本發(fā)明涉及一種組織工程用填充水凝膠材料的制備方法，具體涉及基于球蛋白的新型多孔水凝膠材料的制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，面部填充和組織填充材料的發(fā)展非常迅速，其中可分為惰性材料和非惰性材料，惰性材料由于毒性大、生物相容性差，限制了其應(yīng)用范圍，而非惰性材料植入皮下后往往易降解，這就使得患者需經(jīng)多次填充才能達到修復(fù)的效果，不但給患者帶來了疼痛，也給患者造成了不必要的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。對皮膚填充劑和組織修復(fù)材料而言，降解性能是其中一項重要指標(biāo)。本發(fā)明為了克服傳統(tǒng)凝膠易降解的缺點，急需制備出了一種可用于組織填充的惰性生物多孔水凝膠，其不但可以作為永久填充材料，而且具有良好的生物相容性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種以球蛋白作為主要原料的惰性組織工程用填充凝膠材料的制備方法，該方法制備工藝簡單，凝膠材料的生物相容性良好，有望用于永久性整容整形及缺損性組織修復(fù)。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種用于組織填充的惰性多孔水凝膠的制備方法：在水溶性球形蛋白溶液中加入質(zhì)量比為1:3-3:1的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷水溶液以及無機鹽水溶液混合均勻，調(diào)節(jié)溶液ph值為2-5.5，置于水浴環(huán)境中進行交聯(lián)反應(yīng)得含鹽水凝膠，然后對交聯(lián)后凝膠進行兩次高壓蒸汽處理和蒸餾水浸泡洗滌，除去無機鹽和殘留的單體交聯(lián)劑，并進行真空冷凍干燥和co-60滅菌處理，即獲得可用于組織填充的惰性多孔水凝膠。

上述的水溶性球形蛋白選自牛血清白蛋白（bsa）和人血清白蛋白（hsa），其濃度為50-400mg/ml。

所述的無機鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、磷酸氫鈉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硫酸鉀、氯化鉀，其濃度為10-350mg/ml，加入體積與水溶性球形蛋白溶液體積的比為1:2~1:20。

所述交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物溶液和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷溶液的質(zhì)量百分比濃度均為0.1-5.0%，優(yōu)選0.5-2.0%，體積均為蛋白溶液體積的1-20%，優(yōu)選5-10%。

反應(yīng)液酸堿度用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)控其ph值為2-5.5；交聯(lián)反應(yīng)的溫度可為40-80℃，保持時間0.5-5h，優(yōu)選1-3h。

上述兩次高壓蒸汽處理和蒸餾水浸泡洗滌中，第一次將樣品在110-121℃下保持時間5-30min，優(yōu)選保持時間10-20min，然后超純水浸泡洗滌2-5天；第二次將樣品在110-121℃保持1-3h，優(yōu)選保持時間1.5-2.5h，然后超純水浸泡洗滌1-3天，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g。

上述交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物依據(jù)文獻（catalyticreactionsinvolvingc1feedstocks:newhigh-activityzn(ii)-basedcatalystsforthealternatingcopolymerizationofcarbondioxideandepoxides,j.am.chem.soc.1998,120,11018-11019.）的方法合成獲得，其分子式如圖1所示。

本發(fā)明惰性多孔水凝膠的形成機理：蛋白質(zhì)分子含有豐富的羧基和氨基，為分子間交聯(lián)提供了兩種好的功能基團。β-二亞胺鋅配合物分子內(nèi)螯合鋅的空軌道可與蛋白分子中的氨基形成配位鍵，實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分子間交聯(lián)。β-二亞胺鋅配合物對環(huán)氧烷基具有不對稱開環(huán)催化功能，可加速1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的分子兩端環(huán)氧烷基開環(huán)并與蛋白分子中的羧基形成共價鍵，實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分子間交聯(lián)。故通過β-二亞胺鋅配合物對1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的開環(huán)催化，及兩種交聯(lián)劑對蛋白質(zhì)的分子間不同基團間的雙交聯(lián)作用，有效實現(xiàn)和強化了水溶性蛋白分子間的交聯(lián)。無機鹽的加入，有效地破壞了蛋白質(zhì)的分子外水化膜，促進了交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)反應(yīng)，此外適量無機鹽還兼扮演了成孔劑作用，進一步優(yōu)化了水凝膠的成孔效果。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

第一，采用無毒性的球蛋白作為原料，制備出了一種長效性的可用于組織填充的惰性多孔水凝膠；

第二，制備工藝上采用雙功效交聯(lián)劑不僅實現(xiàn)了多功能基團的共交聯(lián)，交聯(lián)劑間還有相互促進功效；無機鹽的使用進一步強化了分子交聯(lián)反應(yīng)，并促進多孔的形成；

第三，本發(fā)明采用高溫?zé)嶙冃苑ǎ?10-121℃）和真空冷凍干燥法，保障了凝膠材料的性能和形狀，且滿足臨床上不同的需要；

第四，生物相容性好，與細胞有較好的粘附性，利于細胞的代謝增殖與分化。

附圖說明

圖1為β-二亞胺鋅配合物的分子結(jié)構(gòu)圖；

圖2為實施例1中采用不同的模具制備的不同形狀的凝膠圖；

圖3為實施例1所制備的多孔水凝膠的sem圖；

圖4為實施例1所制備的凝膠樣品的應(yīng)變-應(yīng)力曲線圖；

圖5為實施例1所制備的凝膠浸提液對細胞的毒性結(jié)果圖；

圖6為實施例1所制備的凝膠與細胞共培養(yǎng)sem圖；

圖7為實施例1所制備的凝膠植入皮下實驗圖及從皮下取出后的sem分析圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1水凝膠的制備

步驟一：將一定量bsa溶于10ml蒸餾水得到濃度為100mg/ml的溶液，加入濃度均為1%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各2ml，再加入10mg/ml的nacl溶液2ml，混合均勻，并用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液ph為4；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在50℃環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于121℃保持20min獲得凝膠初品；

步驟三：將步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留單體交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)121℃保持2h后，再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，除去殘留交聯(lián)劑，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品；

步驟四：將步驟三中的濕凝膠進行真空冷凍干燥處理，并以≥25kgy的照射劑量進行co-60輻照滅菌，即得可用于組織填充的惰性多孔水凝膠。

本實例制備的凝膠填充材料可以根據(jù)不同的需要制備成不同的形狀，只需要相應(yīng)的模具即可，如圖2為采用不同的模具制備的不同形狀的凝膠圖。圖3為實施例1所制備的多孔水凝膠的sem圖，可見水凝膠的微觀形貌為多孔結(jié)構(gòu)，孔壁為球形顆粒相互粘連而成，孔徑一般在幾十納米到幾個微米不等，孔結(jié)構(gòu)較為均勻且致密貫通。圖4為本實例中制備的凝膠樣品的機械性能測試結(jié)果，在壓縮應(yīng)變?yōu)?0%的條件下，壓縮應(yīng)力可達3-6mpa,而普通水凝膠同等條件下一般僅為幾十到幾百kpa，這說明本發(fā)明制備的樣品具有良好的彈性性能，適合用于缺損組織填充。

實施例2水凝膠的制備

步驟一：將一定量bsa溶于10ml蒸餾水得到濃度為200mg/ml的溶液，加入濃度均為2%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各2ml，再加入50mg/ml的kcl溶液4ml，混合均勻，并用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液ph為2.8；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在60℃環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于110℃保持20min獲得凝膠初品；

步驟三：將步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留單體交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)121℃保持2h后，再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，除去殘留交聯(lián)劑，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品；

步驟四：將步驟三中的濕凝膠進行真空冷凍干燥處理，并以≥25kgy的照射劑量進行co-60輻照滅菌，即得可用于組織填充的惰性多孔水凝膠。

該實施例中所得的多孔水溶膠與實施例1中所得多孔水溶膠理化性能相似。

實施例3水凝膠的制備

步驟一：將一定量hsa溶于10ml蒸餾水得到濃度為400mg/ml的溶液，加入濃度均為2%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各4ml，再加入100mg/ml的nacl溶液2ml，混合均勻，并用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液ph為5；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在70℃環(huán)境下保持1h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于121℃保持10min獲得凝膠初品；

步驟三：將步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留單體交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)121℃保持1.5h后，再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，除去殘留交聯(lián)劑，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品；

步驟四：將步驟三中的濕凝膠進行真空冷凍干燥處理，并以≥25kgy的照射劑量進行co-60輻照滅菌，即得可用于組織填充的惰性多孔水凝膠。

該實施例中所得的多孔水溶膠與實施例1中所得的多孔水溶膠理化性能相似。

實施例4水凝膠生物的細胞毒性檢測

步驟一：實施例1惰性多孔水凝膠經(jīng)鈷60輻射滅菌后，向樣品中加入15mlα-mem完全培養(yǎng)液，37℃恒溫箱中浸提72h，制得0.1g/ml的材料浸提液；

步驟二：取96孔板，設(shè)置空白對照組及試驗組，每組設(shè)6孔做水平對照，于每孔中加入100μl濃度為1×10⁶/ml的mc3t3-e1細胞懸浮液，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后，吸棄原培養(yǎng)液，空白對照組加入新鮮培養(yǎng)液，實驗組加入步驟一所得的材料浸提液，每孔100μl，置于二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。期間更換一次培養(yǎng)液，72h后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；

步驟三：對步驟二中的孔板的每孔加入cck-8溶液20μl，在37℃下二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4h，之后取出，使用酶標(biāo)儀于450nm處測定吸光值。

圖5為實施例1所制備的凝膠浸提液對細胞的毒性實驗圖。從5圖可以看出，當(dāng)細胞用浸提液培養(yǎng)24h時，對照組細胞活性可達到90%而實驗組細胞活性約為80%（對照組和實驗組毒性等級均為1級（分級標(biāo)準(zhǔn)參考表1細胞相對增殖率與細胞毒性評分標(biāo)準(zhǔn)）），但當(dāng)培養(yǎng)48h和72h后，實驗組和對照組的細胞活性均可達到100%（毒性等級1級），這說明本發(fā)明制備的凝膠細胞相容性良好，細胞活性在24h時之所以較低，可能是因為細胞對凝膠的浸提液有一個適應(yīng)的過程，一旦適應(yīng)了之后，細胞就可實驗快速的生長增殖。

實施例5水凝膠與細胞共培養(yǎng)

步驟一：將實施例1惰性多孔水凝膠，用刀片切成底面直徑為10mm，高約為3mm的小圓片，之后將其放入48孔板中，封口，進行鈷60輻射滅菌；

步驟二：將步驟一中滅菌后的樣品材料帶入生物安全柜，于每孔內(nèi)加入1mlα-mem完全培養(yǎng)液，放入co2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置24h，使培養(yǎng)液浸透整個支架材料，吸棄培養(yǎng)液；

步驟三：吸取備好的濃度為1×10⁶/ml，體積為50μl的mc3t3-e1細胞懸浮液輕輕的加在步驟二中預(yù)浸泡的48孔板中樣品材料的表面，之后將孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待4h后，每個樣品補加1ml的mem培養(yǎng)液，此后每天換液，待樣品與細胞共培養(yǎng)一定時間后，取出做實驗分析。

圖6為凝膠材料上種植細胞24h、36h和48h后細胞的生長情況圖。經(jīng)過24h后細胞已經(jīng)貼附生長在材料表面，36h和48h后細胞在材料表面快速生長增殖，48h已經(jīng)完全覆蓋在材料表面。這說明本發(fā)明制備的凝膠材料有良好的細胞相容性，適合細胞在凝膠材料上生長增殖代謝。

實施例6水凝膠的皮下植入實驗

步驟一：將實施例1惰性多孔水凝膠，用刀片切成底面直徑為10mm，高約為2mm的小圓片，密封，進行鈷60輻射滅菌；

步驟二：使用速眠新麻醉劑對新西蘭兔耳靜脈注射，使其麻醉，之后將其固定于手術(shù)臺上，無菌紗布覆蓋兔子背部裸露皮膚外其他部位，經(jīng)安爾碘消毒后，觀察兔子背部的毛細血管(注意避開毛細血管進行切口)，在合適位置輕輕的用手夾起兔子皮膚，然后使用手術(shù)刀片輕輕的劃開一個長約10mm的小口，用鑷子夾起準(zhǔn)備好的樣品支架材料，輕輕放入皮下，盡可能使植入的材料離切口處的距離大于5mm，之后用皮針縫合傷口，安爾碘再次消毒。之后，每天觀察兔子的運動進食等情況，觀察兔子的背部是否有紅腫、化膿等現(xiàn)象；

步驟三：對步驟二中實驗兔飼養(yǎng)了2、8、20和40周后，通過注射過量麻醉劑的方法分別處死，取其背部材料及周圍皮膚，檢測材料的炎癥反應(yīng)和降解情況。

圖7為凝膠材料上植入兔子皮下2周、8周、20周和40周的材料及材料周圍組織圖，其中分別展示了樣品植入兔子皮下2周和40周，取出樣品后所拍攝的掃描電鏡圖。當(dāng)凝膠植入兔子皮下2周后，發(fā)現(xiàn)材料周圍已經(jīng)有新血管生成，皮下植入的材料經(jīng)過40周后基本無明顯的降解現(xiàn)象，且未發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥或排異現(xiàn)象。這表明凝膠作為填充材料植入皮下后與體內(nèi)組織有良好的生物相容性，且很難被降解，不會與組織產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。通過材料植入后的sem圖（圖7中）與植入前的sem圖比較可知，凝膠材料植入皮下40周內(nèi)部結(jié)構(gòu)也未發(fā)生變化，進一步說明本發(fā)明制備的凝膠可作為體內(nèi)的永久填充材料。

實施例7不同交聯(lián)方式制備多孔水凝膠的對比實驗

步驟一：重復(fù)實施實例1實驗過程，僅將反應(yīng)中的兩種交聯(lián)劑改為一種交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物，所制備的水凝膠質(zhì)地柔軟，通過力學(xué)性質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)其彈性模量約595pa，不再具備實施實例1中水凝膠所具備的良好的力學(xué)性能，其吸水溶脹性能和可復(fù)原性能大大減弱，降解時間大幅縮短；

步驟二：重復(fù)實施實例1實驗過程，僅將反應(yīng)中的兩種交聯(lián)劑改為一種交聯(lián)劑1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷，獲得的水凝膠抗壓強度較小，其彈性模量約為698kpa，降解時間較短。

上述實驗表明，僅改變復(fù)合交聯(lián)劑為其中的任意一種，所得到的水凝膠不再具有原來的優(yōu)異機械力學(xué)特性和耐降解能力，說明實施實例1中的交聯(lián)實驗方案具有好的創(chuàng)新性。