本發(fā)明涉及體外核酸檢測(cè)，尤其是涉及采用熒光定量pcr(fq-pcr)技術(shù)用于檢測(cè)cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態(tài)性的引物、探針及檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：cyp2c19是一種十分重要的藥物代謝酶，人cyp2c19基因位于10號(hào)染色體上，長(zhǎng)約90.21kb，含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。cyp2c19遺傳多態(tài)性可導(dǎo)致酶活性的個(gè)體差異，從而產(chǎn)生血藥濃度的個(gè)體差異。臨床上大約2％的藥物都由cyp2c19催化代謝，包括氯吡格雷、s-美芬妥英、奧美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等藥物的代謝。cyp2c19遺傳變異導(dǎo)致的個(gè)體差異，使人群出現(xiàn)超快代謝者(ultrarapidmetabolizer，um)、快代謝者(extensivemetabolizer，em)、中間代謝者(intermediatemetabolizer，im)和慢代謝者(poormetabolizer，pm)4種表型。cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)是中國(guó)人群中存在的2種導(dǎo)致cyp2c19酶缺陷的主要等位基因。cyp2c19*2導(dǎo)致剪接缺失，cyp2c19*3為終止密碼子突變。em個(gè)體只攜帶cyp2c19*1等位基因，im個(gè)體攜帶cyp2c19*2或cyp2c19*3雜合子基因型；pm個(gè)體包括cyp2c19*2/*2、cyp2c19*2/*3和cyp2c19*3/*3基因型。東方人群中75％～85％的pm由cyp2c19*2所致，約20％～25％的pm由cyp2c19*3所致。目前常用的基因分型方法大致可分為三類：一是基于凝膠電泳的技術(shù)，如pcr反應(yīng)結(jié)合限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(rflp)，多重pcr，等位基因特異性擴(kuò)增等；二是基于熒光標(biāo)記雜交反應(yīng)的基因分型技術(shù)，包括寡核苷酸連接分析，焦磷酸法dna測(cè)序，直接雜合子測(cè)序以及等位基因特異性引物延伸等。以上二種方法都是在pcr擴(kuò)增反應(yīng)之后，再采取不同的方法檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)。三是基因芯片技術(shù)，基因芯片是通過(guò)微加工技術(shù)，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)、乃至百萬(wàn)計(jì)的特定序列的dna片段(基因探針)，有規(guī)律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維dna探針陣列，利用這類芯片與標(biāo)記的生物樣品進(jìn)行雜交，可對(duì)樣品的基因表達(dá)譜生物信息進(jìn)行快速定性和定量分析。基因芯片技術(shù)由于高通量等優(yōu)點(diǎn)在snp檢測(cè)中得到大量應(yīng)用，但也存在檢測(cè)時(shí)條件難以控制、重復(fù)性差，準(zhǔn)確性低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果、靈敏度較低等缺點(diǎn)。此外，還有磁珠/pcr熒光探針?lè)?、怛溫?cái)U(kuò)增法、pcr溶解曲線法、pcr+導(dǎo)流雜交法等方法。上述各種方法都具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)及適用性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態(tài)性檢測(cè)的引物。本發(fā)明的第二目的在于提供一種用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態(tài)性檢測(cè)的探針。本發(fā)明的第三目的在于提供一種用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態(tài)性檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒。所述用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態(tài)性檢測(cè)的引物如下：cyp2c19*2(rs4244285)-f:5’-ccagagcttggcatattgtatct-3’cyp2c19*2(rs4244285)-r:5’-tgtccatcgattcttggtgttct-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-tctgctccattattttccagaaacg-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-cttcagggcttggtcaatatagaat-3’。所述用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態(tài)性檢測(cè)的特異識(shí)別探針序列及標(biāo)記熒光染料如下：fam-5’-tgattatttcccgggaacccataac-3’bhq1hex-5’-tgattatttcccaggaacccataactt-3’-bhq1rox-5’-caccccctggatccaggta-3’bhq2cy5-5’-caccccctgaatccaggtaag’-bhq2。根據(jù)cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態(tài)基因序列設(shè)計(jì)標(biāo)記的不同熒光染料的特異識(shí)別探針對(duì)，探針可以針對(duì)cyp2c19基因多態(tài)性位點(diǎn)特異識(shí)別，可通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)判斷樣本的基因型。所述用于基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態(tài)檢測(cè)試劑盒，采用四種不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)指示四個(gè)目標(biāo)片段(snp位點(diǎn)上rs4244285的g型基因和a型基因、rs4986893的g型基因和a型基因)的存在情況，且在反應(yīng)條件下無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。所述用于基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態(tài)檢測(cè)試劑盒包括反應(yīng)體系(pcrmix)：10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，(1.5～3.0)mmol/lmgcl2，2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶，1μmol/l引物及標(biāo)記探針；陰性對(duì)照：滅菌超純水。本發(fā)明采用熒光定量pcr(fq-pcr)技術(shù)檢測(cè)cyp2c19基因rs4244285和rs4986893多態(tài)性。fq-pcr的工作原理是利用taq酶的5’→3’外切酶活性，在pcr反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記的探針。該探針可與引物包含序列內(nèi)的dna模板發(fā)生特異性雜交，探針的5’端標(biāo)以熒光報(bào)告基團(tuán)，靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。當(dāng)探針保持完整時(shí)，5’端熒光報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)出的熒光信號(hào)被3’端淬滅基因吸收或抑制，不出現(xiàn)熒光信號(hào)變化。當(dāng)pcr反應(yīng)體系中有目的基因存在，就會(huì)擴(kuò)增出特異核酸片段，熒光探針即會(huì)根據(jù)堿基配對(duì)的原理與之雜交。當(dāng)pcr進(jìn)入延伸(復(fù)制)期，tap酶從引物3’端開(kāi)始,隨新鏈延伸沿dna模板移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到探針結(jié)合的位置時(shí)，其5’→3’端外切酶活性作用，將探針切斷(切口平移效應(yīng))。熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)間的能量傳遞結(jié)構(gòu)被破壞，淬滅基團(tuán)的淬滅作用被解除，熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)釋放出來(lái)。pcr反應(yīng)每復(fù)制一個(gè)特異核酸片段，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放。不同的等位基因探針由于標(biāo)記的熒光染料不同，因此所發(fā)熒光信號(hào)不同，可通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)判斷樣本的基因型。本發(fā)明采用fq-pcr技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，利用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針實(shí)現(xiàn)單管封閉同時(shí)檢測(cè)樣品中cyp2c19基因rs4244285和rs4986893同時(shí)存在的四種基因型，克服
背景技術(shù)：
中的各種缺陷，具有檢測(cè)結(jié)果直觀、快速、準(zhǔn)確、高通量、低成本、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為采用純水為陰性對(duì)照時(shí)，fam(465-510nm)檢測(cè)頻道無(wú)擴(kuò)增曲線。圖2為采用純水為陰性對(duì)照時(shí)，hex(533-580nm)檢測(cè)頻道無(wú)擴(kuò)增曲線。圖3為采用純水為陰性對(duì)照時(shí)，rox(533-610nm)檢測(cè)頻道無(wú)擴(kuò)增曲線。圖4為采用純水為陰性對(duì)照時(shí)，cy5(618-660nm)檢測(cè)頻道無(wú)擴(kuò)增曲線。圖5為采用rs4244285的g型基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作對(duì)照，fam檢測(cè)頻道有一條擴(kuò)增曲線。圖6為采用rs4244285的g型基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作對(duì)照，hex檢測(cè)通道無(wú)擴(kuò)增曲線。圖7為采用rs4244285的a型基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作對(duì)照，hex檢測(cè)頻道有一條擴(kuò)增曲線。圖8為采用rs4244285的a型基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作對(duì)照，fam檢測(cè)通道無(wú)擴(kuò)增曲線。圖9為采用rs4986893的g型基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作對(duì)照，rox檢測(cè)頻道有一條擴(kuò)增曲線。圖10為采用rs4986893的g型基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作對(duì)照，cy5檢測(cè)通道無(wú)擴(kuò)增曲線。圖11為采用rs4986893的a型基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作對(duì)照，cy5檢測(cè)頻道有一條擴(kuò)增曲線。圖12為采用rs4986893的a型基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作對(duì)照，rox檢測(cè)通道無(wú)擴(kuò)增曲線。圖13為同一反應(yīng)管內(nèi)加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態(tài)性的四種基因片段的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，fam檢測(cè)頻道有擴(kuò)增曲線。圖14為同一反應(yīng)管內(nèi)加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態(tài)性的四種基因片段的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，hex檢測(cè)頻道有擴(kuò)增曲線。圖15為同一反應(yīng)管內(nèi)加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態(tài)性的四種基因片段的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，rox檢測(cè)頻道有擴(kuò)增曲線。圖16為同一反應(yīng)管內(nèi)加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態(tài)性的四種基因片段的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，cy5檢測(cè)頻道有擴(kuò)增曲線。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。一、材料1、儀器：實(shí)時(shí)熒光pcr儀、移液器、離心機(jī)。2、引物、探針設(shè)計(jì)：本發(fā)明同時(shí)設(shè)計(jì)了兩對(duì)高效特異引物用于目標(biāo)基因的檢測(cè)，同時(shí)設(shè)計(jì)了兩對(duì)探針檢測(cè)相應(yīng)的cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態(tài)位點(diǎn)。引物、探針系列如下：引物：cyp2c19*2(rs4244285)-f:5’-ccagagcttggcatattgtatct-3’cyp2c19*2(rs4244285)-r:5’-tgtccatcgattcttggtgttct-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-tctgctccattattttccagaaacg-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-cttcagggcttggtcaatatagaat-3’。探針：fam-5’-gatgaaatcggctcccgc-3’bhq1hex-5’-gatgaaatcgactcccgcag-3’-bhq1rox-5’-agacactttcttcactggtcag-3’bhq2cy5-5’-agacacttgcttcactggtc-3’-bhq2。3、試劑10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，2.5mmol/lmgcl2,2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶。二、方法1、樣本選擇醫(yī)院體檢人群樣本78例。2、基因組dna提取用常規(guī)分子生物學(xué)方法或市售試劑合從抗凝全血中提取人基因組。3、實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增與檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)體系：10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，2.5mmol/lmgcl2,2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶，1μmol/l引物及熒光探針，30ng人基因組dna。實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)在rochelightcycler480ⅱ儀器上按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)：第一階段：95℃2min。第二階段：95℃20sec，62℃20sec(熒光采集)，72℃20sec(40cycles)四個(gè)熒光檢測(cè)頻道分別為fam、hex、rox、cy5。三、結(jié)果分析陰性對(duì)照：以純水作模板的反應(yīng)管內(nèi)應(yīng)無(wú)任何擴(kuò)增曲線產(chǎn)生。陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照品為分別克隆到載體puc57上的四個(gè)dna片段(每個(gè)載體中dna片段分別含snp位點(diǎn)上rs4244285的g型基因、rs4244285的a型基因、rs4986893的g型基因、rs4986893的a型基因)，同一反應(yīng)管內(nèi)加入四種陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，fam、hex、rox、cy5檢測(cè)頻道均應(yīng)有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生。結(jié)果判定：樣本反應(yīng)管中若fam檢測(cè)頻道有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生則判定存在snp位點(diǎn)上rs4244285g型基因，hex檢測(cè)頻道有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生則存在rs4244285a型基因，若fam、hex檢測(cè)頻道同時(shí)有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生則rs4244285為雜合型。若rox檢測(cè)頻道有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生則判定存在rs4986893g型基因，若cy5檢測(cè)頻道有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生則判定存在rs4244285a型基因，若rox、cy5檢測(cè)頻道同時(shí)有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生則rs4986893為雜合型。為驗(yàn)證本發(fā)明的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了78份基因組樣本的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，與測(cè)序結(jié)果對(duì)比，符合率達(dá)100％。結(jié)果如下表：結(jié)果(基因型)本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果(例)測(cè)序結(jié)果(例)符合率(％)rs4244285(g/g)4343100rs4244285(g/a)3030100rs4244285(a/a)55100rs4986893(g/g)7070100rs4986893(g/a)88100采用純水為陰性對(duì)照時(shí)，fam(465-510nm)檢測(cè)頻道無(wú)擴(kuò)增曲線如圖1所示產(chǎn)生，采用純水為陰性對(duì)照時(shí)，hex(533-580nm)檢測(cè)頻道無(wú)擴(kuò)增曲線如圖2所示產(chǎn)生，采用純水為陰性對(duì)照時(shí)，rox(533-610nm)檢測(cè)頻道無(wú)擴(kuò)增曲線如圖3所示產(chǎn)生，采用純水為陰性對(duì)照時(shí)，cy5(618-660nm)檢測(cè)頻道無(wú)擴(kuò)增曲線如圖4所示產(chǎn)生，采用rs4244285的g型基因的陽(yáng)性質(zhì)粒作對(duì)照，fam檢測(cè)頻道有一條擴(kuò)增曲線如圖5所示產(chǎn)生。圖5和圖6的結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下含熒光基團(tuán)fam的探針只對(duì)rs4244285的g型基因的目標(biāo)片段有特異結(jié)合，熒光基團(tuán)hex的探針不結(jié)合基因snp位點(diǎn)為g的目標(biāo)片段，兩種探針不存在交叉反應(yīng)。圖7和圖8的結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下含熒光基團(tuán)hex的探針只對(duì)rs4244285的a型基因的目標(biāo)片段有特異結(jié)合，熒光基團(tuán)fam的探針不結(jié)合snp位點(diǎn)為a的目標(biāo)片段，兩種探針不存在交叉反應(yīng)。圖9和圖10的結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下含熒光基團(tuán)rox的探針只對(duì)rs4986893的g型基因的目標(biāo)片段有特異結(jié)合，熒光基團(tuán)cy5的探針不結(jié)合snp位點(diǎn)為g的目標(biāo)片段，兩種探針不存在交叉反應(yīng)。圖11和圖12的結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下含熒光基團(tuán)hex的探針只對(duì)rs4986893的a型基因的目標(biāo)片段有特異結(jié)合，熒光基團(tuán)rox的探針不結(jié)合snp位點(diǎn)為a的目標(biāo)片段，兩種探針不存在交叉反應(yīng)。圖13～16的結(jié)果表明，同一反應(yīng)管同時(shí)存在四種基因型，反應(yīng)體系不影響試劑合的靈敏性、特異性。序列表<110>莊江興，廈門(mén)市同普生物科技有限公司<120>用于檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性的引物、探針及檢測(cè)試劑盒<130>2017<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1ccagagcttggcatattgtatct23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2tgtccatcgattcttggtgttct23<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3tctgctccattattttccagaaacg25<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4cttcagggcttggtcaatatagaat25<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5gatgaaatcggctcccgc18<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gatgaaatcgactcccgcag20<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7agacactttcttcactggtcag22<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agacacttgcttcactggtc20當(dāng)前第1頁(yè)12