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      一種治療HIV感染的嵌合抗原受體的重組基因構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):11428208閱讀:1043來源:國(guó)知局
      一種治療HIV感染的嵌合抗原受體的重組基因構(gòu)建及其應(yīng)用的制造方法與工藝

      本發(fā)明涉及感染性疾病免疫治療技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種治療hiv感染的嵌合抗原受體的重組基因構(gòu)建及其應(yīng)用。



      背景技術(shù):

      艾滋病是由人類免疫缺陷病毒1型(humanimmunodeficiencyvirus1,hiv-1)感染引起的一種重大威脅人類生命安全的傳染病,據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì),自發(fā)現(xiàn)到2014年底已造成3900多萬人死亡,目前世界上艾滋病毒感染者仍有3700萬。我國(guó)艾滋病毒感染者逐年增加,其總患病人數(shù)已突破百萬。目前尚無有效疫苗且現(xiàn)有藥物不能徹底治愈。

      高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(haart)是hiv/aids治療史上的第一次革命,其極大的降低了hiv/aids的發(fā)病率和病死率,顯著延長(zhǎng)了患者壽命,甚至降低了hiv的傳播。但也面臨著很多挑戰(zhàn):1)患者必須終生服藥,需付出昂貴的經(jīng)濟(jì)代價(jià);2)嚴(yán)重的毒副作用;3)耐藥毒株的出現(xiàn);4)更為重要的是cart不能徹底清除病毒,主要是因?yàn)樗幬飪H對(duì)復(fù)制中的病毒有效,而對(duì)hiv在感染早期建立的潛伏性病毒“儲(chǔ)藏庫”(reservoir)是無效的。一旦抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中斷,病毒儲(chǔ)藏庫中的整合前病毒再度激活,幾乎所有患者體內(nèi)病毒血癥會(huì)迅速反彈。

      艾滋病毒在其傳播和繁殖過程中的高變異性使得以往有效的艾滋病藥物失效,因此出現(xiàn)了后來的“雞尾酒療法”,也就是聯(lián)合多種抗病毒藥物來進(jìn)行高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療,但是雞尾酒療法同樣有著其局限性。綜合目前國(guó)際上艾滋病研究的前沿和熱點(diǎn)問題,研究者普遍認(rèn)為hiv不能治愈的主要原因是hiv在感染極早期就在機(jī)體內(nèi)建立起隱秘的病毒“儲(chǔ)藏庫”,即靜息記憶的cd4+t淋巴細(xì)胞(restingmemorycd4+t)。

      要找到治愈艾滋病的一個(gè)重大挑戰(zhàn),就是如何能夠重新激活潛伏的hiv從而被機(jī)體的免疫系統(tǒng)自發(fā)識(shí)別和清除(shockandkill)。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn),即使在接受cart治療的感染者體內(nèi),也出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的免疫損傷,特別是細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)的數(shù)量減少和功能缺陷,這表明通過抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療重建的機(jī)體免疫系統(tǒng)將不能有效的清除那些被激活的細(xì)胞,需要通過聯(lián)合增強(qiáng)機(jī)體hiv特異性免疫應(yīng)答的方法來增強(qiáng)對(duì)hiv儲(chǔ)藏庫的清除效果。因此,對(duì)hiv潛伏性病毒“儲(chǔ)藏庫”的形成及激活策略和以重建機(jī)體免疫功能的探索都是邁向治愈hiv時(shí)代極有價(jià)值的研究方向。

      近幾年來,基于嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor,car)腫瘤免疫治療技術(shù)創(chuàng)造了殺傷腫瘤細(xì)胞的全新途徑。由于其具有高親和力和mhc(majorhistocompatibilitycomplex)非依賴性等優(yōu)點(diǎn),特別是由兩個(gè)cd28及4-1bb、cd3ζ偶聯(lián)形成的3代car可增強(qiáng)t細(xì)胞的殺瘤能力并延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的存活時(shí)間,從而在白血病和淋巴瘤等腫瘤免疫治療中取得了令人鼓舞的成效。其實(shí)早在1994年,roberts等人嘗試用car-t細(xì)胞治療hiv感染,他們選取cd4序列作為單鏈抗體用于結(jié)合感染細(xì)胞表面的gp120,雖然具有部分殺感染細(xì)胞功能且經(jīng)過多年的努力,但最終以失敗而告終。其主要原因有以下幾個(gè)方面:1.使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低,為了獲得足夠的可回輸car-t細(xì)胞,過度的體外擴(kuò)增導(dǎo)致回輸后細(xì)胞死亡和car分子的丟失。2.car分子設(shè)計(jì)本身存在缺陷,其中cd4結(jié)構(gòu)域可能引起轉(zhuǎn)導(dǎo)的ctls被hiv感染或者病毒感染細(xì)胞通過下調(diào)cd4分子的表達(dá)而逃脫car-t細(xì)胞的殺傷。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足,提供了一種新的能識(shí)別hiv病毒感染細(xì)胞表面gp120的單鏈抗體scfv以及由此單鏈抗體制成的嵌合型抗原受體(car),稱為n6-car分子。

      本發(fā)明的另一目的是提供一種能表達(dá)上述n6-car的表達(dá)載體以及n6-car載體基因修飾的cd8+t淋巴細(xì)胞。

      本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供n6-car分子修飾的cd8+t淋巴細(xì)胞在制備抗hiv感染藥物方面的用途。

      為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:

      提供了一種單鏈抗體scfv,該單鏈抗體能夠識(shí)別hiv病毒感染細(xì)胞表面的gp120,是通過串聯(lián)針對(duì)hiv病毒感染細(xì)胞表面的gp120的抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)而得,作為整個(gè)car分子的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其氨基酸序列如seqidno.2所示。

      本發(fā)明也提供了編碼上述單鏈抗體scfv的編碼基因,該基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

      本發(fā)明還提供了一種治療hiv感染的嵌合型抗原受體,該嵌合型抗原受體是通過n端到c端順次拼接信號(hào)肽、本發(fā)明提供的單鏈抗體scfv、cd8hinge、白細(xì)胞抗原分化群分子跨膜區(qū)cd28-tm及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域icd、4-1bb和白細(xì)胞抗原分化群3的ζ鏈cd3得到的,所得到的嵌合型抗原受體的氨基酸序列如seqidno.4所示。

      本發(fā)明同時(shí)提供了編碼上述的嵌合型抗原受體n6-car的編碼基因,該基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。

      一種含有并能表達(dá)氨基酸序列為seqidno.4所示的嵌合型抗原受體n6-car的編碼基因的表達(dá)載體,所述載體為以ptk881載體為骨架,將cmv啟動(dòng)子替換成ef1α啟動(dòng)子后改造成的ptk-ef1α-n6載體,其核苷酸序列如seqidno.5所示。

      本發(fā)明提供了一種基因修飾的cd8+t淋巴細(xì)胞,是將ptk-ef1α-n6表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞所的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)cd8+t淋巴細(xì)胞,從而獲得能表達(dá)嵌合型抗原受體的基因工程化的t-淋巴細(xì)胞。n6-car改造的cd8+細(xì)胞對(duì)表達(dá)gp120細(xì)胞系的殺傷效果更加明顯。

      進(jìn)一步地,所述的基因修飾的cd8+t淋巴細(xì)胞是由以下方法制備得到:從外周血分離pbmc后再用磁珠陽選獲得cd8+t細(xì)胞,經(jīng)anti-cd3/28磁珠(細(xì)胞與磁珠比例為1:3)刺激12小時(shí)后,加入重組有n6-car分子的慢病毒感染4小時(shí)后補(bǔ)液(moi=5),從病毒感染后第三天開始,細(xì)胞計(jì)數(shù)并根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和增殖情況補(bǔ)加培養(yǎng)基,細(xì)胞濃度調(diào)整至0.6x106/ml,并補(bǔ)充il-2100u/ml,進(jìn)一步擴(kuò)增細(xì)胞直到滿足回輸?shù)募?xì)胞數(shù)。

      本發(fā)明同時(shí)提供了一種上述n6-car基因修飾的cd8+t淋巴細(xì)胞的用途,所述n6-car基因修飾的cd8+t淋巴細(xì)胞是應(yīng)用于制備抗hiv感染的活細(xì)胞藥物。

      本發(fā)明的有益效果:(1)本發(fā)明中克服早期設(shè)計(jì)的缺陷,利用能與病毒蛋白gp120高度特異性結(jié)合的廣譜中和抗體作為scfv,能與98%的hiv-1的病毒株結(jié)合,增加該car-t細(xì)胞的廣譜性;(2)本發(fā)明中使用含有sin(self-inactivating)結(jié)構(gòu)的ptk質(zhì)粒來生產(chǎn)慢病毒載體增加安全性的同時(shí),改造car分子細(xì)胞內(nèi)為雙刺激分子以其提高n6-car-t細(xì)胞的擴(kuò)增和存活特性,增加臨床有效性和安全性。(3)本發(fā)明中的能表達(dá)嵌合型抗原受體的基因修飾cd8+t淋巴細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)具有顯著的抑制、殺滅hiv病毒的活性,能夠作為活性成份制備抗hiv感染藥物。

      附圖說明

      圖1為本發(fā)明構(gòu)建的抗hiv感染的嵌合型抗原受體的結(jié)構(gòu)示意圖;

      圖2為本發(fā)明構(gòu)建的ptk-ef1α-n6慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖;

      圖3為本發(fā)明中n6-car在被轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd8+t淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平(a)及其刺激后功能性增殖能力(b)檢測(cè);

      圖4為本發(fā)明中n6-car轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd8+t淋巴細(xì)胞體外殺滅hiv感染細(xì)胞活性檢測(cè);

      圖5為共培養(yǎng)條件下本發(fā)明中n6-car轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd8+t淋巴細(xì)胞抑制病毒的活性檢測(cè);

      圖6為本發(fā)明中n6-car轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd8+t淋巴細(xì)胞殺滅人源化小鼠體內(nèi)的hiv感染細(xì)胞活性檢測(cè)。

      具體實(shí)施方式

      展示一下實(shí)例來具體說明本發(fā)明的某些實(shí)施例,且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。對(duì)本發(fā)明公開的內(nèi)容可以同時(shí)從材料、方法和反應(yīng)條件進(jìn)行改進(jìn),所有這些改進(jìn),均應(yīng)落入本發(fā)明的的精神和范圍之內(nèi)。

      實(shí)施例1:

      本發(fā)明提供了一種治療hiv感染的嵌合抗原受體(car)重組基因及其構(gòu)建方法,具體的拼接方法為:順次拼接信號(hào)肽、能識(shí)別感染hiv病毒細(xì)胞表面的gp120單鏈抗體scfv、cd8hinge、白細(xì)胞抗原分化群分子跨膜區(qū)cd28-tm+icd、4-1bb和cd3(白細(xì)胞抗原分化群分子3)的ζ鏈,最后得到完整的能治療hiv的嵌合型抗原受體(car)分子,其氨基酸序列見seqidno.4,其結(jié)構(gòu)如圖1所示;編碼該嵌合型抗原受體(car)的基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。

      治療hiv感染的嵌合型抗原受體來源的單鏈抗體scfv的氨基酸序列如seqidno.2所示,該單鏈抗體scfv是通過串聯(lián)針對(duì)感染hiv病毒細(xì)胞表面gp120的抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)而得,其編碼基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

      以seqidno.4所示的嵌合型抗原受體(car)分子詳細(xì)介紹本發(fā)明car分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。car分子的序列氮端是car來源的scfv序列,可特異性識(shí)別感染hiv病毒細(xì)胞表面的gp120;car分子的序列碳端是以三代car結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),包括cd8hinge、cd28tm+icd、4-1bb和cd3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成,通過cd28分子的跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)cfv和胞內(nèi)信號(hào)分子相連。在上述的結(jié)構(gòu)下各個(gè)片段能發(fā)揮如下的功能:信號(hào)肽可以將car分泌到胞外,cd28tm+icd將本發(fā)明的car錨釘在細(xì)胞膜上;scfv特異性識(shí)別識(shí)別感染hiv病毒細(xì)胞表面的gp120;cd3ζ為胞內(nèi)信號(hào)激活序列,在scfv結(jié)合抗原后cd3ζ激活信號(hào),啟動(dòng)淋巴細(xì)胞的殺傷活性。

      實(shí)施例2:car分子重組構(gòu)建ptk-ef-1α-n6質(zhì)粒表達(dá)載體

      按照seqidno.4所示序列合成car,將全長(zhǎng)car的編碼基因通過基于無縫重組克隆技術(shù)插入目的表達(dá)載體(見圖2)。經(jīng)過多次試驗(yàn),首選的質(zhì)粒載體為以ptk881載體為骨架,將cmv啟動(dòng)子替換成ef1α啟動(dòng)子后改造成的ptk-ef1α-n6載體(其核苷酸序列如seqidno.5所示),最終獲得了插入car基因并能表達(dá)car的重組質(zhì)粒ptk-ef1α-n6載體,其核苷酸序列如seqidno.6所示。

      病毒包裝步驟如下:

      1)取兩個(gè)均裝有16mldmem培養(yǎng)液的離心管,向其中一管加入960μgpei,另一管加入320μg預(yù)混的ptk881載體質(zhì)粒,漩渦震蕩,室溫平衡10分鐘。

      2)取一個(gè)10ml的移液管將混有pei的培養(yǎng)基吹起來,將混有質(zhì)粒的培養(yǎng)基一滴一滴地加入pei中,室溫溫育30分鐘。

      3)取一個(gè)t175瓶,向其中加入3ml胎牛血清,將和pei混合的ptk-ef1α-n6載體質(zhì)粒加入其中,然后將多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒入到t175瓶,上下左右顛倒與質(zhì)?;靹颍詈髮175瓶中的培養(yǎng)基倒回到多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。37℃,5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天,收獲上清。收集的上清4000rpm(3000g),30min離心去除293t細(xì)胞碎片。

      4)將慢病毒液上清用0.22μm濾膜過濾后,分裝到250ml的離心瓶中,于4℃,30000g離心2.5小時(shí),離心后將離心瓶小心轉(zhuǎn)移至生物安全柜,用真空泵去上清,留沉淀,加入t細(xì)胞培養(yǎng)基500μl/離心瓶,用槍將沉淀吹散混勻,即得到含n6-car分子的慢病毒載體,立即使用或分裝后于-80℃保存。

      實(shí)施例3:制備能表達(dá)嵌合型抗原受體的cd8+t細(xì)胞(car-t細(xì)胞)

      步驟1:分離患者pbmc細(xì)胞

      (1)采集人外周血樣本60-80ml,邊采集邊搖晃使得外周血與抗凝劑充分混合;

      (2)將外周血轉(zhuǎn)入50ml離心管中,用dpbs緩沖液按1:1稀釋外周血,混勻。將稀釋好的血樣緩慢加入室溫的15ml人淋巴細(xì)胞分離液的離心管中。方法如下:用10ml移液管吸取血樣,伸至分離液液面上方0.5cm處,血樣自然滑落鋪至分離液面上,然后輕輕加入血樣,注意不要沖破液面;

      (3)配平離心30min,慢升慢降;

      (4)離心完成后,離心管出現(xiàn)明顯分層由下至上:紅細(xì)胞層,粒細(xì)胞層,ficoll層、單個(gè)核細(xì)胞層和血漿層。吸取血漿層至距白膜層5mm左右處棄之。小心吸取紅細(xì)胞層以上的所有液體至離心管中,pbs稀釋,與細(xì)胞懸液體積比應(yīng)大于1:3,混勻。

      (5)離心(1600r/min)5min,pbs重懸細(xì)胞混勻,取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。

      (6)離心300g(1200r/min)5min,上清液送檢無菌檢測(cè)。

      步驟2:分選cd8+t細(xì)胞

      (1)步驟1中的pbmc細(xì)胞,用30ml生理鹽水重懸后取樣計(jì)數(shù)(取樣完后,補(bǔ)加至50ml混勻,500g、10min、18℃、升快、降快離心,去上清),計(jì)數(shù)后按每107/80μlbuffer混勻(如果上清沒有去干凈,建議不用加buffer),加入按每107/20μlcd8microbeads重懸,4-8℃孵育15min。

      (2)孵育完成后,使用按每107個(gè)1~2mlbuffer洗細(xì)胞,500g、10min離心。

      (3)用500μlbuffer重懸多達(dá)108個(gè)細(xì)胞(若細(xì)胞數(shù)目比較多,buffer使用的也會(huì)多)。

      (4)將美天旎專用ls柱,置于磁力架上,使用3mlbuffer沖洗ls柱后,將細(xì)胞重懸液加入到ls柱里,使之流盡。用3mlbuffer洗ls柱三次,每次需要流盡。將ls柱離開磁力架,使用5mlbuffer,加入到ls柱中,用活塞將標(biāo)記后的細(xì)胞沖洗出來(可以沖洗兩次,確保標(biāo)記的細(xì)胞均可以沖洗出來)。

      (5)cd8+t細(xì)胞沖洗出來后,用生理鹽水重懸至30ml,取樣計(jì)數(shù),500g、10min、18℃離心,得細(xì)胞沉淀,即可用于培養(yǎng)。

      步驟3:cd8+t細(xì)胞激活

      (1)將步驟2中cd8+t細(xì)胞,計(jì)數(shù),按密度為2x106/ml加入培養(yǎng)瓶中,混勻放入co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)。

      (2)取出培養(yǎng)瓶,輕搖,使沉降于底部的懸浮細(xì)胞浮起,移液管吸取培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入離心管中,少許培養(yǎng)基洗培養(yǎng)瓶將懸浮細(xì)胞全部收集,混勻計(jì)數(shù)。

      (3)根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度,按1.2x106/ml的濃度接種培養(yǎng)瓶中(100~120mlinat150,50~60mlinat75,15~29mlinat25),加cd3/cd28磁珠,按細(xì)胞與磁珠比例為1:3(加之前磁珠用培養(yǎng)基洗滌3次,去除保存液),加入il-2100u/ml,混勻放入co2培養(yǎng)箱培養(yǎng),收集細(xì)胞。

      步驟4:cd8+t細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)n6-car分子制備car-t細(xì)胞

      加入磁珠12小時(shí)后,取適量步驟3中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的cd8+t細(xì)胞懸液,放入離心管中300g離心5分鐘。棄去上清液,以1x106/ml細(xì)胞的比例加入嵌合型抗原受體(car)病毒載體,同時(shí)加入終濃度4μg/ml的polybrene,混勻。將細(xì)胞懸液在37℃條件下小體積孵育。孵育4小時(shí)后補(bǔ)加適量t細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)的第3天,細(xì)胞計(jì)數(shù)并根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和增殖情況補(bǔ)加培養(yǎng)基,細(xì)胞濃度調(diào)整至0.6x106/ml,并補(bǔ)充il-2100u/ml。細(xì)胞培養(yǎng)的第5天,細(xì)胞混勻轉(zhuǎn)離心管中,在磁力架上去除磁珠,細(xì)胞計(jì)數(shù)并補(bǔ)加培養(yǎng)基,并補(bǔ)充il-2100u/ml,細(xì)胞密度調(diào)整至0.6x106/ml繼續(xù)培養(yǎng)。并利用流式檢測(cè)scfv的表達(dá),同時(shí),取部分cd8+t淋巴細(xì)胞經(jīng)goatanti-humanfabantibody抗體刺激并連續(xù)傳代,以確定anti-gp120car轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd8+t淋巴細(xì)胞自擴(kuò)增能力,結(jié)果如圖3所示。

      結(jié)果表明,anti-gp120car病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)到五天后,有40%的cd8+t細(xì)胞表達(dá)car分子。當(dāng)抗體goatanti-humanfabantibody特異性地與cd8+t細(xì)胞表達(dá)car分子結(jié)合后,能有效和劑量依賴地激活細(xì)胞的增殖,隨著傳代次數(shù)增加,car分子陽性細(xì)胞種群比例也逐漸升高。

      實(shí)施例4:car-t細(xì)胞體外殺滅hiv感染細(xì)胞活性的檢測(cè)

      為了進(jìn)一步檢測(cè)n6-car的功能,我們將n6-car-t細(xì)胞與兩株hiv-1感染的細(xì)胞系h9-nl4-3和h9-ndk分別進(jìn)行混合培養(yǎng),在u形底的96孔板中進(jìn)行細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。首先利用calcein-am標(biāo)記hiv感染細(xì)胞系h9和陰性對(duì)照細(xì)胞,取100μl(含靶細(xì)胞數(shù)量104)于96孔板中,取100μl梯度稀釋的car-t細(xì)胞加入相應(yīng)的96孔板中,確保效靶比范圍為5:1到10:1,每孔終體積為200μl。室溫200g離心30分鐘,37℃孵育2-3小時(shí)。離心取上清測(cè)定熒光并計(jì)算出裂解百分?jǐn)?shù)并用于判斷n6-car-t細(xì)胞對(duì)hiv感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

      結(jié)果顯示,從5:1到10:1效靶比區(qū)間范圍內(nèi),n6-car-t細(xì)胞以劑量依賴的方式顯著殺傷兩個(gè)毒株hiv感染的靶細(xì)胞系,而對(duì)對(duì)照靶細(xì)胞沒有明顯的殺傷效果,說明n6-car-t細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞作用是hiv-gp120特異性的。

      實(shí)施例5:共培養(yǎng)條件下car-t細(xì)胞體外抑制病毒復(fù)制活性的檢測(cè)

      為了進(jìn)一步證明n6-car-t細(xì)胞在清除野生型hiv-1感染的原代cd4+t細(xì)胞方面的有效性,利用野生型hiv-1nl4-3-egfp和ndk-egep兩個(gè)毒株分別感染健康人血液樣本中分離的cd4+t淋巴細(xì)胞,感染后3小時(shí)換液。感染后的第8天,該細(xì)胞與n6-car改造的同源cd8+t淋巴細(xì)胞以1:4的比例混合,在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。靶細(xì)胞數(shù)量為106/孔,rmpi1640完全培養(yǎng)基體積為500μl/孔。48小時(shí)后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)egfp+cd4+t淋巴細(xì)胞的比例,驗(yàn)證n6-car-t細(xì)胞的殺傷作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

      結(jié)果表明,以未經(jīng)car分子改造的cd8+t細(xì)胞組為參照,n6-car-t細(xì)胞組能清除其中99.5%的hiv-1感染的細(xì)胞,表現(xiàn)出顯著的殺傷效果,充分展示了n6-car-t細(xì)胞的特異性和高效性。

      實(shí)施例6:car-t淋巴細(xì)胞在體內(nèi)殺滅感染hiv病毒細(xì)胞的活性檢測(cè)

      為了進(jìn)一步證明anti-gp120car-t淋巴細(xì)胞能否在體內(nèi)清除hiv感染的細(xì)胞,我們將帶有熒光基因的nl4-3-egfp病毒(1x106pgp24/mouse)靜脈注射到人源化小鼠blt體內(nèi),感染小鼠同時(shí),從健康志愿者分離pbmc然后分離cd8+t細(xì)胞,轉(zhuǎn)導(dǎo)n6-car慢病毒,體外擴(kuò)增10天后,計(jì)數(shù)后用500μlpbs重懸,按1x107cd8+t/kg的劑量靜脈回輸。兩周后,從小鼠體內(nèi)收集脾臟,放入包埋劑中制備冷凍切片。制備大于20張的10μm厚度的冷凍切片,在熒光共聚焦顯微鏡下照相,將相片利用velocity5.0軟件進(jìn)行量化分析(圖6a)。同時(shí),以收集到的部分脾臟細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,取5x106細(xì)胞于dnazol來提取基因組dna,利用nested-qpcr定量前病毒的拷貝數(shù)來評(píng)估體內(nèi)所有感染hiv的細(xì)胞數(shù)目(圖6b)。

      結(jié)果表明,與未接收car-t細(xì)胞治療的對(duì)照組相比,病毒蛋白表達(dá)水平和病毒基因組水平顯著性各減少97.1%,證實(shí)了car-t細(xì)胞能在體內(nèi)進(jìn)行有效地裂解和清除hiv感染的細(xì)胞,為car-t細(xì)胞進(jìn)行人體臨床測(cè)試奠定理論基礎(chǔ)。

      sequencelisting

      <110>武漢云谷生物醫(yī)藥科技有限公司

      <120>一種治療hiv感染的嵌合抗原受體的重組基因構(gòu)建及其應(yīng)用

      <130>2017

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      <170>patentinversion3.3

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