本發(fā)明屬分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種線粒體耳聾a1555g突變的熒光定量pcr檢測試劑盒，及其在線粒體耳聾a1555g突變檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

耳聾是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起，其中超過50％的耳聾患者由遺傳因素導(dǎo)致。在遺傳性耳聾中，30％為綜合征耳聾，70％為非綜合征耳聾。耳聾的遺傳方式可表現(xiàn)常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、x連鎖遺傳和母系遺傳，線粒體dna(mtdna)突變是母系遺傳性耳聾發(fā)生的重要原因之一，在遺傳性耳聾中的發(fā)病率約為1％～2％。

位于mtdna12srrna上的a1555g突變是氨基糖苷類抗生素如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等的作用靶點，與藥物性耳聾的發(fā)生密切相關(guān)。該突變的主要致聾機制是人類mtdna的第1555位核苷酸相當(dāng)于細菌16srrna的第1491位核苷酸，當(dāng)發(fā)生a1555g突變時，mtdna12srrna的a區(qū)能形成一個新的堿基配對，導(dǎo)致12srrna的二級結(jié)構(gòu)與細菌16srrna對應(yīng)部位的相似度更高，從而促進氨基糖苷類抗生素與之結(jié)合，結(jié)合后的氨基糖苷類抗生素會抑制參與氧化磷酸化過程的呼吸鏈蛋白的合成，使攜帶該突變的個體發(fā)生聽力損傷?？傊瑪y帶a1555g突變的個體對氨基糖苷類藥物具有超敏性，可引起臨床上常見的“一針致聾”現(xiàn)象，是藥物性耳聾發(fā)生的重要原因之一。

目前，mtdna突變的常見檢測方法主要有直接測序法、微陣列芯片法、pcr-rflp法、熒光定量pcr法等。直接測序法的優(yōu)點是準確性高，但檢測周期較長，且需要專業(yè)的測序儀和結(jié)果判讀人員，不適合臨床推廣應(yīng)用。微陣列芯片法具有高通量的優(yōu)點，但存在檢測成本高、操作繁瑣、易交叉污染等缺點，不適用于大樣本篩查的需求。pcr-rflp法由于在pcr擴增結(jié)束后需開蓋進行后續(xù)的酶切和電泳，同樣存在操作繁瑣、容易污染等問題。熒光定量pcr技術(shù)近年來在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，其基本原理是利用taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通pcr基礎(chǔ)上設(shè)計熒光雙標記探針，兩端分別標記熒光報告基團(r)和淬滅基團(q)；探針保持完整時r基團的熒光信號被q基團抑制，一旦探針被切斷，q基團的抑制作用消失，r基團的熒光信號就可被檢測到。該技術(shù)通過對熒光信號的檢測實現(xiàn)對pcr過程中產(chǎn)物量的實時監(jiān)測，除具有定量準確、檢測快速等優(yōu)點外，最大的優(yōu)勢是采用完全閉管檢測，省去了對pcr產(chǎn)物的后處理，避免了交叉污染。而且，隨著材料和儀器的進一步發(fā)展，通過在熒光探針的5’端標記不同的熒光染料(fam、hex、rox等)及多通道熒光定量pcr儀，可以實現(xiàn)基因分型、基因突變檢測、snp分析等研究。

針對熒光定量pcr傳統(tǒng)taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，美國abi公司于2000年推出一種新的taqman探針——mgb探針，其3’端采用非熒光性的淬滅基團，在吸收報告基團的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。此外，mgb探針的3’端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可極大提高探針與模板雜交的穩(wěn)定性，使較短的探針同樣能達到較高的tm值。而短探針的主要優(yōu)點在于熒光報告基團與淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低，信噪比更高；同時，短探針也簡化了設(shè)計和降低了成本。有實驗表明mgb探針對于等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測單堿基突變。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種線粒體耳聾常見突變a1555g的熒光定量pcr檢測試劑盒，由定量pcr反應(yīng)液、第一陽性對照品、第二陽性對照品、陰性對照品組成，其中定量pcr反應(yīng)液含有pcr緩沖液、mgcl2、dntps、耐熱dna聚合酶、上游擴增引物、下游擴增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴增引物序列為：5’-catttaactaaaacccctacgcattt-3’

下游擴增引物序列為：5’-gcactttccagtacacttaccatgtt-3’

第一熒光探針序列為：5’-fam-aggaggcaagtcg-mgb-3’

第二熒光探針序列為：5’-hex-tagaggagacaagtcg-mgb-3’

第一陽性對照品為線粒體第1555位點為a堿基的dna樣品，第二陽性對照品為線粒體第1555位點為g堿基的dna樣品，陰性對照品為無菌注射用水樣品。

本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。本發(fā)明試劑盒包括說明書和盒體。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述的試劑盒在相關(guān)性耳聾線粒體a1555g突變檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明試劑盒使用方法：

每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。

⑴人外周血細胞mtdna的提取：嚴格按照美國biovision公司商品化的線粒體dna提取試劑盒操作，從臨床外周血標本中提取mtdna。

⑵pcr擴增檢測：在雙色(或以上)熒光定量pcr儀上進行，每個pcr反應(yīng)體系總體積為25μl，其中包括20μlpcr反應(yīng)液和5μl模板(提取的mtdna、陽性對照、陰性對照)。探針檢測模式為：fam、hex通道分別用于檢測1555位點的g堿基和a堿基。pcr反應(yīng)條件：94℃5分鐘預(yù)變性，94℃20秒→60℃60秒，共40個循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運行程序。

⑶熒光定量結(jié)果報告：①檢測樣品g堿基探針ct值≤35且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，同一反應(yīng)體系中a堿基探針ct值大于g堿基探針ct值，且兩者差值≥5，則該檢測樣品1555位點為g堿基；②檢測樣品a堿基探針ct值≤35且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，同一反應(yīng)體系中g(shù)堿基探針ct值大于a堿基探針ct值，且兩者差值≥5，則該檢測樣品1555位點為a堿基；③當(dāng)兩探針ct值均大于35或兩探針ct值的差值小于5時，需對樣品重新進行mtdna提取和pcr檢測。

本發(fā)明針對mtdna第1555位點的a>g單堿基突變設(shè)計兩條mgb探針，開發(fā)該位點突變的熒光定量pcr檢測試劑盒，旨在準確、快速、簡便地檢測mtdnaa1555g突變，從而應(yīng)用于該突變相關(guān)性耳聾的臨床診斷、預(yù)防和治療。本發(fā)明采用實時熒光定量pcr技術(shù)和雙色熒光探針，開發(fā)研制了用于線粒體耳聾常見突變a1555g的檢測試劑盒。該試劑盒能通過一步法檢測mtdna第1555位點是否發(fā)生a>g突變，可滿足臨床準確、快速、簡便地診斷該突變相關(guān)性耳聾的需要，同時為a1555g突變導(dǎo)致的線粒體耳聾的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為第一陽性對照品檢測結(jié)果1555位點為a堿基的擴增曲線。

圖3為第二陽性對照品檢測結(jié)果1555位點為g堿基的擴增曲線。

具體實施方式

本發(fā)明結(jié)合實施例和附圖作進一步說明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

參見圖1，本發(fā)明提供的線粒體耳聾a1555g突變的熒光定量pcr檢測試劑盒，由定量pcr反應(yīng)液(1)、第一陽性對照品(2)、第二陽性對照品(3)、陰性對照品(4)、說明書(5)和盒體(6)組成，其中定量pcr反應(yīng)液含有pcr緩沖液、mgcl2、dntps、耐熱dna聚合酶、上游擴增引物、下游擴增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴增引物序列為：5’-catttaactaaaacccctacgcattt-3’

下游擴增引物序列為：5’-gcactttccagtacacttaccatgtt-3’

第一熒光探針序列為：5’-fam-aggaggcaagtcg-mgb-3’

第二熒光探針序列為：5’-hex-tagaggagacaagtcg-mgb-3’

第一陽性對照品為線粒體第1555位點為a堿基的dna樣品，第二陽性對照品為線粒體第1555位點為g堿基的dna樣品，陰性對照品為無菌注射用水樣品。

本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

實施例2線粒體耳聾a1555g突變熒光定量pcr檢測試劑盒的應(yīng)用

(一)檢測樣品：

在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院確診為感音神經(jīng)性耳聾患兒30例，所有病例均采用美國biovision公司的線粒體dna提取試劑盒，從其外周血標本中提取線粒體dna作為檢測樣品。

(二)熒光定量pcr檢測

在定量pcr反應(yīng)液管中分別加入檢測樣品、陽性對照品或陰性對照品5μl，在雙色(或以上)熒光定量pcr儀上進行pcr擴增，fam、hex通道分別用于檢測1555位點的g堿基和a堿基。pcr反應(yīng)條件為94℃5分鐘預(yù)變性，94℃20秒→60℃60秒，共40個循環(huán)。

(三)檢測結(jié)果

第一陽性對照品檢測結(jié)果1555位點為a堿基(圖2)，第二陽性對照品檢測結(jié)果1555位點為g堿基(圖3)。臨床檢測樣品中1555位點為a堿基的有28例，占93.3％；1555位點為g堿基的有2例，占6.7％。所有檢測樣品的pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)直接測序，發(fā)現(xiàn)1555位點的堿基均與熒光定量pcr檢測結(jié)果相符，表明該試劑盒檢測a1555g突變具有很好的準確性。

本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限度的范圍。

<110>浙江大學(xué)

<120>線粒體耳聾a1555g突變的熒光定量pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增人線粒體12srrna的上游引物序列

<400>1

catttaactaaaacccctacgcattt26

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增人線粒體12srrna的下游引物序列

<400>2

gcactttccagtacacttaccatgtt26

<210>3

<211>13

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人線粒體第1555位點為g堿基的熒光探針序列

<400>3

aggaggcaagtcg13

<210>4

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人線粒體第1555位點為a堿基的熒光探針序列

<400>4

tagaggagacaagtcg16