本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病包括缺血性腦病、出血性腦病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病等，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，提高這類疾病的生存率，降低致殘率，最大限度地提高患者的生活質(zhì)量，是防治此類疾病的首要任務(wù)。由于神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使得神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的治療有了新的研究方向，神經(jīng)干細(xì)胞也成為了生物醫(yī)學(xué)工程以及體外模型研究中所必須的種子細(xì)胞。

神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，nscs)是具有分化為神經(jīng)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新，并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞群，是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，它可以通過(guò)不對(duì)等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞，包括神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。1992年神經(jīng)干細(xì)胞自成年動(dòng)物腦紋狀體內(nèi)第一次被發(fā)現(xiàn)，從而打破了認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞不能再生的傳統(tǒng)理論。根據(jù)分化潛能及產(chǎn)生子細(xì)胞種類神經(jīng)干細(xì)胞可分為如下幾類：

(1)神經(jīng)管上皮細(xì)胞：分裂能力最強(qiáng)，只存茌胚胎時(shí)期，可以產(chǎn)生放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)母細(xì)胞。

(2)放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元：可以分裂產(chǎn)生本身并同時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或是膠質(zhì)細(xì)胞，主要作用是幼年時(shí)期神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生投射神經(jīng)元完成大腦中皮質(zhì)及神經(jīng)核等的基本神經(jīng)組織細(xì)胞。

(3)神經(jīng)母細(xì)胞：成年人體中主要存在的神經(jīng)干細(xì)胞，分裂能力可以產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元和各類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

(4)神經(jīng)前體細(xì)胞：各類神經(jīng)細(xì)胞的前體細(xì)胞，比如小膠質(zhì)細(xì)胞是由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體產(chǎn)生的。

神經(jīng)干細(xì)胞作為生物醫(yī)學(xué)工程以及體外模型研究中的種子細(xì)胞，需要將其在體外進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，而如何在體外大規(guī)模培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞便成為了醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)?，F(xiàn)有的培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的常用培養(yǎng)基為gibco的含1~6827的neurobasal培養(yǎng)基，使用明膠預(yù)處理過(guò)的培養(yǎng)瓶進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。但經(jīng)過(guò)該培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力較弱。因此急需提供一種可增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的培養(yǎng)基。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠大大增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)能夠使得神經(jīng)干細(xì)胞在不用明膠預(yù)鋪板的惰況下貼壁生長(zhǎng)，免除了繁瑣的操作步驟簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括dmem/f12、非必需氨基酸、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素、氫化可的松、wnt3a、notchl和牛血清白蛋白。其中含有10～20umol/ml非必需氨基酸、10～20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、5～15ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10～20ug/ml胰島素、40～60nmol/l氫化可的松、10～20nmol/lwnt3a、40～60nmol/lnotchl、40～60ug/ml牛血清白蛋白。

作為優(yōu)選，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基還包括纖連蛋白和四型膠原蛋白。

更進(jìn)一步的優(yōu)選是：神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有10～20umol/ml非必需氨基酸、10～20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、5～15ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10～20ug／ml胰島素、40～60nmol/l氫化可的松、10～20nmol/lwnt3a、40～60nmol/lnotchl、40～60ug/ml牛血

清白蛋白、15～35ng/ml纖連蛋白、50～70ng/ml四型膠原蛋白。

其中，非必需氨基酸為谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、笠氨酸或酪氨酸中的一種或兩者以上的混合物。

本發(fā)明至少具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠大大增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力。流式檢測(cè)結(jié)果顯示，本發(fā)明培養(yǎng)基能夠使p6代的神經(jīng)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物nestin+cd133+的比例能夠達(dá)到33.3%，而傳統(tǒng)培養(yǎng)基在p6代的nestin+cd133+的比例僅為9.8%；本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在3～6天時(shí)具有明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖較快，而采用傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，無(wú)明顯對(duì)數(shù)增殖；

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)基的制備，本發(fā)明提供的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基所用試劑、儀器、試驗(yàn)動(dòng)物等均可由市場(chǎng)購(gòu)得。其中，wnt3a購(gòu)自上海華騅思創(chuàng)，notchl購(gòu)自武漢福來(lái)生物；非必需氨基酸購(gòu)自gibco，貨號(hào)為11140，memnon-essentiaaminoacidssolutionlomm(100x)等等。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例：

培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)液配方成分為：dmem/f12、10umol/ml非必需氨基酸、15ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、15ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10ug/ml胰島素、50nmol/l氫化可的松、20nmol/lwnt3a、40nmol/lnotchl、50ug／ml牛血清白蛋白、35ng／ml纖連蛋白、50ng/ml四型膠原蛋白。培養(yǎng)基制備方法為：使用時(shí)按照規(guī)定量將所有成分混合均勻。

培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞實(shí)例

出生1～4天的新生小鼠，脫頸處死后取新生小鼠大腦，剝?nèi)ツX膜后用4。cpbs清洗2次，加入2ml神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液（試驗(yàn)組1采用實(shí)施例1培養(yǎng)基，試驗(yàn)組2采用實(shí)施例2培養(yǎng)基，試驗(yàn)組3采用實(shí)施例3培養(yǎng)基），并用手術(shù)剪將大腦剪碎，接著用iml手動(dòng)移液器

將碎片吹散成混懸液，然后調(diào)整細(xì)胞密度到5×l04/ml。將混懸液加入6孔板，每孔2ml在5%co，、37。c培養(yǎng)箱中放置2小時(shí)，2小時(shí)后吸取6孔板中的上清液，加入另一個(gè)6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，原6孔板棄去不要。培養(yǎng)24小時(shí)后棄去6孔板中的上清液，每孔加入2ml神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，之后每2～3天換液一次。直到細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)倒去培養(yǎng)基并用含0.04v／v%edta的濃度為0.25v/v%的胰蛋白酶消化細(xì)胞1分鐘，使其脫落，然后用各組所用培養(yǎng)基按照加入胰酶體積的5倍終止消化；離心后去除上清液，將沉淀細(xì)胞用各組所用培養(yǎng)基重懸，按照5×l04/ml的蜜度加入培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記為pl代細(xì)胞。重復(fù)傳代至p6代。

將上述各組培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，神經(jīng)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物nestin+、cd133+的比例能夠達(dá)到33.3%、29.5%、24.3%，而傳統(tǒng)培養(yǎng)基在p6代的nestin+、cd133+的比例僅為9.8%。

一般增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞，生長(zhǎng)曲線會(huì)呈“s”型，可分為3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期：第一階段為適應(yīng)期，細(xì)胞增殖較慢：第二階段為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖速度變快，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；第三階段為平臺(tái)期，細(xì)胞增殖減緩。根據(jù)神經(jīng)干細(xì)胞p6代七天的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，可看到0～2天為適應(yīng)期，3～6天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖較快，第7天細(xì)胞增殖變慢，進(jìn)入了平臺(tái)期。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖可知，該細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)。而采用傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，無(wú)明顯對(duì)數(shù)增殖。可見，本發(fā)明提供的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠大大增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力。

同時(shí)本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠使得神經(jīng)干細(xì)胞在不用明膠預(yù)鋪板的情況下貼壁生長(zhǎng)，免除了繁瑣的操作步驟簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程。