于侵染煙草。首先將菌液涂布于含三種抗生素的lb固體培養(yǎng)基中(50mg/l的rifampin，50mg/l的gentamycin，50mg/l的kanamycin)，28℃，培養(yǎng)48h。隨后，挑取單菌落接種于10ml含上述三種抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)18h。繼而，室溫離心后重懸，28℃，振蕩培養(yǎng)4h后，倒入0.5×0.5cm左右的葉盤(pán)中，浸泡15min。浸泡后，將葉片反面朝上放入共培養(yǎng)基中25℃正常光照共培養(yǎng)3d。共培養(yǎng)后，將侵染好的煙草葉片正面朝上轉(zhuǎn)篩選再生培養(yǎng)基中，28℃正常光照培養(yǎng)，令其分化愈傷組織，直至長(zhǎng)出幼芽，待芽長(zhǎng)至2cm左右大小時(shí)，剪下，轉(zhuǎn)入篩選生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其生根。在煙草生長(zhǎng)過(guò)程中觀察其花青素累積情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草花瓣、花托、花絲及葉片較野生型大量累積花青素，證明hban1正調(diào)控花青素合成。

將上述質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105，侵染橡膠樹(shù)次生胚狀體，經(jīng)50mg/lkan篩選后，再生部分抗性胚狀體呈紫紅色，說(shuō)明hban1正調(diào)控橡膠樹(shù)花青素合成。

附圖說(shuō)明

圖1為橡膠樹(shù)r2r3-myb與其他植物控制花青素合成r2r3-myb進(jìn)化分析。

圖2為hban1克隆及序列比對(duì)分析；左圖為克隆的基因；右圖上方框?yàn)閞2結(jié)構(gòu)域，下方框?yàn)閞3結(jié)構(gòu)域，黑色線為bhlh互作結(jié)構(gòu)域。

圖3為hban1在不同組織中表達(dá)分析；1-4：依次為古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期葉片；5和6分別為暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)嫩莖；縱坐標(biāo)為不同組織相對(duì)于1號(hào)組織中hban1表達(dá)量的倍數(shù)。

圖4為不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)化hban1煙草表型；a：煙草分化培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一個(gè)月的小苗；b：轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基7天后植株；c：生根培養(yǎng)基15天后植株。

圖5為轉(zhuǎn)hban1煙草不同組織表型。

圖6為過(guò)表達(dá)hban1的橡膠胚狀體。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1控制橡膠樹(shù)花青素合成r2r3-myb生物信息學(xué)發(fā)掘

以r2r3-myb保守結(jié)構(gòu)域?yàn)樘结?，從橡膠樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取橡膠樹(shù)r2r3-myb轉(zhuǎn)錄因子，共獲得橡膠樹(shù)177個(gè)r2r3-myb，然后，從ncbi下載擬南芥atpap2(at1g66390.1)、矮牽牛phan2(ab982128.1)、煙草ntan2(fj472647.1)、金魚(yú)草amrosea1(dq275529.1)、金魚(yú)草amrosea2(dq275530.1)、金魚(yú)草amvenosa(dq275531.1)、蘋(píng)果mdmyb10(dq267896.1)、馬鈴薯stan1、葡萄vvmyba1(ab097923.1)、葡萄vvmyba2(ab097924.1)等10個(gè)花青素合成相關(guān)r2r3-myb，一起進(jìn)行進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹(shù)scaffold0374_923317和scaffold0598_393375與已鑒定為花青素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在同一進(jìn)化分支(圖1)，推測(cè)兩者與橡膠樹(shù)花青素合成調(diào)控可能相關(guān)。

實(shí)施例2與橡膠樹(shù)花青素合成調(diào)控相關(guān)r2r3-myb克隆及結(jié)構(gòu)域分析

從橡膠樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取scaffold0374_923317序列，并以此序列為檢索序列，對(duì)作者單位葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，調(diào)取一條具有完整orf的基因序列，隨后，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增pcr引物(如seqidno.3～4所示)進(jìn)行擴(kuò)增其orf并測(cè)序分析，結(jié)果獲得與葉片轉(zhuǎn)錄組序列相同的基因序列，其全長(zhǎng)為618bp，將其命名為hban1。另一個(gè)序列表達(dá)量非常低，沒(méi)有擴(kuò)增到。

與擬南芥atpap2(at1g66390.1)、矮牽牛phan2(ab982128.1)、煙草ntan2(fj472647.1)、金魚(yú)草amrosea1(dq275529.1)、金魚(yú)草amrosea2(dq275530.1)、金魚(yú)草amvenosa(dq275531.1)、蘋(píng)果mdmyb10(dq267896.1)、馬鈴薯stan1(ay841127.1)、葡萄vvmyba1(ab097923.1)、葡萄vvmyba2(ab097924.1)等10個(gè)花青素合成相關(guān)r2r3-myb蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，hban1不但具有r2r3-myb兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)，在r3中具有與bhlh互作結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是花青素合成myb調(diào)控因子的特征結(jié)構(gòu)域，預(yù)示著hban1可能是調(diào)控橡膠樹(shù)花青素合成關(guān)鍵調(diào)控因子。

實(shí)施例3hban1組織表達(dá)分析

以古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期等四個(gè)發(fā)育時(shí)期葉片、暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)體胚植株嫩莖cdna為模板，premixextaq為反應(yīng)酶，熒光定量pcr反應(yīng)使用roche公司的lightcycler@2.0熒光定量pcr儀進(jìn)行。熒光定量引物為表1hban1引物。反應(yīng)程序?yàn)?5℃1min，95℃10s，58℃10s，72℃20s，72℃1min。反應(yīng)體系為10μl，其中5μl2×premixextaq，0.25μl引物(10μmol)，0.5μlcdna模板。反應(yīng)結(jié)果使用lightcyclersoftware4.05軟件進(jìn)行分析。以rh8作為內(nèi)參基因，標(biāo)準(zhǔn)品cdna和待測(cè)樣品均設(shè)置3次重復(fù)。定量分析發(fā)現(xiàn)，hban1隨著葉片老化及花青素逐漸褪去，其表達(dá)量逐漸下降，同時(shí)，暗培養(yǎng)嫩莖中hban1表達(dá)要高于光照培養(yǎng)嫩莖，這與花青素含量正相關(guān)。表明hban1與橡膠樹(shù)花青素累積具有相關(guān)性。

實(shí)施例4hban1在煙草中過(guò)表達(dá)分析

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片轉(zhuǎn)化，共獲得11個(gè)轉(zhuǎn)化植株，本研究挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了后續(xù)研究。在發(fā)育早期，葉片花青素累積隨著植株長(zhǎng)大，葉片花青素逐漸褪去，如在植株分化階段以及生根早期，葉片累積大量花青素，而隨著植株葉片增多，隨后葉片花青素累積量變少(圖4)。在植株長(zhǎng)大后，它們的葉片、花瓣、花托、花絲均較非轉(zhuǎn)基因的植株大量累積花青素(圖5)，但是，葉片累積花青素明顯低于花瓣、花托和花絲。

為了檢測(cè)hban1表達(dá)對(duì)煙草內(nèi)源結(jié)構(gòu)基因表達(dá)影響，對(duì)葉片、花瓣、花托和花絲等四個(gè)組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在這四個(gè)組織中內(nèi)源花青素合成結(jié)構(gòu)基因均上調(diào)表達(dá)，尤其是三個(gè)后期結(jié)構(gòu)基因ntdfr、ntans和ntufgt表達(dá)量極顯著上調(diào)。對(duì)于內(nèi)源花青素合成調(diào)控因子，在不同組織中表達(dá)模式與結(jié)構(gòu)基因有所不同，在花瓣中ntan1和ntan2有所下調(diào)，在花托和花絲中ntan1和ntan2或ntan2被上調(diào)，然而，在葉片中ntan1和ntan2并沒(méi)有發(fā)生顯著改變。

實(shí)施例5hban1在橡膠胚狀體中過(guò)表達(dá)分析

將pcambia2301-35s:hban1:nos導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105中，侵染橡膠樹(shù)次生胚狀體，吸干表面菌液后20度共培養(yǎng)3d，將胚狀體切成3mm×3mm胚塊，放入添加500mg/ltimentin+50mg/lkan的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，25d后轉(zhuǎn)入添加相同濃度抗生素的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)體胚分化，每20天在相同培養(yǎng)基繼代一次，直至胚狀體長(zhǎng)大。培養(yǎng)基配方見(jiàn)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利“一種基于次生體胚發(fā)生的橡膠樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化方法(專(zhuān)利號(hào)zl201110198304.x)”。

分化的抗性胚中看到不同大小的胚狀體變紅，如球形胚、子葉形胚(圖6)。證明hban1正調(diào)控橡膠樹(shù)花青素合成，并可以作為可視化篩選標(biāo)記應(yīng)用于橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)基因研究。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所

<120>調(diào)控橡膠樹(shù)花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用

<130>khp171113911.5

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>205

<212>prt

<213>hban1

<400>1

metilelysleuhislysleuleuglyasnargtrpserleuileser

151015

glyargleuproglyargthralaasnaspilelysasnphetrpasn

202530

thrargmetarglysasnilethrtyrcysglugluaspalalyspro

354045

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505560

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65707580

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100105110

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115120125

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145150155160

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<210>2

<211>618

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<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggctagcttcatcatatatggaaggc26

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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