本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種獺兔源枯草芽孢桿菌及其在提高獺兔生長(zhǎng)性能中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)面臨著日益嚴(yán)峻的食品安全問(wèn)題，傳統(tǒng)的抗生素雖然在治療動(dòng)物疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)，但由于其易產(chǎn)生耐藥性等缺陷而飽受爭(zhēng)議，在養(yǎng)殖業(yè)中受到越來(lái)越多的限制。于是大部分國(guó)家開始限制抗生素的使用，并開始尋找替代抗生素的產(chǎn)品，以解決養(yǎng)殖業(yè)面臨的難題。芽孢桿菌是一種重要的益生菌，對(duì)促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和維持動(dòng)物體內(nèi)微生態(tài)的平衡具有重要意義，芽孢桿菌能夠在惡劣環(huán)境下形成抗逆性強(qiáng)的內(nèi)生孢子，能夠耐受自然界及加工過(guò)程中的極端條件，具有作為飼用益生菌開發(fā)的潛力，對(duì)動(dòng)物健康養(yǎng)殖意義重大。目前可以作為飼用的芽孢桿菌有：枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)，短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)和蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)等。

綜合目前關(guān)于枯草芽孢桿菌的文獻(xiàn)報(bào)道，其對(duì)動(dòng)物的益生功能主要體現(xiàn)在以下幾方面：第一，枯草芽孢桿菌可通過(guò)多種途徑提高動(dòng)物機(jī)體的免疫功能；第二，枯草芽孢桿菌能夠降低腸道有害菌的數(shù)量、增加腸道有益菌的數(shù)量，維持腸道微生態(tài)的平衡；第三，枯草芽孢桿菌能分泌多種酶類，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，改善腸道形態(tài)；第四，枯草芽孢桿菌通過(guò)抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為胺和氨，降低脲酶活性，減少氨氮物質(zhì)分解，提高含氮物質(zhì)的消化率等方式達(dá)到生物除臭的作用；第五，枯草芽孢桿菌能夠提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激。

獺兔是一種皮肉兼用型兔種，在目前保護(hù)野生動(dòng)物的大背景下，獺兔皮是裘皮比較成功的替代品。此外兔肉是世界衛(wèi)生組織推薦的“三高四低”優(yōu)質(zhì)肉制品，養(yǎng)殖前景廣闊。獺兔是一種敏感性很高的動(dòng)物，飼料原料、飼料配方和飼養(yǎng)環(huán)境的改變、驚嚇等都極易造成獺兔的應(yīng)激，從而引起死亡。本試驗(yàn)從獺兔體內(nèi)分離益生芽孢桿菌并應(yīng)用于獺兔，降低了芽孢桿菌添加后可能對(duì)獺兔造成的應(yīng)激，且益生菌存在種屬差異，不同宿主來(lái)源的細(xì)菌很難在其他種屬動(dòng)物腸道內(nèi)定植，甚至還可能轉(zhuǎn)化為致病菌，相同宿主來(lái)源的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)入宿主體內(nèi)時(shí)能夠在復(fù)雜的腸道菌群中排除定植抗力，快速定植到腸道中發(fā)揮其功能。在獺兔養(yǎng)殖中，腹瀉疾病高發(fā)、頻發(fā)，嚴(yán)重影響兔業(yè)生產(chǎn)，且斷奶兔因自身免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)發(fā)育不完善，斷奶后飼料結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，極易發(fā)生腹瀉，高產(chǎn)酶的芽孢桿菌的添加可以改善獺兔的消化吸收，促進(jìn)腸道發(fā)育，減少腹瀉的發(fā)生。

已有的研究表明在獺兔飼養(yǎng)中添加一定劑量的非獺兔源益生菌，獺兔死亡率卻異常升高，但耐過(guò)存活獺兔的小腸絨毛高度、隱窩深度、粘膜層厚度、腸道質(zhì)量均顯著增加，免疫器官質(zhì)量、細(xì)胞因子水平也顯著提高，腸道菌群結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，部分有害菌數(shù)量降低，有益菌數(shù)量增加，腹瀉率降低。此外一定劑量的益生菌還可增加獺兔肌肉生長(zhǎng)速度。由此可見(jiàn)，獺兔在適應(yīng)外源益生菌的過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致部分弱兔出現(xiàn)不耐受，死亡率升高的嚴(yán)重問(wèn)題。獺兔源的益生菌來(lái)自獺兔，不會(huì)出現(xiàn)不耐受現(xiàn)象，同時(shí)又具有上述益生效果，所以獺兔源益生菌篩選與應(yīng)用是目前解決獺兔養(yǎng)殖中斷奶兔養(yǎng)殖問(wèn)題的有效途徑之一。但是相關(guān)的研究在國(guó)內(nèi)外都是空白。因此，獺兔源高產(chǎn)酶芽孢桿菌的定向篩選與應(yīng)用研究工作十分必要，為獺兔養(yǎng)殖中使用益生菌替代抗生素添加劑提供參考，并為生產(chǎn)綠色優(yōu)質(zhì)的兔肉提供保證。

目前，國(guó)內(nèi)申請(qǐng)飼用芽孢桿菌專利，其

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
大多是飼用具有育肥作用的芽孢桿菌，例如：專利一種利用中性蛋白酶的凝結(jié)芽孢桿菌提高北京油雞生產(chǎn)性能的方法(申請(qǐng)?zhí)枺?01611014471.3，申請(qǐng)日：2016-11-18，公開號(hào)：cn106520614a，公開日：2017-03-22)報(bào)道了從傳統(tǒng)干酪中分離出的一株凝結(jié)芽孢桿菌可以降低北京油雞的死亡率，顯著提高油雞體重和蛋白利用率，促進(jìn)腸道中有益菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌的生長(zhǎng)，對(duì)提高油雞生產(chǎn)性能有良好的作用；專利一株提高白羽肉雞生長(zhǎng)性能的凝結(jié)芽孢桿菌(申請(qǐng)?zhí)枺?01410719197.4，申請(qǐng)日：2014-12-03，公開號(hào)：cn104403972a，公開日：2015-03-11)報(bào)道了從健康家禽的消化道分離出的一株凝結(jié)芽孢桿菌可以降低白羽肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)和氨態(tài)氮濃度，提高盲腸微生物多樣性指數(shù)，降低死淘率和料重比，提高肉雞的日增重；專利枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法與應(yīng)用(申請(qǐng)?zhí)枺?01210139547.0，申請(qǐng)日：2012-05-08，公開號(hào)：cn102660534a，公開日：2012-09-12)報(bào)道了枯草芽孢桿菌制劑經(jīng)口服途徑(飲水或拌料)飼喂畜禽后，具有改善消化功能，提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。

目前有關(guān)芽孢桿菌在提高獺兔生長(zhǎng)性能的方法未見(jiàn)專利報(bào)道。關(guān)于利用獺兔源高產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶的芽孢桿菌活菌制劑飼喂獺兔，提高飼料轉(zhuǎn)化率和腸道酶活、降低料重比、提高獺兔生長(zhǎng)性能的方法，也尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和專利報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)上述的問(wèn)題，提供了一種獺兔源枯草芽孢桿菌及其在提高獺兔生長(zhǎng)性能中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開了一種獺兔源枯草芽孢桿菌，該菌株已于2017年5月31日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)，武漢大學(xué)保藏中心，430072，保藏號(hào)cctccno：m2017290。

本發(fā)明還公開了一種上述的獺兔源枯草芽孢桿菌在提高獺兔生長(zhǎng)性能中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，在獺兔的基礎(chǔ)日糧中添加枯草芽孢桿菌制劑，枯草芽孢桿菌在每克基礎(chǔ)日糧中的含量為1.0×10⁶～10⁷cfu。

進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌制劑為枯草芽孢桿菌菌粉。

進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌菌粉通過(guò)以下方法制備得到：將冷凍保存的枯草芽孢桿菌bswj2017003在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化后接種到固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72～96h，期間挑取菌落鏡檢，收集菌體，加入載體，65℃烘干制備得到枯草芽孢桿菌菌粉，即為枯草芽孢桿菌制劑。

進(jìn)一步地，所述固體培養(yǎng)基配方：黃豆粉1.3％，玉米粉1.3％，麩皮0.5％，蛋白胨0.3％，葡萄糖2％，牛肉膏0.1％，氯化鈉0.5％，瓊脂1.2％，余量為瓊脂，以上質(zhì)量百分含量為100％，ph6.5-7.5。

進(jìn)一步地，制劑中枯草芽孢桿菌活菌含量為2×10¹⁰cfu/g。

進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌制劑飼料制粒時(shí)添加到獺兔的基礎(chǔ)日糧中。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

本發(fā)明分離得到了一株獺兔源枯草芽孢桿菌，將上述的枯草芽孢桿菌以1.0×10⁶～10⁷cfu/g的劑量添加到飼料中，能夠顯著降低獺兔料重比、提高腸道酶活等。其中，尤以在基礎(chǔ)日糧中添加1.0×10⁶cfu/g和1.0×10⁷cfu/g的枯草芽孢桿菌效果最為顯著。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說(shuō)明

此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明枯草芽孢桿菌bswj201700316srdnapcr產(chǎn)物的電泳圖；

圖2是本發(fā)明不同添加量對(duì)獺兔料重比的影響。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1菌的分離與鑒定

一、菌種的分離

稱取健康獺兔盲腸內(nèi)容物0.5g，加入到裝有49.5ml無(wú)菌生理鹽水的帶玻璃珠的錐形瓶中，搖床震蕩20min，80℃水浴20min，十倍梯度稀釋，將每個(gè)稀釋度各取100μl均勻涂布于nb平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24h后，接種環(huán)挑取疑似芽孢桿菌的單個(gè)菌落在nb平板上反復(fù)劃線純化，直至鏡檢無(wú)雜菌，得到一株能夠提高獺兔生長(zhǎng)性能的菌種，命名為bswj2017003。

二、菌種鑒定

(一)按照“伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)”(第八版)和“常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)”(東秀珠，蔡妙英等編著，北京：科學(xué)出版社，2001.2)中描述的方法，對(duì)菌株bswj2017003進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生理生化特性鑒定，具體結(jié)果如下：

菌株的形態(tài)和生理生化特征：

在nb培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，菌落呈淺黃色，近圓形，表面干燥、無(wú)光澤，有皺褶狀突起，邊緣不整齊。革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈直桿狀，芽孢橢圓中生。

生理生化特征：

明膠液化：+；接觸酶：+；v-p反應(yīng)：+；形成吲哚：﹣；檸檬酸鹽利用：﹣；葡萄糖發(fā)酵：+；葡萄糖產(chǎn)氣：+；木糖產(chǎn)酸：﹣；木糖產(chǎn)氣：+；甘露醇產(chǎn)酸：﹣；甘露醇產(chǎn)氣：+；阿拉伯糖產(chǎn)酸：+；馬尿酸鹽水解：﹣；精氨酸雙水解：﹣；酪素水解：+；酪氨酸水解：﹣；淀粉水解：+；硝酸鹽還原：+；苯丙氨酸脫氫酶：﹣；2％nacl生長(zhǎng)：+；5％nacl生長(zhǎng)：+；7％nacl生長(zhǎng)：+。

(二)16srdna試驗(yàn)

挑取平板上的單菌落，對(duì)其進(jìn)行16srrna菌落pcr鑒定，純化后的pcr產(chǎn)物送北京華大基因測(cè)序，枯草芽孢桿菌bswj201700316srdnapcr產(chǎn)物電泳結(jié)果圖見(jiàn)圖1，測(cè)得的序列seqidno.1。根據(jù)gen-bank序列同源性比較，菌株bswj2017003與bacillussubtilisstraingxs-11(genbank登錄號(hào)ku904283.1)同源性99％，判定該菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。

基于以上特征，將菌株bswj2017003鑒定為bacillussubtilis，其分類命名為bacillussubtilisbswj2017003。該菌株已于2017年5月31日保藏于保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)，武漢大學(xué)保藏中心，430072)，保藏號(hào)cctccno：m2017290。

實(shí)施例2菌種產(chǎn)纖維素、蛋白酶和淀粉酶初選和復(fù)選

1、菌種產(chǎn)纖維素、蛋白酶和淀粉酶初選

1.1產(chǎn)纖維素酶初選

將菌種活化后接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，然后用滴種法移接在cma-na平板上，培養(yǎng)24-48h，采用0.2％的剛果紅染色30min，然后依次用蒸餾水和濃度為1mo/l的氯化鈉洗去染液，再用5％的醋酸溶液固定顏色，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量染色圈直徑和菌落直徑，計(jì)算二者的比值。

1.2產(chǎn)蛋白酶初選

將菌種活化后接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，然后用滴種法移接在酪素平板上，培養(yǎng)24-48h，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量酪素水解圈直徑和菌落直徑，計(jì)算二者的比值。

1.3產(chǎn)蛋白酶初選

將菌種活化后接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，然后用滴種法移接在淀粉平板上，培養(yǎng)24-48h，采用盧戈式碘液染色，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量透明圈直徑和菌落直徑，計(jì)算二者的比值。

產(chǎn)酶初選試驗(yàn)的結(jié)果表明，分離得到的122株菌株中，109株具有產(chǎn)纖維素酶的能力，100株具有產(chǎn)蛋白酶的能力，30株具有產(chǎn)淀粉酶的能力。菌株bswj2017003同時(shí)具有產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶的能力。

2、菌種產(chǎn)纖維素、蛋白酶和淀粉酶復(fù)選

2.1產(chǎn)纖維素酶復(fù)選

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取16支20ml刻度試管，滅菌干燥，按表1配置各種濃度的葡萄糖溶液。(每個(gè)濃度做3個(gè)平行)

表1纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

向上述不同濃度的葡萄糖溶液中分別加入1ml2mol/l氫氧化鈉溶液和2mldns溶液，搖勻后置沸水浴中5min，然后流水冷卻，加蒸餾水定容至20ml。用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)485nm處，以不含葡萄糖的0號(hào)試管為空白對(duì)照，分別測(cè)定其吸光度值。并建立通過(guò)吸光度值求葡萄糖的回歸方程。

2.1.2粗酶液cmc酶活力測(cè)定

將活化的芽孢桿菌菌液接種于種子培養(yǎng)基ⅰ中，37℃培養(yǎng)12h，然后以2％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基ⅰ中，搖床培養(yǎng)160r/min，37℃培養(yǎng)48h，發(fā)酵12h后補(bǔ)加cmc-na。發(fā)酵后離心，收集上清液即為待測(cè)粗酶液。將0.625％cmc-na溶液預(yù)熱至50℃。按以下順序操作：取20ml具塞刻度試管，預(yù)先滅菌干燥，編號(hào)。取粗酶液1.00ml，置于50℃水浴鍋中預(yù)熱2min，加入4ml己預(yù)熱至50℃的0.625％cmc-na溶液，于50℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)5min取出，立即加入lml2mol/l氫氧化鈉溶液和2mldns顯色液，搖勻后樣品管與對(duì)照管都置于沸水浴準(zhǔn)確計(jì)時(shí)5min取出，流水迅速冷卻，加蒸餾水定容至20ml?？瞻讓?duì)照加底物之前置于沸水浴中10min使酶失活，其余操作同上。定容，搖勻，用分光光度計(jì)測(cè)定od485的值。在上述條件下定義為每分鐘每毫升粗酶液產(chǎn)生lμmol葡萄糖為一個(gè)酶活單位(u)。

2.1.3粗酶液濾紙酶活力的測(cè)定

粗酶液的制備方法同2.1.2。

取50mg新華濾紙，加入3ml0.2mol/lph4.6的醋酸緩沖液，加入粗酶液1ml，50℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)60min，加入2mldns，沸水浴5min，冷卻后定容至20ml。空白對(duì)照加底物之前置于沸水浴中10min使酶失活，其余操作同上。定容，搖勻，用分光光度計(jì)測(cè)定od485的值。在上述條件下定義為每分鐘每毫升粗酶液產(chǎn)生lμmol葡萄糖為一個(gè)酶活單位(u)。

2.2產(chǎn)蛋白酶復(fù)選

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取16支20ml刻度試管，滅菌干燥，按表2配置各種濃度的酪氨酸溶液。(每個(gè)濃度做3個(gè)平行)

表2蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取上述不同濃度的酪氨酸溶液各1ml，分別加入5ml0.4mol/ml碳酸鈉溶液和1ml福林試劑溶液，搖勻后置于40℃水浴中反應(yīng)20min，加蒸餾水定容至20ml。用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)660nm處，以不含酪氨酸的0號(hào)試管為空白對(duì)照，分別測(cè)定其吸光度值。并建立通過(guò)吸光度值求酪氨酸的回歸方程。

2.2.2粗酶液蛋白酶活力測(cè)定

將活化的芽孢桿菌菌液接種于種子培養(yǎng)基ⅱ中，37℃培養(yǎng)12h，然后以2％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基ⅱ中，搖床培養(yǎng)160r/min，37℃培養(yǎng)48h，發(fā)酵24h后補(bǔ)加葡萄糖。發(fā)酵后離心，收集上清液即為待測(cè)粗酶液。將2％酪蛋白溶液放入40℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱5min。按以下順序操作：取20ml具塞刻度試管，預(yù)先滅菌干燥，編號(hào)。取粗酶液2.50ml，置于40℃水浴鍋中預(yù)熱2min，加入2.5ml己預(yù)熱至40℃的2％酪蛋白溶液，于40℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10min取出，加入5ml0.4mol/l三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，立即搖勻，取出靜置10min，取濾液1ml，加入5ml0.4mol/l碳酸鈉溶液和1ml福林試劑溶液，混勻后置40℃水浴中20min，加蒸餾水定容至20ml?？瞻讓?duì)照，樣品中先加入三氯乙酸使酶失活，再加入酪蛋白溶液，以后操作步驟同上。用分光光度計(jì)測(cè)定od660的值。在上述條件下定義為每分鐘每毫升粗酶液產(chǎn)生lμmol酪氨酸為一個(gè)酶活單位(u)。

2.3產(chǎn)淀粉酶復(fù)選

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取19支20ml刻度試管，滅菌干燥，按表1配置各種濃度的麥芽糖溶液。(每個(gè)濃度做3個(gè)平行)

表3淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

向上述不同濃度的麥芽糖溶液中分別加入2mldns溶液，搖勻后置沸水浴中5min，然后流水冷卻，加蒸餾水定容至20ml。用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)520nm處，以不含麥芽糖的0號(hào)試管為空白對(duì)照，分別測(cè)定其吸光度值。并建立通過(guò)吸光度值求麥芽糖的回歸方程。

2.3.2粗酶液淀粉酶活力測(cè)定

將活化的芽孢桿菌菌液接種于種子培養(yǎng)基ⅲ中，37℃培養(yǎng)12h，然后以5％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基ⅲ中，搖床培養(yǎng)160r/min，37℃培養(yǎng)48h，發(fā)酵24h后補(bǔ)加碳酸鈣。發(fā)酵后離心，收集上清液即為待測(cè)粗酶液。按以下順序操作：取20ml具塞刻度試管，預(yù)先滅菌干燥，編號(hào)。取粗酶液1.00ml加入2％的可溶性淀粉lml，蒸餾水3ml，于60℃水浴中預(yù)熱5min，加入0.1mol/l檸檬酸緩沖液(ph6.0)lml。于60℃水浴中保溫30min，加入1.5mldns溶液，沸水浴5min，流水迅速冷卻，加蒸餾水定容至20ml?？瞻讓?duì)照加底物之前置于沸水浴中10min使酶失活，其余步驟同上。定容，搖勻，用分光光度計(jì)測(cè)定od520的值。在上述條件下定義為每分鐘每毫升粗酶液產(chǎn)生lμmol麥芽糖為一個(gè)酶活單位(u)。

根據(jù)產(chǎn)酶初選試驗(yàn)結(jié)果，產(chǎn)纖維素酶復(fù)選試驗(yàn)選取染色圈直徑/菌落直徑≥1.90的19株菌株、產(chǎn)蛋白酶復(fù)選試驗(yàn)選取染色圈直徑/菌落直徑＞1.97的31株菌株、產(chǎn)淀粉酶復(fù)選試驗(yàn)選取染色圈直徑/菌落直徑≥1.23的16株菌株進(jìn)行試驗(yàn)。產(chǎn)酶復(fù)選試驗(yàn)的結(jié)果與產(chǎn)酶初選試驗(yàn)結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明菌株bswj2017003具有產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶的能力，且該菌株具有較高的產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶能力。

實(shí)施例3枯草芽孢桿菌菌粉的制備

將冷凍保存的枯草芽孢桿菌bswj2017003在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化后接種到固體培養(yǎng)基(黃豆粉1.3％，玉米粉1.3％，麩皮0.5％，蛋白胨0.3％，葡萄糖2％，牛肉膏0.1％，氯化鈉0.5％，瓊脂1.2％，余量為瓊脂，以上質(zhì)量百分含量為100％，ph6.5-7.5)中培養(yǎng)72～96h，期間挑取菌落鏡檢，當(dāng)形成大量芽孢時(shí)，收集菌體，按1:100的比例加入適量載體(玉米粉等)，65℃烘干制備得到枯草芽孢桿菌菌粉，稀釋法檢測(cè)菌粉活菌數(shù)。

實(shí)施例4枯草芽孢桿菌菌粉在提高獺兔生長(zhǎng)性能中的應(yīng)用

1、動(dòng)物試驗(yàn)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

120只35日齡斷奶獺兔(1000±200g)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成6個(gè)處理組，每個(gè)處理組20只獺兔。第1組為空白對(duì)照組，飼喂不添加抗生素的基礎(chǔ)日糧；第2-6組為枯草芽孢桿菌菌粉試驗(yàn)組，飼料中枯草芽孢桿菌菌粉添加量分別為1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸cfu/g，試驗(yàn)周期為8周，試驗(yàn)時(shí)間為2016年11月-2017年1月?；A(chǔ)日糧配方見(jiàn)表4。參照nutritionoftherabbit(2010第二版)兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制。

表4基礎(chǔ)日糧配方和營(yíng)養(yǎng)成分

注：每公斤飼料中維生素與微量元素含量：mn90mg；zn50mg；fe90mg；cu10mg；i0.4mg；se0.2mg；co0.4mg；va5000iu；vd3500iu；ve10iu；vk0.5mg；vb11.5mg；vb26.0mg；泛酸12mg；煙酸35mg；vb66.0mg；；葉酸0.8mg；vb120.01mg；生物素0.18mg

2、動(dòng)物試驗(yàn)方法

采用疊層籠養(yǎng)，1只/籠。自然通風(fēng)，自由采食和飲水。

3、生長(zhǎng)性能指標(biāo)檢測(cè)

分別在試驗(yàn)期第1、8、15、22、29、36、43、50、57天早上七點(diǎn)空腹稱重，統(tǒng)計(jì)每周采食量，計(jì)算每周和1-8周的日采食量、日增重和料重比指標(biāo)。

4、腸道酶活檢測(cè)

試驗(yàn)第57天，第1組、第3組、第4組、第5組每個(gè)組隨機(jī)選取6只獺兔，無(wú)菌分離出十二指腸、空腸、回腸、盲腸，收集其內(nèi)容物，按上述酶活測(cè)定方法測(cè)定十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物的蛋白酶和淀粉酶活力，以及盲腸內(nèi)容物的cmc酶和濾紙酶活力。一個(gè)酶活單位(u)的定義為每g腸道內(nèi)容物在上述條件下每分鐘產(chǎn)生lμmol底物所需的酶量。

5、統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行one-wayanova分析，以p＜0.05為顯著水平，試驗(yàn)數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

6、結(jié)果分析

6.1、芽孢桿菌產(chǎn)酶初選

表5芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶初選

結(jié)果顯示(表5)，通過(guò)cmc-na平板培養(yǎng)、染色，觀察，測(cè)量，枯草芽孢桿菌bswj2017003產(chǎn)生染色圈，染色圈直徑/菌落直徑比值為1.94。

表6芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶初篩

結(jié)果顯示(表6)，通過(guò)酪素平板培養(yǎng)，觀察，測(cè)量，枯草芽孢桿菌bswj2017003產(chǎn)生透明圈，染色圈直徑/菌落直徑比值為2.00。

表7芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶初篩

結(jié)果顯示(表7)，通過(guò)淀粉平板培養(yǎng)、染色，觀察，測(cè)量，枯草芽孢桿菌bswj2017003產(chǎn)生透明圈，染色圈直徑/菌落直徑比值為1.32。

6.2、芽孢桿菌產(chǎn)酶復(fù)篩

表8芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶復(fù)篩

結(jié)果顯示(表8)，枯草芽孢桿菌bswj2017003的cmc酶、濾紙酶、蛋白酶和淀粉酶活力分別為15.40、2.19、6.56、3.54u/ml。

6.3、枯草芽孢桿菌對(duì)獺兔采食量的影響

表9枯草芽孢桿菌對(duì)獺兔日采食量的影響(g/天)

結(jié)果顯示(表9)，試驗(yàn)各組之間的采食量存在差異，第1、3、5、6、7、8周，1-8周試驗(yàn)組獺兔日采食量低于空白對(duì)照組。

6.4、枯草芽孢桿菌對(duì)獺兔日增重的影響

表10枯草芽孢桿菌對(duì)獺兔日增重的影響(g/天)

注：結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)附不同字母者表示差異顯著(p<0.05)，以下各表同。

結(jié)果顯示(表10)，各組之間的體重差異存在差異，但是與添加枯草芽孢桿菌的劑量之間很難找到明顯的規(guī)律。從試驗(yàn)全程來(lái)看，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組的差異不顯著。

6.5、枯草芽孢桿菌對(duì)獺兔料重比的影響

表11枯草芽孢桿菌對(duì)獺兔料重比的影響

結(jié)果顯示(表11和圖2)，與對(duì)照組相比，除第3周第6組、第4周第6組、第7周第3組的料重比增加外，試驗(yàn)期間，各試驗(yàn)組的料重比都有下降的趨勢(shì)，且第4組的料重比顯著降低；從試驗(yàn)全程來(lái)看，與對(duì)照組相比，第4組、第5組的料重比顯著降低，這表明添加1.0×10⁶cfu/g、1.0×10⁷cfu/g的枯草芽孢桿菌可提高飼料轉(zhuǎn)化率，從而降低料重比。

6.6、枯草芽孢桿菌對(duì)獺兔腸道酶活的影響

表12枯草芽孢桿菌對(duì)獺兔腸道酶活的影響

根據(jù)1-8周料重比的結(jié)果，在第2-6組中選取料重比較小的3個(gè)組(第3組、第4組、第5組)，加上第1組(作為對(duì)照)，共4個(gè)組進(jìn)行后面的試驗(yàn)。

結(jié)果顯示(表12)，與對(duì)照組相比，第3組除十二指腸淀粉酶、空腸蛋白酶、回腸淀粉酶外，其它腸道酶活顯著升高，第4組、第5組的十二指腸、空腸、回腸的蛋白酶和淀粉酶以及盲腸的cmc酶和濾紙酶均顯著升高。這表明添加1.0×10⁶cfu/g和1.0×10⁷cfu/g的枯草芽孢桿菌可顯著改善腸道酶活，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而提高獺兔的生產(chǎn)性能。

綜上所述，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，上述枯草芽孢桿菌以1.0×10⁶～10⁷cfu/g的劑量添加到斷奶獺兔的基礎(chǔ)日糧中，飼喂8周后，獺兔的日料重比顯著增加，腸道酶活顯著升高，促進(jìn)了獺兔對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而提高了獺兔的生長(zhǎng)性能。顯示本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌具有良好的提高獺兔生長(zhǎng)性能的作用，對(duì)獺兔規(guī)?；B(yǎng)殖具有較大的意義。

上述說(shuō)明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省草原科學(xué)研究院

<120>一種獺兔源枯草芽孢桿菌及其在提高獺兔生長(zhǎng)性能中的應(yīng)用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>獺兔源枯草芽孢桿菌

<400>1

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