本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測風(fēng)弓形蟲抗體的重組蛋白組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：sag1和微線體蛋白mic2被認(rèn)為在弓形蟲侵染宿主過程中發(fā)揮了重要作用，在免疫方面sag1和mic2被認(rèn)為是一種理想的診斷抗原，能夠準(zhǔn)確快速，靈敏的檢測出弓形蟲的感染，從而被廣泛而深入研究。sag1是目前研究最多和研究最深入的一種膜蛋白，在不同蟲株中具有高度保守性，sag1可以在原核表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，可以作為診斷抗原進(jìn)行早期診斷。mic2是弓形蟲入侵宿主細(xì)胞過程中必需存在的一個入侵因子，在弓形蟲連接到宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。mic2基因是保守序列，不能被敲除，缺失后會削弱蟲體對宿主細(xì)胞的入侵能力。雖然目前現(xiàn)有技術(shù)中有用于檢測弓形蟲抗體的重組蛋白，但是仍存在假陽性及漏檢問題，針對上述存在的問題，根據(jù)sag1和微線體蛋白mic2的性質(zhì)，可以開發(fā)一種sag1和微線體蛋白mic2特異性表位的重組蛋白的復(fù)配組合物，用于檢測弓形蟲抗體。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于是：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種特異性強，靈敏度高，可提高檢出率，降低漏檢的檢測弓形蟲抗體的重組蛋白組合物。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種檢測弓形蟲抗體的重組蛋白組合物，所述重組蛋白由sag1特異表位的重組蛋白和mic2特異表位的重組蛋白組成。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述sag1特異表位的重組蛋白和mic2特異表位的重組蛋白在所述重組蛋白組合物中按照相同濃度、相同比例混合。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述sag1特異表位為sag1蛋白n端第48個氨基酸至316個氨基酸，所述mic2特異表位為mic2蛋白n端第75個氨基酸至468個氨基酸。本發(fā)明的另一個目的在于是：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種檢測弓形蟲抗體的重組蛋白組合物的制備方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種檢測弓形蟲抗體的重組蛋白組合物的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：(1)弓形蟲抗體診斷抗原表位的篩選利用在線分析工具，分析弓形蟲sag1和mic2的氨基酸序列全長，篩選出弓形蟲sag1蛋白特異性抗原位于第48個氨基酸到第316個氨基酸；弓形蟲mic2蛋白特異性抗原位于第75個氨基酸到第468個氨基酸；(2)弓形蟲sag1和mic2蛋白抗原表位的基因克隆以弓形蟲dna為模板，用sag1上、下游引物擴(kuò)增弓形蟲sag1蛋白抗原表位的基因片段；用mic2上、下游引物擴(kuò)增弓形蟲mic2蛋白抗原表位的基因片段；電泳膠回收目的片段，-20℃凍存?zhèn)溆茫?3)分別構(gòu)建sag1和mic2蛋白表達(dá)載體提取pgex-4t-1和pgex-4t-2質(zhì)粒，將pgex-4t-1和pgex-4t-2分別雙酶切，電泳后膠回收雙酶切的質(zhì)粒片段；弓形蟲sag1蛋白和mic2蛋白分別雙酶切，電泳后膠回收雙酶切目的片段；將雙酶切質(zhì)粒和雙酶切目的片段按1:3-10比例，用t4連接酶16℃過夜連接，得到重組質(zhì)粒。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述制備方法還包括下列步驟：重組質(zhì)粒的篩選和鑒定：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3),涂布含氨芐青霉素的lb平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜；次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和對照菌落，分別提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切，跑電泳，均能看見相應(yīng)的目的片段和載體片段，構(gòu)建表達(dá)載體成功，即為陽性表達(dá)菌；蛋白工程菌高效表達(dá)：將鑒定陽性表達(dá)菌和對照菌接種至含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩過夜，次日按1:100接種，37℃恒溫?fù)u床振蕩4h，加終濃度為0.5-1mmol/liptg，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)2-6h；離心，收集沉淀菌體，再將沉淀菌體破碎，收集的上清和沉淀分別進(jìn)行sds-page檢測；發(fā)現(xiàn)pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2表達(dá)的目的蛋白均在上清中，即分別獲得了高表達(dá)的sag1和mic2抗原性片段蛋白的工程菌；表達(dá)蛋白的純化：將高效表達(dá)的重組蛋白工程菌離心，收集沉淀菌體，再將沉淀菌體重懸于原離心體積的1/10裂解液內(nèi)，冰浴超聲菌體，離心，收集菌液上清；取上清與50％谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合均勻，離心，棄上清，收集沉淀并向沉淀中加入8-12倍標(biāo)準(zhǔn)體積的pbs混合均勻，離心，再棄上清，收集沉淀并向沉淀中加入1-3倍體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，混勻，離心，收集的上清在pbs中透析24-48h，離心取上清，即分別獲得sag1和mic2抗原性目的蛋白，-20℃?zhèn)溆谩Ｗ鳛橐环N改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(2)的擴(kuò)增條件：階段i:94℃3min；階段ii:94℃30s、58℃30s、72℃1min，30個循環(huán)；階段iii:72℃5min。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(2)中sag1和mic2的上、下游引物分別具有如下所示的序列：sag1上游引物序列為：5’-aagaattctcggatccccctcttg-3’sag1下游引物序列為：5’-atctcgagactggctgttcccgca-3’mic2上游引物序列為：5’-atcccgggctggacatttgctttcttat-3’mic2下游引物序列為：5’-aactcgagtggacacggtgaggtatt-3’。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(3)中的重組質(zhì)粒為pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2。本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：本發(fā)明選擇sag1和mic2兩個代表性的抗原蛋白，分析兩種蛋白氨基酸序列，挑選抗原性比較強的部分片斷，作為重組蛋白的對象，大大提高了表達(dá)的產(chǎn)量和特異性，將兩種重組蛋白復(fù)配得到的重組蛋白組合物具有較好的特異性和敏感性，將其用于診斷弓形蟲抗體，大大提高了臨床檢出率，有效解決了檢測時所存在的假陽性及漏檢問題。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1一種檢測弓形蟲抗體的重組蛋白組合物，由sag1特異表位的重組蛋白和mic2特異表位的重組蛋白按照相同濃度、相同比例混合組成的重組蛋白。其中sag1特異表位為sag1蛋白n端第48個氨基酸至316個氨基酸，mic2特異表位為mic2蛋白n端第75個氨基酸至468個氨基酸。實施例2一種診斷弓形蟲抗體重組抗原組合物的制備方法，包括以下步驟：(1)弓形蟲抗體診斷抗原表位的篩選利用expasy、tmhmm、signalip4.1等在線分析工具，分析弓形蟲sag1和mic2的氨基酸序列全長，篩選出弓形蟲sag1蛋白特異性抗原位于第48個氨基酸到第316個氨基酸；弓形蟲mic2蛋白特異性抗原位于第75個氨基酸到第468個氨基酸；(2)弓形蟲sag1和mic2蛋白抗原表位的基因克隆sag1抗原表位dna序列兩側(cè)設(shè)計引物上游引物5-aagaattctcggatccccctcttg-3’ecori酶切位點下游引物5’-atctcgagactggctgttcccgca-3’xhoi酶切位點mic2抗原表位dna序列兩側(cè)設(shè)計引物上游引物5’-atcccgggctggacatttgctttcttat-3’smai酶切位點下游引物5’-aactcgagtggacacggtgaggtatt-3’xhoi酶切位點以弓形蟲dna為模板，用sag1上下游引物擴(kuò)增弓形蟲sag1蛋白抗原表位的基因片段；用mic2上下游引物擴(kuò)增弓形蟲mic2蛋白抗原表位的基因片段；擴(kuò)增條件：階段i:94℃3min；階段ii:94℃30s、58℃30s、72℃1min，30個循環(huán)；階段iii:72℃5min；電泳膠回收目的片段，sag1目的片段為823bp，mic2目的片段為1198bp，-20℃凍存?zhèn)溆茫?3)分別構(gòu)建sag1和mic2蛋白表達(dá)載體提取pgex-4t-1和pgex-4t-2質(zhì)粒，pgex-4t-1用ecori和xhoi雙酶切，pgex-4t-2用smai和xhoi雙酶切，電泳后膠回收雙酶切的質(zhì)粒片段；用ecori和xhoi雙酶切弓形蟲sag1蛋白，smai和xhoi雙酶切mic2蛋白，電泳后膠回收，-20℃?zhèn)溆?；雙酶切質(zhì)粒和雙酶切目的片段按1:3-10比例，用t4連接酶16℃過夜連接。連接后的重組載體分別是pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2；(4)重組質(zhì)粒的篩選和鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3),涂布含氨芐青霉素(50ug/ml)lb平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。次日隨機(jī)挑取5個轉(zhuǎn)化菌落和2個對照菌落(質(zhì)粒pgex-4t-1和pgex-4t-2)，分別提取質(zhì)粒，pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2分別用ecori/xhoi和smai/xhoi雙酶切，酶切后跑電泳。均能看見相應(yīng)的目的片段和載體片段，構(gòu)建表達(dá)載體成功，即為陽性表達(dá)菌；而對照菌質(zhì)粒酶切后未看見目的片段；(5)蛋白工程菌高效表達(dá)將鑒定陽性表達(dá)的菌和對照菌接種至2mllb培養(yǎng)基(60ug/ml氨芐青霉素)的試管中，37℃恒溫?fù)u床振蕩過夜，次日按1:100接種，37℃恒溫?fù)u床振蕩4h，加iptg(終濃度為1mmol/l)，繼續(xù)37℃誘導(dǎo)4h；離心收集菌液，破碎后上清和沉淀均進(jìn)行sds-page檢測；發(fā)現(xiàn)pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2表達(dá)的目的蛋白均在上清中；對照菌中無目的蛋白條帶，說明分別獲得了高表達(dá)的sag1和mic2抗原性片段蛋白的工程菌；(6)表達(dá)蛋白的純化高效表達(dá)的重組蛋白工程菌高速(10000rpm)低溫(4℃)離心10min，將沉淀的菌體重懸于原離心體積的1/10裂解液(50mmtris-hcl、10mmedta、15mmnacl、10mmdtt)內(nèi)，冰浴超聲菌體20min，高速(12000rpm)低溫(4℃)離心30min，收集菌液上清；上清與50％谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合，于室溫下輕搖30min，混合物于4℃離心機(jī)中2100rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清，收集的沉淀中加入10倍標(biāo)準(zhǔn)體積的pbs，顛倒數(shù)次混勻(洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白)，將混合物于4℃離心機(jī)中2100rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清，收集的沉淀中加入1倍體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動10min(洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白)，4℃2100rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min，上清移至新管中，重復(fù)2次，合并3次上清，在pbs(10mm，ph7.4)中透析48h，離心取上清即分別獲得sag1和mic2抗原性目的蛋白，-20℃?zhèn)溆?。實施?陽性表達(dá)菌重組質(zhì)粒測序?qū)⑸鲜鲫栃员磉_(dá)菌用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒送于上海生工測序。重組質(zhì)粒內(nèi)的sag1基因片段的dna序列完全正確，結(jié)果如下：tcggatccccctcttgttgccaatcaagttgtcacctgcccagataaaaaatcgacagccgcggtcattctcacaccgacggagaaccacttcactctcaagtgccctaaaacagcgctcacagagcctcccactcttgcgtactcacccaacaggcaaatctgcccagcgggtactacaagtagctgtacatcaaaggctgtaacattgagctccttgattcctgaagcagaagatagctggtggacgggggattctgctagtctcgacacggcaggcatcaaactcacagttccaatcgagaagttccccgtgacaacgcagacgtttgtggtcggttgcatcaagggagacgacgcacagagttgtatggtcacagtgacagtacaagccagagcctcatcggtcgtcaataatgtcgcaaggtgctcctacggtgcagacagcactcttggtcctgtcaagttgtctgcggaaggacccactacaatgaccctcgtgtgcgggaaagatggagtcaaagttcctcaagacaacaatcagtactgttccgggacgacgctgactggttgcaacgagaaatcgttcaaagatattttgccaaaattaactgagaacccgtggcagggtaacgcttcgagtgataagggtgccacgctaacgatcaagaaggaagcatttccagccgagtcaaaaagcgtcattattggatgcacagggggatcgcctgagaagcatcactgtaccgtgaaactggagtttgccggggctgcagggtcagcaaaatcggctgcgggaacagccagt重組質(zhì)粒內(nèi)的mic2基因片段的dna序列完全正確，結(jié)果如下：ctggacatttgctttcttatcgattcgtctggaagcataggaatacagaatttccgtctagtaaaacagttcctccacacctttttaatggtgttgcccattggcccagaagaagttaacaatgcagttgttacttactcgacggacgttcacctgcaatgggatctacagagtccgaacgcggttgacaagcagctcgcggcgcatgcggtgctagacatgccgtataaaaagggcagtaccaacaccagtgatggactgaaggcctgcaaacaaattctgtttacaggttcgcgcccaggacgcgaacatgtgccgaagctagtgattggaatgacagatggcgaatcggattctgattttcgcaccgtgagagcggcaaaggagattcgtgagcttggaggcatcgtcacagtccttgcagtcggtcattacgtcaaacatagtgagtgccgaagcatgtgtgggtgcagtggtacgagcgatgatgacagtccgtgtcccctgtatcttcgggctgactgggggcagctcgcgacggcgattaaaccgatgcttaaagaggtttgtaagacactcccccaggatgccatttgctcggattggtccgcatggagcccctgcagtgtatcctgcggtgacggaagccaaatcaggacgcgaactgaggtttctgctccgcaacctggaacaccaacatgtccggactgccctgcgcccatgggaaggacttgcgtggaacaaggcggacttgaagaaattcgtgaatgcagtgcgggggtatgtgctgttgacgctggatgtggcgtctggggagagtggtccgcctggagcgcgtcttgcggaaatgccacaaggaagcgagagcgaacgcgttacaatgacccaccaccccagggggcaggccgtcggtgtgaaaatcaggatccgccggtgttacaggagcagacagaagaagcaactcttgctccttgcataactataccgccaactcccccagaatgggctgcatggagcgactgcactgtcacgtgtggcggtggcaatcggcatcgagtgagaaacgcactgccaccaggactggggtcgcagaacggagaaagtgacgaatcgctcgtgtccaaactgtggcctgggacagatctacgacaggaggaagcatgtaatacctcaccgtgtcca實施例4用純化的重組蛋白檢測弓形蟲抗體將純化的2種重組蛋白同等濃度下1:1混合，用碳酸鹽緩沖液(50mm，ph9.6)稀釋后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶聯(lián)板，4℃過夜。洗滌后加200ul/孔10％小牛血清的pbs37℃水浴封閉2h，洗滌后4℃?zhèn)溆?。間接酶聯(lián)免疫法檢測5份抗弓形蟲陽性血清及5份正常人血清。使用450nm波長測定od值。結(jié)果顯示(見表1)融合蛋白組合物能與5份抗弓形蟲陽性血清反應(yīng)，不與5份正常人血清反應(yīng)，說明該組合物有較好的抗原性和特異性。表1間接酶聯(lián)免疫法實驗結(jié)果(a450值)12345抗弓形蟲igm陽性血清1.2861.4711.8691.3661.881正常人血清0.0210.0190.0350.0280.033本專利不局限于上述具體的實施方式，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從上述構(gòu)思出發(fā)，不經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動，所作出的種種變換，均落在本專利的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>濰坊漢唐生物工程有限公司<120>一種檢測弓形蟲抗體的重組蛋白組合物及其制備方法<130>1<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>807<212>dna<213>sag1特異表位的基因序列<400>1tcggatccccctcttgttgccaatcaagttgtcacctgcccagataaaaaatcgacagcc60gcggtcattctcacaccgacggagaaccacttcactctcaagtgccctaaaacagcgctc120acagagcctcccactcttgcgtactcacccaacaggcaaatctgcccagcgggtactaca180agtagctgtacatcaaaggctgtaacattgagctccttgattcctgaagcagaagatagc240tggtggacgggggattctgctagtctcgacacggcaggcatcaaactcacagttccaatc300gagaagttccccgtgacaacgcagacgtttgtggtcggttgcatcaagggagacgacgca360cagagttgtatggtcacagtgacagtacaagccagagcctcatcggtcgtcaataatgtc420gcaaggtgctcctacggtgcagacagcactcttggtcctgtcaagttgtctgcggaagga480cccactacaatgaccctcgtgtgcgggaaagatggagtcaaagttcctcaagacaacaat540cagtactgttccgggacgacgctgactggttgcaacgagaaatcgttcaaagatattttg600ccaaaattaactgagaacccgtggcagggtaacgcttcgagtgataagggtgccacgcta660acgatcaagaaggaagcatttccagccgagtcaaaaagcgtcattattggatgcacaggg720ggatcgcctgagaagcatcactgtaccgtgaaactggagtttgccggggctgcagggtca780gcaaaatcggctgcgggaacagccagt807<210>2<211>1182<212>dna<213>mic2特異表位的基因序列<400>2ctggacatttgctttcttatcgattcgtctggaagcataggaatacagaatttccgtcta60gtaaaacagttcctccacacctttttaatggtgttgcccattggcccagaagaagttaac120aatgcagttgttacttactcgacggacgttcacctgcaatgggatctacagagtccgaac180gcggttgacaagcagctcgcggcgcatgcggtgctagacatgccgtataaaaagggcagt240accaacaccagtgatggactgaaggcctgcaaacaaattctgtttacaggttcgcgccca300ggacgcgaacatgtgccgaagctagtgattggaatgacagatggcgaatcggattctgat360tttcgcaccgtgagagcggcaaaggagattcgtgagcttggaggcatcgtcacagtcctt420gcagtcggtcattacgtcaaacatagtgagtgccgaagcatgtgtgggtgcagtggtacg480agcgatgatgacagtccgtgtcccctgtatcttcgggctgactgggggcagctcgcgacg540gcgattaaaccgatgcttaaagaggtttgtaagacactcccccaggatgccatttgctcg600gattggtccgcatggagcccctgcagtgtatcctgcggtgacggaagccaaatcaggacg660cgaactgaggtttctgctccgcaacctggaacaccaacatgtccggactgccctgcgccc720atgggaaggacttgcgtggaacaaggcggacttgaagaaattcgtgaatgcagtgcgggg780gtatgtgctgttgacgctggatgtggcgtctggggagagtggtccgcctggagcgcgtct840tgcggaaatgccacaaggaagcgagagcgaacgcgttacaatgacccaccaccccagggg900gcaggccgtcggtgtgaaaatcaggatccgccggtgttacaggagcagacagaagaagca960actcttgctccttgcataactataccgccaactcccccagaatgggctgcatggagcgac1020tgcactgtcacgtgtggcggtggcaatcggcatcgagtgagaaacgcactgccaccagga1080ctggggtcgcagaacggagaaagtgacgaatcgctcgtgtccaaactgtggcctgggaca1140gatctacgacaggaggaagcatgtaatacctcaccgtgtcca1182<210>3<211>24<212>dna<213>sag1上游引物序列<400>3aagaattctcggatccccctcttg24<210>4<211>24<212>dna<213>sag1下游引物序列<400>4atctcgagactggctgttcccgca24<210>5<211>28<212>dna<213>mic2上游引物序列<400>5atcccgggctggacatttgctttcttat28<210>6<211>26<212>dna<213>mic2下游引物序列<400>6aactcgagtggacacggtgaggtatt26當(dāng)前第1頁12