本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用核仁磷酸蛋白基因選擇山羊生長性狀的分子標(biāo)記方法，該方法采用檢測山羊新型的核仁磷酸蛋白因子(nucleophosmin)基因外顯子1堿基多態(tài)性，并分析其對山羊生長性狀的影響，結(jié)果表明：nucleophosmin基因外顯子1由引物p3檢測的snps位點(diǎn)可用作山羊生長性狀選擇的分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)技術(shù)的問世和電泳技術(shù)的改進(jìn)，各種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)隨之興起，這些技術(shù)給家畜的遺傳改良和新品種的培育提供了新的途徑和方法。特別是分子標(biāo)記技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，孕育出一種全新的選種方式，即標(biāo)記輔助選擇法(markerassistantselection)。它可以克服傳統(tǒng)選種過程中根據(jù)表型選擇導(dǎo)致的環(huán)境偏差和抽樣誤差，提高家畜選種的準(zhǔn)確性和高效性，加快優(yōu)良品種的選育，進(jìn)一步推動(dòng)我國畜牧業(yè)的發(fā)展。

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)就是指基因組dna序列中由于單個(gè)核苷酸(a/t/c/g)的替換而引起的多態(tài)性。snps可以是兩個(gè)或多個(gè)等位基因的多態(tài)，因此，通常所說的snps包括堿基的插入、缺失、插入/缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。一個(gè)snp表示在基因組某個(gè)位點(diǎn)上有一個(gè)核苷酸的變化，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(以一種嘧啶置換另一種嘧啶或一種嘌呤置換另一種嘌呤)以及顛換(嘌呤與嘧啶互換)所引起。具有顛換型變異的snps約占2/3，其他幾種snp在相似的水平上，因?yàn)閏pg(核苷酸對，其中g(shù)在dna鏈中緊隨c后)二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的snps，根據(jù)它們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區(qū)snps(csnps)、基因周邊snps(psnps)和基因間snps(isnps)等三類?？偟恼f來，csnp比較少，因?yàn)樵诰幋a區(qū)內(nèi)的變異率僅占有周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對遺傳性狀的影響，csnps又可分為兩種：一種是同義csnps，即snp所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義csnps，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對編碼區(qū)snps的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響，尤其對于編碼區(qū)突變來說，更可能會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白發(fā)生重大變化，從而影響它的功能的發(fā)揮。基因序列上堿基的插入/缺失突變，同樣將導(dǎo)致所編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列改變，以致影響到蛋白的生物學(xué)功能，從而造成對個(gè)體的表現(xiàn)型具有重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些snps作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。

由于snps是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，snps可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的snps很罕見，故snps通常被簡單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)snps：即dna序列測定方法、pcr-sscp與dna測序結(jié)合法、as-pcr方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些snp檢測技術(shù)中，dna序列測定法是最為準(zhǔn)確的snp檢測方法，但是，其檢測費(fèi)用極其昂貴，且需要有dna測序儀等大型儀器，同時(shí)，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，dna序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想snp檢測方法；當(dāng)然，利用pcr-sscp與dna測序結(jié)合法檢測snp可以適當(dāng)降低檢測費(fèi)用，但pcr-sscp的實(shí)驗(yàn)過程比較長，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過程中存在假陰性問題，所以，也并非理想的snp檢測手段；as-pcr方法作為一種新型的snp檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測snp位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺(tái)，對于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來說可實(shí)施性不強(qiáng)。

核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，npm)，也稱為核磷素b23或核仁間質(zhì)蛋白，包括npm1、npm2及npm3，3種亞型。npm1是位于核仁顆粒區(qū)的主要蛋白分子之一，能穿梭于核仁、核質(zhì)和胞質(zhì)之間，參與核糖體前體運(yùn)輸和合成及中心體的復(fù)制，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的周期進(jìn)程和增殖發(fā)育。人類npm1基因位于染色體5q35，基因全長約23kb，含有12個(gè)外顯子，編碼由294個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。在分子結(jié)構(gòu)上npm可分為3個(gè)區(qū)域，分別負(fù)責(zé)不同的功能，由n端開始，npm蛋白包含一個(gè)疏水區(qū)，它參與寡聚化過程，并與npm分子伴侶活性相關(guān)。隨后2個(gè)富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性區(qū)，是與組蛋白結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。在兩個(gè)酸性區(qū)是核糖核酸酶活性區(qū)，與c端的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域一起構(gòu)成核糖核酸酶活性結(jié)構(gòu)域。npm主要定位在核仁顆粒區(qū)，可通過核仁定位信號在核仁、胞核和胞質(zhì)之間往返，參與核質(zhì)間物質(zhì)的運(yùn)輸。npm具有多種生物學(xué)功能。一方面，npm在rrna前體加工過程中發(fā)揮核糖核酸內(nèi)切酶的活性，參與28srrna的形成，進(jìn)而促進(jìn)核糖體的形成，同時(shí)npm可作為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶2(cdk2)/細(xì)胞周期蛋白e復(fù)合物的直接底物，被cdk2/cycline磷酸化，并從中心體中解離出來，啟動(dòng)中心體復(fù)制，在調(diào)控周期進(jìn)程和促進(jìn)細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用。另一方面，npm可以與hiv-rev等帶有核定位信號的蛋白質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)它們運(yùn)輸至核仁并阻止核仁內(nèi)多種蛋白質(zhì)的聚集，還可以結(jié)合組蛋白，介導(dǎo)核小體的合成和致密染色質(zhì)的舒展，發(fā)揮分子伴侶功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種利用核仁磷酸蛋白基因選擇山羊生長性狀的分子標(biāo)記方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：

一種利用核仁磷酸蛋白基因選擇山羊生長性狀的分子標(biāo)記方法，其特征在于，按下列步驟進(jìn)行：

1)以山羊基因組dna為模板，在taqdna聚合酶、緩沖環(huán)境、mg²⁺、dntps存在的情況下，利用引物p1～引物p4在pcr條件下進(jìn)行擴(kuò)增，篩查山羊nucleophosmin基因外顯子1的堿基突變和缺失；

所述引物p1如下：

上游引物1f：5'-tgctggaaccaatagtagtc-3'；

下游引物1r：5'-gcctctgcaacaacaaca-3'；

所述引物p2如下：

上游引物2f：5'-gaagcagaggcgatgaat-3'；

下游引物2r：5'-ggaaccaagctaccacaa-3'；

所述引物p3如下：

上游引物3f：5'-aaaacaccacctgtggtcaaac-3'；

下游引物3r：5'-ctcaacaacctcatcaaaatcg-3'；

所述引物p4如下：

上游引物4f：5'-aagtggtagcaaggaacc-3'；

下游引物4r：5'-caacctggtcagtcatcc-3'。

所述的pcr擴(kuò)增的條件是：

25μl反應(yīng)體系，包括有：dna模板：50ng，2×taqmastermix：12.5μl，10μm的上下游引物：各0.5μl，加滅菌水至25μl；

所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：

引物p1～引物p4的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火溫度分別為：50℃、50℃、56℃、50℃，退火時(shí)間30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

2)根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對引物p3的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大小判定，發(fā)現(xiàn)引物p3擴(kuò)增位點(diǎn)存在18bp的堿基缺失；

3)采用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測引物p3擴(kuò)增的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對引物p3的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，以及與關(guān)中奶山羊和波爾山羊的生長性狀之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果如下：

純合型aa在233bp位缺失agacgatgatgctgatga共18個(gè)堿基，純合型aa在體重、體長指標(biāo)比雜合型ab有明顯優(yōu)勢。

本發(fā)明的利用核仁磷酸蛋白基因選擇山羊生長性狀的分子標(biāo)記方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下技術(shù)效果：

采取檢測山羊的核仁磷酸蛋白(nucleophosmin)基因外顯子1堿基突變多態(tài)性，并分析多態(tài)性與波爾山羊及其與關(guān)中奶山羊雜交的f1、f2代關(guān)系；結(jié)果表明：nucleophosmin基因外顯子1由引物p3檢測的snps位點(diǎn)可用作山羊生長性狀選擇的分子標(biāo)記：

明確了與山羊生長性狀相關(guān)的功能基因nucleophosmin基因外顯子1的1個(gè)snps，其中233bp位缺失18個(gè)堿基能夠作為一個(gè)分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計(jì)動(dòng)物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。

為nucleophosmin基因的snps與山羊生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于山羊生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的山羊種群。

附圖說明

圖1是利用引物p3擴(kuò)增nucleophosmin基因外顯子1的12％聚丙烯酰氨凝膠電泳圖，圖中m表示：marker；

圖2是nucleophosmin基因外顯子1測序圖，圖中i表示：aa基因型；ii表示：ab基因型。

以下通過對山羊樣本采集及基因組dna提取、檢測和濃度分析、山羊nucleophosmin基因外顯子1擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯凝膠電泳分析實(shí)施例來對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

具體實(shí)施方式

a、nucleophosmin基因外顯子1的pcr擴(kuò)增及其多態(tài)性的檢測

1、山羊血樣的采集及處理

取山羊血樣5ml，加入0.2μl的acd(檸檬酸2.4g，檸檬酸三鈉6.6g，葡萄糖7.35g，定容至50ml，高壓滅菌)抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本實(shí)施例采用3個(gè)山羊群體共計(jì)743只山羊血樣，具體為：波爾山羊血樣268份，關(guān)中奶山羊和波爾山羊的f1代血樣236份，關(guān)中奶山羊和波爾山羊的f2代血樣239份，均采自陜西麟游縣波爾山羊種羊場。

2、血樣基因組dna的提取、純化

(1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500μl至1.5ml的eppendorf管，加入等體積pbs緩沖液，充分混勻，12000r/min離心10min(4℃)，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。

(2)在離心管中加入dna抽提緩沖液500μl，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁，37℃水浴1h。

dna抽提緩沖液的配制為：0.6057g的tris、18.612g的edta和2.5g的sds加超純水500ml，滅菌，調(diào)ph至8.0，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)加入3μl(20mg/ml)的蛋白酶k并混勻，55℃過夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加1μl的蛋白酶k(20mg/ml)混勻，繼續(xù)消化至澄清。

(4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入tris-飽和酚500μl，溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充分混勻；4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中，重復(fù)一次。

(5)加入氯仿500μl，充分混勻20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中。

(6)加入0.1倍體積的naac緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直至白色的絮狀沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，用濃度為70％的冰冷乙醇漂洗dna沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。

(9)干燥后的dna溶于80μl～100μl的te-緩沖液或超純水，4℃保存直至dna完全溶解，用濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80℃保存。

(10)500μl的dna溶液中加入濃度為12％的sds使其終濃度為0.1％，加入蛋白酶k至終濃度達(dá)到50μg/ml。

(11)5℃保溫10h左右。

(12)用苯酚：氯仿：異戊醇＝25：24：1配制混合物和氯仿分別抽提一次，其中的苯酚：氯仿：異戊醇的混合物和氯仿等體積。

(13)12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中。

(14)加入1/10體積3mol/l醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀dna。

(15)倒掉液體，用濃度為70％乙醇洗滌后晾干，加入60μl滅菌超純水溶解，4℃待檢測。

3、dna池的構(gòu)建

(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測

選部分dna樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇dna樣品條帶均一、無拖尾、無降解的樣品進(jìn)行dna池的構(gòu)建。

(2)od值測定

用紫外光光度計(jì)測定dna樣品在260nm、280nm處的od值，并計(jì)算dna含量和od260/od280的比值。如od260/od280比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除rna純化。

dna濃度(μg/ml)＝50×od260值×稀釋倍數(shù)

(3)品種dna池的構(gòu)建

dna檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μl，然后從波爾山羊268個(gè)個(gè)體、濃度為50ng/μl的dna的樣品中取5μl混合構(gòu)建成dna池；按照同樣的方法構(gòu)建關(guān)中奶山羊和布爾山羊的f1代和f2代的dna池。

4、pcr擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

根據(jù)ncbi上genbank提供的山羊nucleophosmin基因的序列(登錄號：nc_007307)設(shè)計(jì)引物p1～引物p4，在pcr條件下擴(kuò)增外顯子1篩查山羊nucleophosmin基因p1～引物p4位點(diǎn)的突變。

引物p1如下：

上游引物1f：5'-tgctggaaccaatagtagtc-3'；

下游引物1r：5'-gcctctgcaacaacaaca-3'；

引物p2如下：

上游引物2f：5'-gaagcagaggcgatgaat-3'；

下游引物2r：5'-ggaaccaagctaccacaa-3'；

引物p3如下：

上游引物3f：5'-aaaacaccacctgtggtcaaac-3'；

下游引物3r：5'-ctcaacaacctcatcaaaatcg-3'；

引物p4如下：

上游引物4f：5'-aagtggtagcaaggaacc-3'；

下游引物4r：5'-caacctggtcagtcatcc-3'。

5、pcr擴(kuò)增山羊nucleophosmin基因外顯子1

分別以3個(gè)山羊群體的dna池為模版，以引物p1～引物p4進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)條件及程序如下所示：

所述的pcr擴(kuò)增的條件是：

25μl反應(yīng)體系，包括有：dna模板：50ng，2×taqmastermix：12.5μl，10μm的上下游引物：各0.5μl，加滅菌水至25μl；

所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：

引物p1～引物p4的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火溫度分別為：50℃、50℃、56℃、50℃，退火時(shí)間30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

6、山羊nucleophosmin基因外顯子1的1個(gè)snps的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

利用引物p3對3個(gè)山羊群體743份基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，在3個(gè)山羊群體中，獲得729個(gè)包含山羊nucleophosmin基因外顯子1的dna片段；然后利用如下方法對每個(gè)山羊的nucleophosmin基因外顯子1進(jìn)行基因分型，具體方法如下：

取引物p3的pcr產(chǎn)物各5μl，點(diǎn)樣于12％的非變性聚丙烯酰胺凝膠溶液中，電壓112v電泳1h，銀染后照相并分型(圖1)。銀染的方法如下：電泳完后，回收電泳液，取出凝膠放入托盤中，蒸餾水清洗2次后，加入200ml且濃度為0.1％的硝酸銀(agno3)溶液，避光輕搖染色10min～15min。倒掉agno3溶液，用去離子水清洗2次，然后將染色液倒入托盤中，輕搖10min～15min，直到呈現(xiàn)清晰的dna條帶，倒掉染色液，用去離子水清洗2次。

7、不同基因型個(gè)體pcr產(chǎn)物的測序驗(yàn)證

將利用引物p3擴(kuò)增的純合基因型和雜合基因型產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后與pmd^tm19-tvector載體連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入e.colijm109感受態(tài)細(xì)胞中，挑選10個(gè)陽性克隆送至上海生工進(jìn)行正反向測序)，測序結(jié)果如圖2所示。b、snp位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析

基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。paa＝naa/n，其中paa代表某一位點(diǎn)的aa基因型頻率；naa表示群體中具有aa基因型的個(gè)體數(shù)；n為檢測群體的總數(shù)量。

基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計(jì)算的公式可以寫成：pa＝(2naa+naa1+naa2+……+naan)/2n。式中，pa表示等位基因a頻率，naa表示群體中具有aa基因型的個(gè)體數(shù)量，naai表示群體中具有aai基因型個(gè)體數(shù)量，a1-an為等位基因a的n個(gè)不同的復(fù)等位基因；3個(gè)羊群體不同多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布、等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表1所示。

山羊nucleophosmin基因外顯子1(利用引物p3)snps的基因型分布、等位基因頻率和多態(tài)性分析如表1所示。

表1：3個(gè)山羊品種的nucleophosmin基因的遺傳結(jié)構(gòu)分析

c、山羊nucleophosmin基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析

生產(chǎn)數(shù)據(jù)：三個(gè)山羊群體的體重、體高、體長、胸圍的測定數(shù)據(jù)。

關(guān)聯(lián)分析樣本：有完整生長性狀記錄的波爾山羊268頭，關(guān)中奶山羊和波爾山羊的f1代236頭，關(guān)中奶山羊和波爾山羊的f2代239頭。

利用spss(13.0)軟件分析品種、年齡、場和基因位點(diǎn)等因素與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用t分析、anova或多元線性模型分析基因型效應(yīng)。

在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影生長性狀的因素不同，考慮到場效應(yīng)(farm)、品種效應(yīng)(breed)、種公畜效應(yīng)(s)、種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)(sd)、年齡(age)、基因型效應(yīng)(genotype)及相關(guān)的互作效應(yīng)，采用了以下固定模型進(jìn)行分析，同時(shí)，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行取舍。完整模型如下：

yijkmnpq＝μ+farmi+breedj+sp+sdq+agek+genotypem+xn+eijkmnpq

其中：yijkmnpq：個(gè)體表型記錄；μ：總體均值；farmi：場別效應(yīng)；breedj：品種效應(yīng)；sp：種公畜效應(yīng)；sdq：種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)；agek：年齡效應(yīng)；genotypem：標(biāo)記基因型效應(yīng)；xn為各種二級和二級以上互作效應(yīng),如：farm×breed，farm×age，farm×genotype，breed×age，breed×genotype，age×genotype，breed×age×genogype等；eijkmnpq：隨機(jī)誤差；運(yùn)用spss(13.0)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對各基因型間生長性狀指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。分析結(jié)果如表2所示。

表2：波爾山羊(bg)及其與關(guān)中奶山羊的f1代和f2代品種的nucleophosmin基因不同基因型與體重、體高、體長、胸圍的關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)對引物p3的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，以及與關(guān)中奶山羊和波爾山羊的生產(chǎn)性狀之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如下：

純合型aa在233bp位缺失agacgatgatgctgatga共18個(gè)堿基，純合型aa在體重、體長指標(biāo)比雜合型ab有明顯優(yōu)勢。

綜上所述，采用引物3擴(kuò)增的山羊nucleophosmin基因外顯子1與波爾山羊及其與關(guān)中奶山羊的f1代和f2的生長性狀顯著相關(guān)，波爾山羊及其與關(guān)中奶山羊雜交的f1代、f2純合基因型aa在體重、體長的生長性狀顯著高于雜合型基因型ab山羊(p<0.05)；因此，用引物p3檢測的snps位點(diǎn)可用作山羊生長性狀選擇的分子標(biāo)記。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>利用核仁磷酸蛋白基因選擇山羊生長性狀的分子標(biāo)記方法

<160>

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>引物p1的上游引物1f

<220>

<400>1

5'-tgctggaaccaatagtagtc-3'

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>引物p1的下游引物1r

<220>

<400>2

5'-gcctctgcaacaacaaca-3'；

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>引物p2的上游引物2f

<220>

<400>3

5'-gaagcagaggcgatgaat-3'

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>引物p2的下游引物2r

<220>

<400>4

5'-ggaaccaagctaccacaa-3'

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>引物p3的上游引物3f

<220>

<400>5

5'-aaaacaccacctgtggtcaaac-3'

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>引物p3的下游引物3r

<220>

<400>6

5'-ctcaacaacctcatcaaaatcg-3'

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>引物p4的上游引物4f

<220>

<400>7

5'-aagtggtagcaaggaacc-3'

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>引物p4的下游引物4r

<220>

<400>8

5'-caacctggtcagtcatcc-3'