本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一株防病促生的白黑鏈霉菌及其代謝產(chǎn)物的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由半知菌亞門真菌灰葡萄孢(botrytiscinera)侵染所致的灰霉病在多種果蔬作物栽培中發(fā)生普遍且嚴(yán)重。該病害可危害植物的莖、葉、花和果實(shí)，在潮濕多雨及溫室大棚環(huán)境中發(fā)生尤為嚴(yán)重。我國(guó)果蔬灰霉病的防治目前主要依靠化學(xué)藥劑，但是長(zhǎng)期大量使用化學(xué)藥劑存在農(nóng)藥殘留、病原菌容易產(chǎn)生抗藥性以及環(huán)境污染等問題。探索新型高效、廣譜、低毒、環(huán)保的植物病害防治技術(shù)是當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。生物防治具有安全無污染、病原菌不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，是果蔬病害綠色防控的有效途徑。國(guó)內(nèi)外目前已有關(guān)于枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、多粘芽孢桿菌(bacilluspolymyxa)、木霉菌(trichodermaspp.)等微生物對(duì)果蔬作物灰霉病防治效果的研究。由于灰霉病病原菌種內(nèi)變異大，病害發(fā)生后傳播速度快、有效防治困難，合理開發(fā)現(xiàn)有微生物資源，創(chuàng)制新型生防制劑、增添微生物農(nóng)藥種類，對(duì)于果蔬病害綠色防控和無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)具有重要意義。放線菌(actinomycete)廣泛存在于土壤、海洋等不同的自然生態(tài)環(huán)境中，具有種類繁多、代謝功能各異等特點(diǎn)，是一類具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的微生物種群。從微生物中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)中有70％來自放線菌，其中約50％是鏈霉菌屬的代謝產(chǎn)物。篩選具有拮抗植物病原真菌活性的放線菌資源，開發(fā)可逐步替代化學(xué)農(nóng)藥的新型微生物農(nóng)藥產(chǎn)品對(duì)于果蔬作物灰霉病綠色防控具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何抑制果蔬作物病原菌并促進(jìn)果蔬作物生長(zhǎng)。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一株白黑鏈霉菌。本發(fā)明所提供的白黑鏈霉菌，是菌株號(hào)為t22的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為cgmccno.14190。下文簡(jiǎn)稱白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22具有序列表中序列1所示的16srdna序列，白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上氣生菌絲白色，無可溶性色素或日久產(chǎn)生淡黃色色素(圖1)。顯微鏡下可觀察到白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22氣生菌絲直至柔曲，孢子成鏈，卵圓形(圖2)。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的培養(yǎng)物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的培養(yǎng)物是將白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22在微生物液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的物質(zhì)。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了病原菌抑制劑。本發(fā)明所提供的病原菌抑制劑，含有白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的代謝物。上述病原菌抑制劑的活性成分可為白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的代謝物，上述病原菌抑制劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，上述病原菌抑制劑的其他活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)對(duì)病原菌的抑制效果確定。上述病原菌抑制劑中，所述病原菌抑制劑可對(duì)下述至少一種病原菌具有抑制作用：a、灰霉病菌；b、核果褐腐病菌；c、辣椒炭疽病菌；d、枯萎病菌；e、馬鈴薯早疫病菌；f、小麥紋枯病菌；g、茄子青枯病菌；h、黃瓜角斑病菌。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了病害抑制劑。本發(fā)明所提供的病害抑制劑，含有白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的代謝物。上述病害抑制劑的活性成分可為白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的代謝物，上述病害抑制劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，上述病害抑制劑的其他活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)對(duì)病害的抑制效果確定。上述病害抑制劑中，所述病害為下述至少一種：a、灰霉?。籦、核果褐腐??；c、辣椒炭疽病；d、枯萎?。籩、馬鈴薯早疫病；f、小麥紋枯?。籫、茄子青枯病；h、黃瓜角斑病。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的代謝物的下述任一種應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：1)在抑制病原菌中的應(yīng)用；2)在制備病原菌抑制劑中的應(yīng)用；3)在抑制病害中的應(yīng)用；4)在制備病害抑制劑中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述病原菌可為下述至少一種：a、灰霉病菌；b、核果褐腐病菌；c、辣椒炭疽病菌；d、枯萎病菌；e、馬鈴薯早疫病菌；f、小麥紋枯病菌；g、茄子青枯病菌；h、黃瓜角斑病菌。所述病害可為下述至少一種：a、灰霉??；b、核果褐腐??；c、辣椒炭疽??；d、枯萎?。籩、馬鈴薯早疫??；f、小麥紋枯??；g、茄子青枯?。籬、黃瓜角斑病。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22和/或白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的代謝物的下述任一種應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：h、在促進(jìn)植物種子萌發(fā)中的應(yīng)用；i、在促進(jìn)植物種子胚軸和/或胚根生長(zhǎng)中的應(yīng)用；j在提高植物種子發(fā)芽勢(shì)中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述植物可為下述任一種植物：p1)番茄；p2)番茄屬植物；p3)茄科植物。上文中，白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的代謝物可從白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的發(fā)酵液中獲得。所述白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的代謝物可為白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的無菌代謝物。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的無菌代謝物(無菌發(fā)酵濾液)具體可按照如下方法制備：在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22，過濾除去液體培養(yǎng)物(發(fā)酵液)中的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22即得到白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的無菌代謝物。本申請(qǐng)中，所述灰霉病菌可為番茄灰霉病菌、葡萄灰霉病菌和/或草莓灰霉病菌；所述核果褐腐病菌可為桃褐腐病菌；所述枯萎病菌可為黃瓜枯萎病菌、甘藍(lán)枯萎病菌和/或棉花枯萎病菌。所述灰霉病可為番茄灰霉病、葡萄灰霉病和/或草莓灰霉病，所述核果褐腐病可為桃褐腐?。凰隹菸】蔀辄S瓜枯萎病、甘藍(lán)枯萎病和/或棉花枯萎病。上文中，所述病原菌抑制劑和病害抑制劑中，除所述活性成分外，還含有載體。所述載體可為農(nóng)藥領(lǐng)域常用的且在生物學(xué)上是惰性的載體。所述載體可為固體載體或液體載體；所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液體載體可為有機(jī)溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機(jī)溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述病原菌抑制劑和病害抑制劑中，白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22可以孢子、菌絲或含有孢子和/或菌絲的培養(yǎng)物的形式存在。所述病原菌抑制劑和病害抑制劑的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。根據(jù)需要，所述病原菌抑制劑和病害抑制劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩(wěn)定劑(如抗氧化劑)、ph調(diào)節(jié)劑等。本發(fā)明以果蔬病害病原真菌為靶標(biāo)，從青藏高原特殊生境土壤中分離篩選獲得一株兼具防病促生作用的微生物菌種-白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22，對(duì)包括灰霉病菌在內(nèi)的多種植物病原真菌具有良好的廣譜拮抗活性，其無菌發(fā)酵濾液能夠有效促進(jìn)番茄種子發(fā)芽，并對(duì)番茄灰霉病具有良好的離體防效，因此可應(yīng)用于果蔬真菌病害尤其是灰霉病的綠色防控，為制備微生物農(nóng)藥新產(chǎn)品提供新資源。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22對(duì)果蔬作物灰霉病菌、桃褐腐病菌及辣椒炭疽病菌等均具有抑制作用(表3，圖4)。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液能夠有效抑制草莓灰霉病菌、番茄灰霉病菌及黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)(圖5)。同時(shí)白黑鏈霉菌t22能夠通過產(chǎn)生纖維素酶和幾丁質(zhì)酶在產(chǎn)酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基上形成水解圈(圖6)。說明白黑鏈霉菌t22能夠通過產(chǎn)生抗生素類活性物質(zhì)和水解酶類物質(zhì)抑制植物病原真菌。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液適當(dāng)稀釋后可顯著促進(jìn)番茄胚軸和/或胚根伸長(zhǎng)，增強(qiáng)番茄種子發(fā)芽勢(shì)。與對(duì)照相比，白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液顯著增加了番茄胚軸、胚根長(zhǎng)度，提高了番茄種子發(fā)芽勢(shì)，增幅分別高達(dá)15.1％、29.7％和43.9％；白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液200倍稀釋液處理的番茄種子，其胚軸、胚根長(zhǎng)度和種子發(fā)芽勢(shì)較對(duì)照增加了8.8％、18.1％和32.3％(表4)。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌代謝物(無菌發(fā)酵濾液)噴施處理番茄離體葉片能夠明顯降低番茄灰霉病病斑直徑，白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌代謝物(無菌發(fā)酵濾液)處理對(duì)番茄灰霉病離體防效達(dá)到55.1％(表5)。說明白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液噴施處理對(duì)番茄離體葉片灰霉病具有良好的防治效果(圖7)。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22能夠人工培養(yǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、產(chǎn)孢良好，制成生防菌劑適于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。保藏說明菌種名稱：白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)菌株編號(hào)：t22保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：cgmcc地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)保藏日期：2017年05月25日保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：cgmccno.14190附圖說明圖1為菌株t22在高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。圖2為菌株t22在40倍光學(xué)顯微鏡下的菌絲和孢子形態(tài)。圖3為基于菌株t2216srdna序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中菌株t22與白黑鏈霉菌streptomycesalboniger菌株(nr043228、ab184331)聚在同一分支上，相似性達(dá)99％。圖4為菌株t22對(duì)病原真菌的平皿拮抗效果，其中a、b、c分別為菌株t22對(duì)番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、辣椒炭疽病菌的抑制作用。圖5為菌株t22無菌發(fā)酵濾液對(duì)植物病原真菌的抑制作用，a、c、e分別為未加入菌株t22無菌發(fā)酵液pda培養(yǎng)基上黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌菌落，b、d、f分別為加入菌株t22無菌發(fā)酵濾液pda培養(yǎng)基上黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌菌落。圖6為菌株t22產(chǎn)纖維素酶和幾丁質(zhì)酶情況，a、b分別為菌株t22在纖維素剛果紅培養(yǎng)基和膠體幾丁質(zhì)剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈。圖7為菌株t22無菌發(fā)酵濾液對(duì)番茄灰霉病的離體防效其中，a、b未接種液體培養(yǎng)基噴施+灰霉病菌，c、d菌株t22無菌發(fā)酵濾液噴施+灰霉病菌，e、f50％咯菌腈1000倍液噴施+灰霉病菌。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用到的病原菌公眾可從野外采集，也可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)：番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、黃瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、桃褐腐病菌(moniliniafructicola)、辣椒炭疽病菌(colletotrichumcapsici)、棉花枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、甘蘭枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.conglutinans)、小麥紋枯病菌(rhizoctoniacereali)、串珠鐮刀病菌(fusariummoniliforme)、茄子青枯病菌(ralstoniasolanacearum)、大白菜黑腐病菌(xanthomonascampestrispv.campsetris)(王俊麗等.一株芽孢桿菌qd-10的鑒定及生防特性分析.中國(guó)生物防治學(xué)報(bào),2014,30(4):564-572.)。馬鈴薯早疫病菌(alternariaalternata)(zheng,etal.characterizationofalternariaspeciesassociatedwithpotatofoliardiseasesinchina.plantpathology,2015,64:425-433.)。草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)、葡萄灰霉病菌(botrytiscinerea)、黃瓜角斑病菌(pseudomonassyringaepv.lachrymans)(盧彩鴿等.一株甘蘭枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定及其抑菌活性測(cè)定.華北農(nóng)學(xué)報(bào),2014,29(1):195-202.)。實(shí)施例1、白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的分離與鑒定1.1菌株分離該菌株從中國(guó)青海省青藏高原特殊生境土樣中分離獲得。菌株采用稀釋平板法分離，具體操作方法如下：稱取土壤樣品10g，倒入裝有小玻璃珠和90ml無菌水的三角瓶中，振蕩30min后靜置5min，依次稀釋10倍，分別配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的懸浮液，吸取不同濃度的懸浮液各0.1ml加到高氏一號(hào)培養(yǎng)基(加入終濃度為75mg/l的k2cro7)平板上，均勻涂布后置于28℃培養(yǎng)觀察，5-7天后挑取不同的單菌落劃線純化。將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆?。取編?hào)為t22的菌株(簡(jiǎn)稱菌株t22)進(jìn)行下述鑒定。1.2菌株鑒定1.2.1菌株形態(tài)觀察將菌株t22接種于《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》推薦的培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7-10d觀察菌株生長(zhǎng)情況，記錄氣生菌絲的顏色、基內(nèi)菌絲的顏色以及可溶性色素的有無及顏色。將菌株t22劃線接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，以45度角斜插入無菌蓋玻片，28℃培養(yǎng)7d后，取出蓋玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征。菌株t22在高氏一號(hào)瓊脂、葡萄糖天門冬素瓊脂、馬鈴薯瓊脂、酵母膏麥芽膏瓊脂、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，氣生菌絲白色；在蔗糖硝酸鹽瓊脂、無機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基上氣生菌絲白色至淡橄欖軟皮黃色、淡綠灰黃色。菌株t22在高氏一號(hào)瓊脂、蔗糖硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基上無可溶性色素，在葡萄糖天門冬素瓊脂、馬鈴薯瓊脂、酵母膏麥芽膏瓊脂、燕麥粉瓊脂、無機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基上可溶性色素暗黃色至黑色(表1)。顯微鏡下可以觀察到菌株t22氣生菌絲直至柔曲，孢子成鏈，卵圓形(圖2)。根據(jù)以上形態(tài)特征將t22初步鑒定為鏈霉菌屬(streptomycessp.)。其中高氏一號(hào)瓊脂：可溶性淀粉20.0g，nacl0.5g，kno31.0g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，feso40.02g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml，ph7.2-7.4，121℃滅菌30min。蔗糖硝酸鹽瓊脂：蔗糖50.0g，kno30.2g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml，ph7.2，121℃滅菌30min。葡萄糖天門冬素瓊脂：葡萄糖10.0g，天門冬素0.5g，牛肉膏2.0g，k2hpo40.5g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml，ph7.2，121℃滅菌30min。馬鈴薯瓊脂：馬鈴薯浸汁200ml，蔗糖20.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml，ph7.2-7.4，121℃滅菌30min。酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基(isp2)：酵母膏4.0g，麥芽膏10.0g，葡萄糖4.0g，微量鹽溶液1.0ml，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml，ph7.2，121℃滅菌30min。燕麥粉瓊脂(isp3)：燕麥片20.0g(加水1000ml煮沸20min后過濾并補(bǔ)水至1000ml)，微量鹽溶液1.0ml，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml，ph7.2，121℃滅菌30min。無機(jī)鹽淀粉瓊脂(isp4)：可溶性淀粉10.0g，k2hpo42.0g，mgso4·7h2o1.0g，(nh4)2so42.0g，caco32.0g，微量鹽溶液1.0ml，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml，ph7.2，121℃滅菌30min。微量鹽溶液：feso4·7h2o0.1g，mncl2·4h2o0.1g，znso4·7h2o0.1g，蒸餾水1000ml。表1菌株t22在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征培養(yǎng)基氣生菌絲基內(nèi)菌絲可溶性色素高氏一號(hào)瓊脂白色微黃至黃褐色無蔗糖硝酸鹽瓊脂白色至淡綠灰黃色白色無葡萄糖天門冬素瓊脂白色黑灰色黑灰色馬鈴薯瓊脂白色黃色暗綠黑色酵母膏麥芽膏瓊脂(isp2)白色微黃色暗黃色燕麥粉瓊脂(isp3)白色無色至微黃色暗黃色無機(jī)鹽淀粉瓊脂(isp4)白色至淡橄欖軟皮黃色微黃色黑色1.2.2菌株生理生化特性檢測(cè)生理生化特性主要檢測(cè)菌株對(duì)主要碳源的利用情況以及產(chǎn)素活性。菌株t22能夠利用d-葡萄糖、l-阿拉伯糖、d-甘露醇、肌醇、麥芽糖、棉子糖，不能利用l-鼠李糖、蔗糖、木糖、果糖。菌株t22牛奶胨化、淀粉水解、明膠液化陽性，不產(chǎn)生纖維素、黑色素、硫化氫(表2)。表2菌株t22生理生化特性碳源利用結(jié)果酶活結(jié)果d-葡萄糖+牛奶胨化+l-阿拉伯糖+淀粉水解+d-甘露醇+明膠液化+肌醇+纖維素-麥芽糖+黑色素-棉子糖+硫化氫-l-鼠李糖-蔗糖-木糖-果糖-注：“+”為陽性，“-”為陰性。1.2.3菌株分子生物學(xué)鑒定挑取菌株t22接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7d收集菌體。采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株t22基因組dna后，利用細(xì)菌通用引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’-tacggctaccttgttacgactt-3’進(jìn)行菌株t22的16srdna序列pcr擴(kuò)增。回收pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后，陽性克隆送北京博邁德生物技術(shù)公司測(cè)序，菌株t22具有序列表中序列1的16srdna序列。將所得序列采用blast軟件在genbank進(jìn)行同源性比較，clustalx軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，mega5.0軟件中neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。blast分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與菌株t22同源性較高的菌株均屬于鏈霉菌屬，選取相似性較高菌株的16srdna序列采用mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，菌株與streptomycesalboniger(nr043228、ab184331)屬于同一分支，相似性達(dá)到99％，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征，將菌株t22鑒定為白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)。白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22已于2017年05月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.14190。下文稱為白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22或菌株t22。實(shí)施例2、白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22的抑菌活性2.1瓊脂塊法：無菌移液管吸取5ml無菌水于供試靶標(biāo)病原菌培養(yǎng)物斜面，用竹簽將菌絲刮下制備病原菌懸液，用1ml無菌移液管吸取0.1ml菌懸液均勻涂布于pda(病原真菌)或lb(病原細(xì)菌)平板上。供試病原真菌為番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)、葡萄灰霉病菌(botrytiscinerea)、桃褐腐病菌(moniliniafructicola)、辣椒炭疽病菌(colletotrichumcapsici)、交鏈格孢菌(alternariaalternata)、黃瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、棉花枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、甘藍(lán)枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.conglutinans)、小麥紋枯病菌(rhizoctoniacereali)、串珠鐮刀菌(fusariummoniliforme)。供試病原細(xì)菌為茄子青枯病菌(ralstoniasolanacearum)、大白菜黑腐病菌(xanthomonascampestrispv.campsetris)、黃瓜角斑病菌(pseudomonassyringaepv.lachrymans)。打孔器切取高氏1號(hào)平板上培養(yǎng)7d的、直徑為0.7cm的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22瓊脂塊，接種于涂有病原菌的平板上。病原真菌25℃培養(yǎng)4d、病原細(xì)菌28℃培養(yǎng)2d后，測(cè)量拮抗圈直徑。結(jié)果表明白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22對(duì)包括番茄灰霉病菌在內(nèi)的多種植物病原菌表現(xiàn)出良好的皿內(nèi)拮抗性(圖4)，拮抗圈直徑為12-26mm(表3)。表3白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22對(duì)供試病原菌的拮抗圈直徑2.2生長(zhǎng)速率法2.2.1白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液的制備接種環(huán)挑取平板上生長(zhǎng)好的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22接種到裝有100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃搖床180rpm振蕩培養(yǎng)7d，收集發(fā)酵液，10000rpm、4℃離心10min去除菌體，發(fā)酵液上清液采用0.22μm微孔濾膜過濾發(fā)酵液除去培養(yǎng)物中的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22菌體，得到白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液(簡(jiǎn)稱菌株t22無菌發(fā)酵濾液)。其中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基為高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g用蒸餾水定容到1000ml，121℃條件下滅菌20min，得液體發(fā)酵培養(yǎng)基。2.2.2病原菌菌餅制備向已培養(yǎng)5d的黃瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)和草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)斜面中各加入無菌水4ml，用竹簽將菌絲刮下制備病原菌菌懸液。用1ml無菌移液管吸取0.1ml菌懸液涂布于pda平板上，28℃培養(yǎng)5d后，病原菌菌落長(zhǎng)滿pda平板，用無菌打孔器制成直徑7mm圓形病原菌菌餅。2.2.3拮抗菌無菌發(fā)酵濾液抑菌率測(cè)定將白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液與冷卻至50℃左右的pda培養(yǎng)基按體積比1:4混勻后倒平板,用滅菌竹簽挑取上述供試病原菌菌餅于平板中央菌面朝上，每處理重復(fù)3次，以無菌水代替無菌發(fā)酵濾液為對(duì)照。25℃培養(yǎng)4d用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率％＝(對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100。供試病原真菌在含有菌株t22無菌發(fā)酵濾液的pda平板上幾乎不生長(zhǎng)，而在無菌水對(duì)照pda平板上生長(zhǎng)正常(圖5)。菌株t22無菌發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)和草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，抑菌率分別為79.1％、84.6％和85.5％。實(shí)施例3、白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22產(chǎn)纖維素酶和幾丁質(zhì)酶活性接種環(huán)挑取平板上生長(zhǎng)好的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22于產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7d后，向平板中加入2g/l的剛果紅染液5ml，染色30min后去離子水沖洗干凈，再用1m的nacl溶液脫色，去離子水沖洗干凈，觀察菌落周圍形成水解圈情況。產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基：纖維素粉5.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，nacl0.5g，mgso4·7h2o0.5g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml。產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)2.5g，k2hpo40.7g，k2hpo40.3g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.01g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml。結(jié)果表明白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22周圍有水解圈形成，說明白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22能夠產(chǎn)生纖維素酶和幾丁質(zhì)酶(圖6)。實(shí)施例4、白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液對(duì)種子發(fā)芽的影響4.1白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液的制備接種環(huán)挑取平板上生長(zhǎng)好的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22接種到裝有100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃搖床180rpm振蕩培養(yǎng)7d，收集發(fā)酵液，采用0.22μm微孔濾膜過濾發(fā)酵液除去培養(yǎng)物中的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22菌體，得到白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液。其中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基為高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g用蒸餾水定容到1000ml，121℃條件下滅菌20min，得液體發(fā)酵培養(yǎng)基。4.2白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液稀釋液制備將步驟4.1的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液分別用無菌水稀釋10倍、100倍、200倍、500倍，得到白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液10倍稀釋液、白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液、白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液200倍稀釋液和白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液500倍稀釋液。4.3種子發(fā)芽試驗(yàn)選取顆粒飽滿、大小一致的番茄(佳粉1號(hào))種子，采用步驟4.2的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液10倍稀釋液、100倍稀釋液、200倍稀釋液和500倍稀釋液浸泡種子，用等體積的步驟4.1的液體發(fā)酵培養(yǎng)基(無菌)作為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)10粒種子。28℃培養(yǎng)24h，收集種子，無菌水沖洗干凈種子后，將其放在鋪有兩層無菌水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，28℃保濕培養(yǎng)5d，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，測(cè)量胚軸、胚根長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液顯著增加了番茄胚軸、胚根長(zhǎng)度，提高了番茄種子發(fā)芽勢(shì)，增幅分別高達(dá)15.1％、29.7％和43.9％；白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液200倍稀釋液處理的番茄種子，其胚軸、胚根長(zhǎng)度和種子發(fā)芽勢(shì)較對(duì)照增加了8.8％、18.1％和32.3％(表4)。表4白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液對(duì)番茄種子發(fā)芽的影響實(shí)施例5、白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病離體防治效果采用離體葉片法，選取30片大小一致的番茄植株頂端葉片，2％(w/v)次氯酸鈉消毒3min，自來水沖洗晾干。試驗(yàn)設(shè)3組處理，每組處理10片葉片，包括未接種液體培養(yǎng)基噴施+灰霉病菌處理，菌株t22發(fā)酵液噴施+灰霉病菌處理，50％咯菌腈1000倍液噴施+灰霉病菌處理(圖7)。1、菌株t22發(fā)酵液噴施+灰霉病菌處理：用實(shí)施例4的步驟4.1的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液對(duì)番茄葉片進(jìn)行噴施處理，直到布滿葉片，24h后采用滅菌打孔器切取直徑7mm的番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)菌餅接種于處理葉片中央。2、未接種液體培養(yǎng)基噴施+灰霉病菌處理：用實(shí)施例4的步驟4.1的液體發(fā)酵培養(yǎng)基(無菌)替換實(shí)施例4的步驟4.1的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液，其它操作同步驟1。作為空白對(duì)照。3、50％咯菌腈1000倍液噴施+灰霉病菌噴施處理：用50％咯菌腈1000倍液替換實(shí)施例4的步驟4.1的白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液，其它操作同步驟1。作為化學(xué)藥劑對(duì)照。7d后測(cè)量處理和對(duì)照番茄葉片病斑直徑，根據(jù)公式：防效％＝(空白對(duì)照平均病斑直徑—處理平均病斑直徑)/空白對(duì)照平均病斑直徑×100％，計(jì)算菌株t22發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的離體防效。結(jié)果表明白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液(無菌代謝物)噴施處理番茄離體葉片能夠明顯降低番茄灰霉病病斑直徑，白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液(無菌代謝物)處理番茄灰霉病的離體防效達(dá)到55.1％(表5)。表5、白黑鏈霉菌(streptomycesalboniger)t22無菌發(fā)酵濾液對(duì)番茄灰霉病離體防效處理病斑直徑cm防效％未接種液體培養(yǎng)基噴施+灰霉病菌2.16±0.23-菌株t22發(fā)酵液噴施+灰霉病菌0.97±0.2155.1％50％咯菌腈1000倍液噴施+灰霉病菌0.84±0.0961.1％<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院<120>一株防病促生的白黑鏈霉菌及其代謝產(chǎn)物的制備與應(yīng)用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1310<212>dna<213>白黑鏈霉菌（streptomycesalboniger）<400>1agtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagccctgg60aaacggggtctaataccggataacacctccactctcctgagtggaggttaaaagctccgg120cggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcg180acgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccaga240ctcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgac300gccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaa360gtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgt420agggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgt480cgggtgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggctagctagagtg540tggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaaca600ccggtggcgaaggcggatctctgggccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggggag660cgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggaactaggtgttggcg720acattccacgtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggc780cgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggct840taattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaagcatcagag900atggtgccccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgt960gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttctgtgttgccagcatgccc1020ttcggggtgatggggactcacagaagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacg1080acgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggcaggtaca1140atgagctgcgataccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagcctgtctcagttcggattgg1200ggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagttgctagtaatcgcagatcagcattgctgc1260ggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaag1310當(dāng)前第1頁12