本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種高效秈稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，本發(fā)明適用于誘導(dǎo)和繼代秈稻成熟種子的愈傷組織，以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

水稻(oryzasatival.)是我國最重要的糧食作物之一，分為秈稻和粳稻兩大亞種，其中秈稻是我國最大的栽培稻類型，栽培面積約占全國水稻面積的74％。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對水稻品種進行改良，培養(yǎng)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、廣適的新品種在保障全球糧食安全的同時也是今后水稻育種的發(fā)展方向。因此，水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，尤其是秈稻的遺傳轉(zhuǎn)化在品種改良、基因功能檢測、創(chuàng)造突變體中發(fā)揮著越來越重要的作用，而建立高效、穩(wěn)定的秈稻遺傳轉(zhuǎn)化體系是分子育種和功能基因組學(xué)等領(lǐng)域研究的前提。

近年來，水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)取得了重要突破，并大部分在粳稻中建立了快速、高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。在此基礎(chǔ)上，已經(jīng)將許多重要性狀如抗蟲、抗病、抗逆、品質(zhì)改良、發(fā)育調(diào)控、營養(yǎng)高效利用等外源基因轉(zhuǎn)入水稻中。然而對于種植面積較大的秈稻而言，由于基因型的差異導(dǎo)致其組織培養(yǎng)特性普遍較差，轉(zhuǎn)化難度明顯大于粳稻。近幾年來利用土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化秈稻也取得了一些成功，但是至今尚未建立一套像粳稻那樣較為穩(wěn)定的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。

已有研究表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化效率與受體基因型的愈傷組織狀態(tài)、培養(yǎng)基、感染方式等因素有關(guān)。因此，通過優(yōu)化秈稻遺傳轉(zhuǎn)化各階段的參數(shù)，有望建立高效秈稻遺傳轉(zhuǎn)化體系。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高效秈稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法所獲得的愈傷組織質(zhì)量好，適合轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化操作流程簡便，轉(zhuǎn)化率較高，所測試的2個秈稻品種都獲得了成功，轉(zhuǎn)化效率在35％-40％之間。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種高效秈稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

(1)愈傷組織的誘導(dǎo)

選取成熟良好、完整的秈稻種子的米粒，先用75％的酒精消毒3分鐘，再浸泡于25％(v/v)的次氯酸鈉溶液，并置于150rpm、25℃的搖床上消毒20分鐘；在超凈工作臺上，將上述消毒后的種子用無菌水洗滌4-5次，然后轉(zhuǎn)移至無菌濾紙上吸干水分，再將適量的種子接種于nb培養(yǎng)基，在28-30℃下光照培養(yǎng)8-10天，誘導(dǎo)愈傷組織；

(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)

在步驟(1)所述愈傷組織中挑選結(jié)構(gòu)致密、顏色鮮亮、顆粒狀的愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)培養(yǎng)基中，于28-30℃下光照培養(yǎng)3天用于轉(zhuǎn)化；

(3)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

將含有目的基因的植物表達載體通過電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌eha105，選取陽性菌株劃線于yeb抗性平板，28℃暗培養(yǎng)3天，再用接種針刮取米粒大小的農(nóng)桿菌震蕩懸浮于裝有70ml農(nóng)桿菌浸染液的150ml三角瓶中，并置于150rpm、28℃的搖床上搖10分鐘，然后將步驟(2)所述光照培養(yǎng)3天的秈稻愈傷組織浸泡于上述農(nóng)桿菌浸染液中，在150rpm、28℃的搖床上搖10分鐘；

(4)農(nóng)桿菌與愈傷組織的共培養(yǎng)

將步驟(3)所述浸染后的秈稻愈傷組織置于無菌濾紙上吹干，然后將所述愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)基平板預(yù)先墊一張無菌濾紙，用1ml的農(nóng)桿菌浸染液打濕，并除去氣泡，28℃暗培養(yǎng)3天；

(5)抗性愈傷組織的篩選

將步驟(4)所述共培養(yǎng)3天后的愈傷組織置于250ml三角瓶中，用無菌水洗滌4-5次，直至洗滌液清澈透明為止；然后加入過濾滅菌的500mg/l的羧芐青霉素溶液洗滌所述愈傷組織，室溫置于搖床150rpm震蕩洗滌15min，再將所述愈傷組織置于無菌濾紙上吸干水分，接種于含有相應(yīng)篩選劑的篩選培養(yǎng)基上篩選，所述篩選培養(yǎng)的條件為28℃、光照培養(yǎng)20-22天，中間繼代一次，直到長出抗性愈傷組織；

(6)抗性愈傷組織的分化

將步驟(5)所述篩選后得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入含有篩選劑的分化培養(yǎng)基上，于28℃、光照培養(yǎng)18-23天，中間繼代一次，使其再生綠苗；

(7)再生苗的生根

將步驟(6)所述分化培養(yǎng)基上長出的幼苗轉(zhuǎn)入含有篩選劑的生根培養(yǎng)基中，30℃、光照培養(yǎng)10-12天，獲得再生苗。

步驟(1)中所述的nb培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+瓊脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph為5.8。

步驟(2)中所述的預(yù)培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+瓊脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l+乙酰丁香酮0.1mm，ph為5.8。

步驟(3)中所述的農(nóng)桿菌浸染液組分為：aa無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+蔗糖68.5g/l+葡萄糖36.0g/l+谷氨酰胺0.9g/l+天冬酰胺0.3g/l+精氨酸0.176g/l，ph為5.2；使用前加入乙酰丁香酮0.1mm。

步驟(4)中所述的共培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.3g/l+蔗糖30.0g/l+葡萄糖10.0g/l+瓊脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph為5.2，滅菌后加入乙酰丁香酮0.1mm。

步驟(5)中所述的篩選培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+谷氨酰胺0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph為5.8；滅菌后加入羧芐青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

步驟(6)中所述的分化培養(yǎng)基組分為：ms無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+山梨醇30g/l+植物凝集素4.0g/l+naa0.02mg/l+kinetin2mg/l，ph為5.8；滅菌后加入羧芐青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

步驟(7)中所述的生根培養(yǎng)基組分為：ms無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l，ph為5.8；滅菌后加入羧芐青霉素400mg/l。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明對2個秈稻代表性品種秈型兩系不育系628s和秈型兩系恢復(fù)系2537進行農(nóng)桿菌eha105介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率高均在35％以上；本方法誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)好，適合轉(zhuǎn)化，整個轉(zhuǎn)化操作流程周期較短。

附圖說明

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。

圖1為本發(fā)明中秈型兩系恢復(fù)系2537(a)和秈型兩系不育系628s(b)成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織；

圖2為本發(fā)明中秈型兩系恢復(fù)系2537(a)和秈型兩系不育系628s(b)愈傷組織預(yù)培養(yǎng)；

圖3為本發(fā)明中秈型兩系恢復(fù)系2537(a)和秈型兩系不育系628s(b)篩選10天的愈傷組織；

圖4為本發(fā)明中秈型兩系恢復(fù)系2537(a)和秈型兩系不育系628s(b)分化10天的愈傷組織；

圖5為本發(fā)明中秈型兩系恢復(fù)系2537(a)和秈型兩系不育系628s(b)分化后產(chǎn)生的幼苗進行生根培養(yǎng)；

圖6為本發(fā)明中秈型兩系恢復(fù)系2537(a)和秈型兩系不育系628s(b)部分t0代植株葉片的gus染色鑒定；

圖7為本發(fā)明中秈型兩系恢復(fù)系2537(a)和秈型兩系不育系628s(b)部分t0代植株潮霉素基因的pcr檢測電泳圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

(1)愈傷組織的誘導(dǎo)

選取成熟良好、完整的秈稻品種秈型兩系恢復(fù)系2537的米粒，先用75％的酒精消毒3分鐘，再浸泡于25％(v/v)的次氯酸鈉溶液，置于150rpm、25℃的搖床上消毒20分鐘；消毒后的種子在超凈工作臺用無菌水洗滌5次，然后用無菌濾紙吸干水分，再將種子接種于nb培養(yǎng)基；在28℃-30℃下光照培養(yǎng)8天，誘導(dǎo)愈傷組織(圖1a)，其中，nb培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+瓊脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph為5.8。

(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)

挑選結(jié)構(gòu)致密、顏色鮮亮、顆粒狀的愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)培養(yǎng)基中，于28℃-30℃下光照培養(yǎng)3天，用于轉(zhuǎn)化(圖2a)，其中，預(yù)培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+瓊脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l+乙酰丁香酮0.1mm，ph為5.8。

(3)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

含有目的基因的植物表達載體通過電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入eha105，將轉(zhuǎn)化后的陽性eha105農(nóng)桿菌菌株劃線于yeb抗性平板，28℃暗培養(yǎng)3天，再用接種針刮取米粒大小的農(nóng)桿菌，震蕩懸浮于裝有70ml農(nóng)桿菌浸染液的150ml三角瓶中，置于150rpm、28℃的搖床上搖10分鐘；同時，將預(yù)培養(yǎng)3天后的愈傷組織浸泡于農(nóng)桿菌浸染液中，150rpm、28℃的搖床上搖10分鐘；其中，農(nóng)桿菌浸染液組分為：aa無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+蔗糖68.5g/l+葡萄糖36.0g/l+谷氨酰胺0.9g/l+天冬酰胺0.3g/l+精氨酸0.176g/l，ph為5.2；使用前加入乙酰丁香酮0.1mm。

(4)農(nóng)桿菌與愈傷組織的共培養(yǎng)

將浸染后的愈傷組織置于無菌濾紙上吸干水分備用。共培養(yǎng)基平板上墊一張無菌濾紙，然后用1ml的農(nóng)桿菌浸染液打濕，并除去氣泡，然后將預(yù)先吸干水分的愈傷組織轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)3天；其中，共培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.3g/l+蔗糖30.0g/l+葡萄糖10.0g/l+瓊脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph為5.2，滅菌后加入乙酰丁香酮0.1mm。

(5)抗性愈傷組織的篩選

將共培養(yǎng)3天后的愈傷組織置于250ml三角瓶中，用無菌水洗滌4次，直至洗滌液清澈透明為止。加入過濾滅菌的500mg/l的羧芐青霉素溶液洗滌愈傷組織，室溫置于搖床150rpm震蕩洗滌15min，再將愈傷組織置于無菌濾紙上吸干水分，接種于含有相應(yīng)篩選劑的篩選培養(yǎng)基上篩選；篩選培養(yǎng)的條件為28℃，光照培養(yǎng)20天，每10天繼代一次，直到長出抗性愈傷組織(圖3a)，其中，篩選培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+谷氨酰胺0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph為5.8；滅菌后加入羧芐青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

(6)抗性愈傷組織的分化

將篩選后得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入含有篩選劑的分化培養(yǎng)基上，于28℃，光照培養(yǎng)20天，每10天繼代一次，使其再生綠苗(圖4a)，其中，分化培養(yǎng)基組分為：ms無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+山梨醇30g/l+植物凝集素4.0g/l+naa0.02mg/l+kinetin2mg/l，ph為5.8；滅菌后加入羧芐青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

(7)再生苗的生根

將分化培養(yǎng)上長出的幼苗轉(zhuǎn)入含有篩選劑的生根培養(yǎng)基中，30℃，光照培養(yǎng)10天，獲得再生苗；其中，生根培養(yǎng)基組分為：ms無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l，ph為5.8；滅菌后加入羧芐青霉素400mg/l。

實施例2

(1)選取成熟良好、完整的秈稻品種628s的米粒，先用75％的酒精消毒3分鐘，再浸泡于25％(v/v)的次氯酸鈉溶液，并置于150rpm、25℃的搖床上消毒20分鐘。消毒后的種子在超凈工作臺用無菌水洗滌5次，然后用無菌濾紙上吸干水分，再將種子接種于nb培養(yǎng)基。在28℃～30℃下光照培養(yǎng)10天，誘導(dǎo)愈傷組織(圖1b)；nb培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+瓊脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph為5.8。。

(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)

挑選結(jié)構(gòu)致密、顏色鮮亮、顆粒狀的愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)培養(yǎng)基中，于28℃-30℃下光照培養(yǎng)3天，用于轉(zhuǎn)化(圖2b)；預(yù)培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+瓊脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l+乙酰丁香酮0.1mm，ph為5.8。

(3)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

含有目的基因的植物表達載體通過電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入eha105。將轉(zhuǎn)化后的陽性eha105菌株劃線于yeb抗性平板，28℃暗培養(yǎng)3天，再用接種針刮取米粒大小的農(nóng)桿菌，震蕩懸浮于裝有70ml農(nóng)桿菌浸染液的150ml三角瓶中，置于150rpm、28℃的搖床上搖10分鐘；同時，將預(yù)培養(yǎng)3天后的秈稻愈傷組織浸泡于農(nóng)桿菌浸染液中，150rpm、28℃的搖床上搖10分鐘；農(nóng)桿菌浸染液組分為：aa無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+蔗糖68.5g/l+葡萄糖36.0g/l+谷氨酰胺0.9g/l+天冬酰胺0.3g/l+精氨酸0.176g/l，ph為5.2；使用前加入乙酰丁香酮0.1mm。

(4)農(nóng)桿菌與愈傷組織的共培養(yǎng)

將浸染后的愈傷組織置于無菌濾紙上吸干水分備用。共培養(yǎng)基平板上墊一張無菌濾紙，然后用1ml的農(nóng)桿菌浸染液打濕，并除去氣泡，然后將預(yù)先吸干水分的愈傷組織轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)3天；共培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.3g/l+蔗糖30.0g/l+葡萄糖10.0g/l+瓊脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph為5.2，滅菌后加入乙酰丁香酮0.1mm。

(5)抗性愈傷組織的篩選

將共培養(yǎng)3天后的愈傷組織置于250ml三角瓶中，用無菌水洗滌4次，直至洗滌液清澈透明為止。加入過濾滅菌的500mg/l的羧芐青霉素溶液洗滌愈傷組織，室溫置于搖床150rpm震蕩洗滌15min，再將愈傷組織置于無菌濾紙上吸干水分，接種于含有相應(yīng)篩選劑的篩選培養(yǎng)基上篩選。篩選培養(yǎng)的條件為28℃，光照培養(yǎng)22天，每11天繼代一次，直到長出抗性愈傷組織(圖3b)；篩選培養(yǎng)基組分為：n6無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+谷氨酰胺0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph為5.8；滅菌后加入羧芐青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

(6)抗性愈傷組織的分化

將篩選后得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入含有篩選劑的分化培養(yǎng)基上，于28℃，光照培養(yǎng)18天，每9天繼代一次，使其再生綠苗(圖4b)；分化培養(yǎng)基組分為：ms無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+山梨醇30g/l+植物凝集素4.0g/l+naa0.02mg/l+kinetin2mg/l，ph為5.8；滅菌后加入羧芐青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

(7)再生苗的生根

將分化培養(yǎng)上長出的幼苗轉(zhuǎn)入含有篩選劑的生根培養(yǎng)基中，30℃，光照培養(yǎng)12天，獲得再生苗(圖5b)；生根培養(yǎng)基組分為：ms無機鹽和有機物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l，ph為5.8；滅菌后加入羧芐青霉素400mg/l。

在實施例1中，本發(fā)明對秈稻品種秈型兩系恢復(fù)系2537愈傷組織進行轉(zhuǎn)化，將63個轉(zhuǎn)化愈傷組織進行潮霉素抗性篩選，并對t0代植株葉片進行g(shù)us染色(圖6a)和pcr檢測(圖7a)，最終得到24個陽性轉(zhuǎn)基因植株，其轉(zhuǎn)化效率達到了38.1％。

在實施例2中，本發(fā)明對秈型兩系不育系628s愈傷組織進行轉(zhuǎn)化，將54個轉(zhuǎn)化愈傷組織進行潮霉素抗性篩選，并對t0代植株葉片進行g(shù)us染色(圖6b)和pcr檢測(圖7b)，最終得到20個陽性轉(zhuǎn)基因植株，其轉(zhuǎn)化效率達到了37.04％。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。