本發(fā)明屬于魚(yú)類性別分子鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鱧是我國(guó)重要的淡水優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，具有骨刺少、肉鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，有去瘀生新，滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)等功效，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，易于加工，是我國(guó)重要水產(chǎn)品之一，全國(guó)年產(chǎn)量超過(guò)51萬(wàn)噸，是我國(guó)第八大淡水養(yǎng)殖品種，每年苗種需求數(shù)十億尾，市場(chǎng)巨大。鱧是存在顯著雌雄二形性的魚(yú)類，雄性個(gè)體生長(zhǎng)速度是雌性的兩倍，全雄鱧養(yǎng)殖將提高整體生長(zhǎng)速度達(dá)30％，效益非常顯著，同時(shí)促進(jìn)鱧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)，提質(zhì)增效。所以市場(chǎng)迫切需求全雄苗種。而遺傳性別鑒定是開(kāi)展全雄魚(yú)培育的關(guān)鍵技術(shù)，極大加快培育進(jìn)程。

目前我國(guó)江南及華南地區(qū)主要養(yǎng)殖為雜交鱧，黃河及以北主要養(yǎng)殖烏鱧。以烏鱧為父本、斑鱧為母本的斑烏雜交鱧生長(zhǎng)速度快、制種技術(shù)簡(jiǎn)單，苗種市場(chǎng)占有率大，是目前的主要養(yǎng)殖品種。培育超雄斑烏雜交鱧市場(chǎng)前景非常廣闊。斑烏雜交鱧是以烏鱧為父本，所以篩選到烏鱧可直接用于偽雌魚(yú)和超雄魚(yú)鑒定的分子標(biāo)記是技術(shù)關(guān)鍵，將加快全雄斑烏雜交鱧培育速度，具有巨大產(chǎn)業(yè)價(jià)值和科學(xué)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記，該snp標(biāo)記能鑒定烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)。

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記的引物對(duì)，該引物對(duì)能擴(kuò)增待測(cè)樣品的基因組dna，可鑒定遺傳性別，并將偽雌魚(yú)與普通雄魚(yú)后代家系中超雄魚(yú)鑒定出來(lái)。

本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種鑒定烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)的方法，該方法簡(jiǎn)單快速且準(zhǔn)確率高。

本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記在烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明所要解決的上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記，所述snp標(biāo)記為seqidno：1～seqidno：3所示的核苷酸序列的第82位，其堿基為t/t、c/t或c/c。

當(dāng)堿基為t/t純合子時(shí)，樣品為雌性，當(dāng)樣品為c/t雜合時(shí)樣品為雄性；以偽雌魚(yú)和普通雄魚(yú)繁殖后代中，基因型為t/t純合時(shí)為雌性，c/t雜合時(shí)為雄性，c/c純合時(shí)為雄性且為超雄魚(yú)，其中偽雌魚(yú)為雌激素性逆轉(zhuǎn)，基因型為c/t雜合，普通雄魚(yú)基因型為c/t雜合。

具體如下：

雌魚(yú)：

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagtt/cgcataaaaactgctgagctgggctcttcgatgcaatcaggt/tgctggtctcagctcatatacttg

雄魚(yú)：

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagtt/cgcataaaaactgctgagctgggctcttcgatgcaatcaggc/tgctggtctcagctcatatacttg

超雄魚(yú)：

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagtt/cgcataaaaactgctgagctgggctcttcgatgcaatcaggc/cgctggtctcagctcatatacttg

加粗斜體堿基為snp位點(diǎn)，當(dāng)堿基為t/t純合子時(shí)，樣品為雌性，當(dāng)樣品為c/t雜合時(shí)樣品為雄性；以偽雌魚(yú)(雌激素性逆轉(zhuǎn)，基因型為c/t雜合)和普通雄魚(yú)(c/t)繁殖后代中，基因型為t/t純合時(shí)為雌性，c/t雜合時(shí)為雄性，c/c純合時(shí)為雄性且為超雄魚(yú)。

本發(fā)明的所要解決的上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記的引物對(duì)，其包括上游引物對(duì)f和下游引物對(duì)r，所述上游引物對(duì)f的核苷酸序列如seqidno：4所示，其下游引物對(duì)r的核苷酸序列如seqidno：5所示。

上游引物對(duì)f(primerf)：5'agtgtgtgagtttgaggatgtc3'；

下游引物對(duì)r(primerr)：5'caagtatatgagctgagaccag3'。

本發(fā)明的所要解決的上述第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種鑒定烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)烏鱧的基因組dna；

(2)以待測(cè)烏鱧的基因組dna為模板，利用上述上游引物對(duì)f和下游引物對(duì)r，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線收集；

(3)反應(yīng)完成后進(jìn)行分析，確定樣品基因型，鑒定性別。

在上述鑒定烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)的方法中：

步驟(2)中pcr擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)采用的反應(yīng)體系為20μl，包括：abimeltdoctormix10μl，primerf0.6μl，primerr0.6μl，dna模板1μl，無(wú)菌水7.8μl。

步驟(2)中pcr擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃2min，95℃10min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括95℃15s，58℃1min；然后95℃解鏈15s，60℃1min后以0.3℃/s速度升溫至95℃，同時(shí)收集熒光信號(hào)，最后60℃保持15s結(jié)束。

步驟(3)中利用hrm軟件選擇75℃～77.5℃區(qū)間進(jìn)行熔解曲線分型分析，確定樣品基因型，鑒定性別。

本發(fā)明的所要解決的上述第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：上述的可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記在烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)利用本發(fā)明提供的引物擴(kuò)增待測(cè)樣品的基因組dna，再通過(guò)基于熒光定量pcr儀的高分辨率熔解曲線分析，可鑒定遺傳性別，基因型與表型的一致性為98％，家系中準(zhǔn)確率100％，并能將偽雌魚(yú)與普通雄魚(yú)后代家系中超雄魚(yú)鑒定出來(lái)；

(2)本發(fā)明鑒定方法整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在一天內(nèi)完成，簡(jiǎn)單快速且準(zhǔn)確率高；

(3)本發(fā)明的snp位點(diǎn)和檢測(cè)方法是目前唯一能夠?qū)貅k同時(shí)進(jìn)行普通性別鑒定和超雄魚(yú)鑒定的分子標(biāo)記方法。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例3中利用hrm軟件對(duì)不同性別烏鱧進(jìn)行基因分型。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供的可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記，該snp標(biāo)記為seqidno：1～seqidno：3(分別對(duì)應(yīng)snp標(biāo)記1、snp標(biāo)記2、snp標(biāo)記3)所示的核苷酸序列的第82位，其堿基為t/t、c/t或c/c。

具體如下：

雌魚(yú)：

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagtt/cgcataaaaactgctgagctgggctcttcgatgcaatcaggt/tgctggtctcagctcatatacttg

雄魚(yú)：

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagtt/cgcataaaaactgctgagctgggctcttcgatgcaatcaggc/tgctggtctcagctcatatacttg

超雄魚(yú)：

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagtt/cgcataaaaactgctgagctgggctcttcgatgcaatcaggc/cgctggtctcagctcatatacttg。

加粗斜體堿基為snp位點(diǎn)，當(dāng)堿基為t/t純合子時(shí)，樣品為雌性，當(dāng)樣品為c/t雜合時(shí)樣品為雄性；以偽雌魚(yú)(雌激素性逆轉(zhuǎn)，基因型為c/t雜合)和普通雄魚(yú)(c/t)繁殖后代中，基因型為t/t純合時(shí)為雌性，c/t雜合時(shí)為雄性，c/c純合時(shí)為雄性且為超雄魚(yú)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供的可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記的引物對(duì)，其包括上游引物對(duì)f和下游引物對(duì)r，其中上游引物對(duì)f的核苷酸序列如seqidno：4所示，下游引物對(duì)r的核苷酸序列如seqidno：5所示。

具體為：

上游引物對(duì)f(primerf)：5'agtgtgtgagtttgaggatgtc3'；

下游引物對(duì)r(primerr)：5'caagtatatgagctgagaccag3'。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供的鑒定烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)的方法，包括以下步驟：

(1)樣品dna提取

提取樣品的基因組dna可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段提取，包括酚-氯仿法和各種dna提取試劑盒，提取總dna后用無(wú)菌水稀釋至20ngμl。

(2)利用以下引物擴(kuò)增包含snp位點(diǎn)的序列：

引物為(序列中下劃線部分)：

primerf：5'agtgtgtgagtttgaggatgtc3'

primerr：5'caagtatatgagctgagaccag3'

擴(kuò)增序列為：

雌魚(yú)：

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagtt/cgcataaaaactgctgagctgggctcttcgatgcaatcaggt/tgctggtctcagctcatatacttg

雄魚(yú)：

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagtt/cgcataaaaactgctgagctgggctcttcgatgcaatcaggc/tgctggtctcagctcatatacttg

超雄魚(yú)：

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagtt/cgcataaaaactgctgagctgggctcttcgatgcaatcaggc/cgctggtctcagctcatatacttg。

加粗斜體堿基為snp位點(diǎn)，當(dāng)堿基為t/t純合子時(shí)，樣品為雌性，當(dāng)樣品為c/t雜合時(shí)樣品為雄性；以偽雌魚(yú)(雌激素性逆轉(zhuǎn)，基因型為c/t雜合)和普通雄魚(yú)(c/t)繁殖后代中，基因型為t/t純合時(shí)為雌性，c/t雜合時(shí)為雄性，c/c純合時(shí)為雄性且為超雄魚(yú)。

(3)pcr擴(kuò)增和高分辨率熔解曲線分析

將樣品dna模板、primerf、primerr、meltdoctormastermix按說(shuō)明書(shū)規(guī)定準(zhǔn)備反應(yīng)混合液，再將反應(yīng)板在steponeplus實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增和熔解曲線收集，反應(yīng)完成后利用hrm軟件進(jìn)行分析，確定樣品基因型，從而鑒定性別。

其中pcr反應(yīng)體系為20μl，包括：

abimeltdoctormix10μl，primerf0.6μl，primerr0.6μl，dna模板1μl，無(wú)菌水7.8μl。反應(yīng)在定量pcr專用96孔板中進(jìn)行，高透光封板模覆蓋密封。

擴(kuò)增和檢測(cè)條件為：

按上述反應(yīng)體系配制好試劑后，將反應(yīng)板置于abisteponeplus實(shí)時(shí)定量pcr儀中，設(shè)置以下程序：50℃2min，95℃10min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括95℃15s，58℃1min；然后95℃解鏈15s，60℃1min后以0.3℃/s速度升溫至95℃，同時(shí)收集熒光信號(hào)，最后60℃保持15s結(jié)束。

(4)使用儀器為abisteponeplus進(jìn)行pcr擴(kuò)增和信號(hào)收集，反應(yīng)結(jié)束后利用儀器軟件stepone2.3進(jìn)行初步分析，保存文件；再利用abi高分辨率熔解曲線分析軟件hrm打開(kāi)上述保存的文件，選擇75℃～77.5℃區(qū)間進(jìn)行熔解曲線分型。

結(jié)果：利用hrm分析后，樣品的基因型即可鑒別，如圖1中所示，其中variant1為(t/c)雜合型，鑒定為雄魚(yú)；variant2為(tt)純合型，鑒定為雌魚(yú)，variant3為(cc)純合型，鑒定為超雄魚(yú)。

應(yīng)用實(shí)施例一

利用上述snp標(biāo)記的引物和檢測(cè)方法對(duì)烏鱧100尾親魚(yú)(已繁殖，生理性別確定，其中雌魚(yú)50尾，雄魚(yú)50尾)進(jìn)行性別驗(yàn)證。

(1)將試驗(yàn)魚(yú)剪取鰭條提取基因組dna

利用酒精消毒的剪刀剪取烏鱧部分尾鰭約0.5×0.5cm，放入無(wú)水乙醇保存，常溫下帶回實(shí)驗(yàn)室；將無(wú)水乙醇保存的鰭條樣品用無(wú)菌雙蒸水洗去酒精，利用omega動(dòng)物組織dna提取試劑盒提取基因組dna；提取的dna經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dna的完整性，nanoq^tm微型分光光度計(jì)(博奧)檢測(cè)濃度，并用去離子水稀釋至終濃度20ng/μl。

(2)配制hrm分型反應(yīng)混合液

abimeltdoctormix10μl，primerf0.6μl，primerr0.6μl，dna模板1μl無(wú)菌水7.8μl。反應(yīng)在abisteponeplus定量pcr專用96孔板中進(jìn)行，高透光封板模覆蓋密封。

(3)上機(jī)檢測(cè)

使用abisteponeplus實(shí)時(shí)定量pcr儀，軟件為stepone2.3，參數(shù)按說(shuō)明書(shū)設(shè)置，運(yùn)行程序?yàn)?0℃2min，95℃10min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括95℃15s，58℃1min；然后95℃解鏈15s，60℃1min后以0.3℃/s速度升溫至95℃，同時(shí)收集熒光信號(hào)，最后60℃保持15s結(jié)束。

(4)結(jié)果

經(jīng)過(guò)程序運(yùn)行完畢后，利用stepone2.3軟件初步分析，保存文件。再將保存的文件用hrm3.0.1軟件打開(kāi)，選擇溫度區(qū)間進(jìn)行分析，50尾雌性親魚(yú)個(gè)體中tt基因型50尾；50尾生理雄性個(gè)體中t/c基因型為48尾，tt型2尾。

應(yīng)用實(shí)施例二

利用上述snp標(biāo)記的引物和檢測(cè)方法對(duì)同一家系烏鱧200尾幼魚(yú)(家系母本為雌激素性逆轉(zhuǎn)魚(yú)，且經(jīng)鑒定為t/c基因型；父本為普通雄魚(yú)，經(jīng)鑒定為t/c基因型)，進(jìn)行基因型鑒定。

(1)dna提取、生理性別鑒定、pcr擴(kuò)增及hrm分型方法均與應(yīng)用實(shí)施例一相同。

(2)結(jié)果經(jīng)過(guò)hrm軟件分型，200尾個(gè)體中t/c基因型103尾，t/t基因型51尾；c/c基因型為46尾，符合后代中普通雄魚(yú)、超雄魚(yú)和雌魚(yú)的2:1:1的預(yù)期，說(shuō)明本發(fā)明的標(biāo)記可同時(shí)用于三種魚(yú)的鑒定。

上實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以上實(shí)施例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。

〈110〉中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所

〈120〉一種可用于烏鱧遺傳性別和超雄魚(yú)鑒定的snp標(biāo)記及其應(yīng)用

〈210〉1

〈211〉106

〈212〉dna

〈223〉snp標(biāo)記1

〈400〉1

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagttcgcataaaaactgctgagct60

gggctcttcgatgcaatcaggttgctggtctcagctcatatacttg106

〈210〉2

〈211〉106

〈212〉dna

〈223〉snp標(biāo)記2

〈400〉2

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagttcgcataaaaactgctgagct60

gggctcttcgatgcaatcaggctgctggtctcagctcatatacttg106

〈210〉3

〈211〉106

〈212〉dna

〈223〉snp標(biāo)記3

〈400〉3

cagtgtgtgagtttgaggatgtcaacaaatgcataaagttcgcataaaaactgctgagct60

gggctcttcgatgcaatcaggccgctggtctcagctcatatacttg106

〈210〉4

〈211〉22

〈212〉dna

〈223〉上游引物對(duì)f

〈400〉4

agtgtgtgagtttgaggatgtc22

〈210〉5

〈211〉22

〈212〉dna

〈223〉下游引物對(duì)r

〈400〉5

caagtatatgagctgagaccag22