本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從杏鮑菇菌渣中提取漆酶的方法。

背景技術(shù)：

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，出菇后大量菌渣的綜合利用對于保護(hù)環(huán)境、實現(xiàn)生態(tài)農(nóng)業(yè)和有機(jī)農(nóng)業(yè)良性循環(huán)有著十分重要的意義，目前菌渣主要是丟棄或焚燒，不僅造成資源的浪費(fèi)更導(dǎo)致霉菌和害蟲的增生，造成環(huán)境的污染。

杏鮑菇是一種分解纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)能力較強(qiáng)的食用菌，其生長發(fā)育過程中能分泌較多的漆酶。采摘后的新鮮菌渣中含有大量的漆酶，回收利用后可繼續(xù)堆肥或制成飼料，既能提高菌渣的利用率，又能創(chuàng)造一定的經(jīng)濟(jì)價值。漆酶在制漿漂白、生物燃料、污染物的降解、綠色有機(jī)物的合成、食品工業(yè)、生物傳感器、生物監(jiān)測方面應(yīng)用廣泛。

目前漆酶的獲取主要是從漆樹或微生物的發(fā)酵液中獲取，生產(chǎn)量比較有限，生產(chǎn)成本較高，目前還沒有從杏鮑菇菌渣中提取漆酶的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種原料廉價且豐富，獲取漆酶途徑簡單的方法，提高杏鮑菇菌渣的利用率，擴(kuò)大了漆酶的獲取途徑。

具體的，本發(fā)明從杏鮑菇菌渣中提取漆酶的方法，按照如下步驟進(jìn)行：

s1：原料預(yù)處理

選取剛收獲子實體的新鮮菌渣或陰涼處放置3天以內(nèi)的菌渣，將菌渣進(jìn)行粉碎，過4～10目篩；

s2：提取粗酶液

向粉碎后的菌渣中加入浸提液，浸泡12～36h，過濾除去固體，4000～5000r/min離心5～10min，收集上清液即為粗酶液；

所述浸提液為ph＝4.5～5.5的hac-naac緩沖溶液，按照料液比1g：5～10ml的比例添加；

s3：濃縮、純化漆酶

用切向流超濾系統(tǒng)濃縮、純化粗酶液，得到漆酶酶制劑，在2～4℃儲存。

優(yōu)選地，所述漆酶酶制劑進(jìn)一步通過真空冷凍干燥，獲得漆酶酶粉。

更優(yōu)選地，s3中，采用切向流超濾系統(tǒng)濃縮的具體過程為：將粗酶液先用50kd的切向流超濾膜進(jìn)行過濾，收集滲透液，再用30kd的切向流超濾膜濃縮滲透液，超濾濃縮20倍。

更優(yōu)選地，所制得的漆酶酶制劑或漆酶酶粉呈褐色，可溶于水，漆酶蛋白比活力為8000-10000u/g，溫度20-60℃，酶活力穩(wěn)定；室溫下，ph值在4.0～6.6范圍內(nèi)的酶活力變化小于15％。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案，具有如下有益效果：

(1)以剛收獲子實體的新鮮菌渣或陰涼處放置3天以內(nèi)的菌渣為原料，進(jìn)行提取，原料廉價且豐富，獲取途徑簡便，擴(kuò)展了漆酶的來源，提高廢棄物菌渣的利用率。

(2)菌渣粉碎后采用ph＝4.5～5.5的hac-naac緩沖溶液浸提，即可獲得漆酶，簡單易行，操作簡便，可大規(guī)模提取。

(3)采用切向流超濾系統(tǒng)濃縮、純化粗酶液，能夠有效截獲漆酶蛋白分子，去除雜蛋白，有利于連續(xù)化操作，提高漆酶蛋白比活力。

具體實施方式

為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案能予以實施，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。

本發(fā)明通過杏鮑菇菌渣獲得漆酶，不僅擴(kuò)展了漆酶的獲取途徑，還實現(xiàn)了杏鮑菇菌渣的高效利用，下面就以具體的示例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述。需要說明的是，下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件操作，未注明的實驗材料來源均為市售，由于不涉及發(fā)明點(diǎn)，故不對其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。

實施例1

本實施例一種從杏鮑菇菌渣中提取漆酶的方法，具體過程如下：

選取剛收獲子實體的新鮮菌渣，將這些菌渣進(jìn)行粉碎，過4目左右篩；然后向粉碎后的菌渣中加入浸提液，所用浸提液為ph＝4.5～5.5的hac-naac緩沖溶液，按照料液比1g：5ml添加，浸泡24h后，過濾除去固體，4800r/min離心10min，收集上清液即為粗酶液，該方法簡單，浸提率高，且便于后續(xù)收集粗酶液。接著采用切向流超濾系統(tǒng)對粗酶液進(jìn)行濃縮，由于漆酶的分子量大概在120kd左右，所以將粗酶液先用50kd的切向流超濾膜進(jìn)行過濾，截留掉一些大分子雜質(zhì)，收集滲透液，再用30kd的切向流超濾膜濃縮滲透液，超濾濃縮20倍后，得到褐色的濃縮酶制劑，酶制劑2-4℃儲存。

在這里我們之所以采用切向流超濾系統(tǒng)對粗酶液進(jìn)行濃縮，是因為切向流超濾系統(tǒng)可用于低至10毫升、高達(dá)數(shù)千升樣品的濃縮、洗濾(脫鹽及緩沖液置換)以及利用尺寸大小分離生物分子，用切向流超濾能夠有效截獲漆酶蛋白分子，去除雜蛋白，提高漆酶蛋白比活力。這樣連續(xù)高效流水線化去除粗酶液中的雜質(zhì)和雜蛋白純化濃縮酶液的方式，便于工業(yè)化操作。

下面我們以abts(2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)為底物，測定上述方法獲得的漆酶酶活，在這里，酶活單位定義為適宜條件下單位時間生成產(chǎn)物的微摩爾數(shù)(u/g/min)。

漆酶酶活測定的具體過程為：取濃縮酶制劑，測定漆酶酶活，以abts(2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)為底物，每分鐘氧化1微摩爾abts底物所需要的酶量定義為1個酶活單位(u)。在1毫升反應(yīng)體系中，底物abts終濃度為1毫摩爾/升，其中含有100毫摩爾/升ph值為4.5的乙酸鈉緩沖液880微升，100微升abts和20微升濃縮酶制劑，整個反應(yīng)體系在30℃下反應(yīng)5分鐘，在420nm下測定其吸光度的變化。酶活力按以下公式計算：其中a1為空白對照吸光值；a2為反應(yīng)后吸光值；t為反應(yīng)時間；ε為底物abts的摩爾吸光系數(shù)，為3.6×104m^-1cm^-1。

測定得到上述濃縮酶制劑的比活力為9700u/g，溫度20-60℃下的酶活力穩(wěn)定；室溫下，ph值在4.0～6.6范圍內(nèi)的酶活力變化小于15％。

實施例2

本實施例一種從杏鮑菇菌渣中提取漆酶的方法，具體過程如下：

選取陰涼處放置3天以內(nèi)的菌渣，將這些菌渣進(jìn)行粉碎，過10目左右篩；然后向粉碎后的菌渣中加入浸提液，所用浸提液為ph＝4.5～5.5的hac-naac緩沖溶液，按照料液比1g：10ml添加，浸泡12h后，過濾除去固體，5000r/min離心5min，收集上清液即為粗酶液。接著采用切向流超濾系統(tǒng)對粗酶液進(jìn)行濃縮，將粗酶液先用50kd的切向流超濾膜進(jìn)行過濾，截留掉一些大分子雜質(zhì)，收集滲透液，再用30kd的切向流超濾膜濃縮滲透液，超濾濃縮20倍后，得到的濃縮液通過真空冷凍干燥獲得漆酶酶粉。

進(jìn)一步地，我們對上述方法得到的漆酶酶粉進(jìn)行表征，酶粉為褐色粉末，可溶于水，比活力為8200u/g，溫度20-60℃下的酶活力穩(wěn)定；室溫下，ph值在4.0～6.6范圍內(nèi)的酶活力變化小于10％。

實施例3

本實施例一種從杏鮑菇菌渣中提取漆酶的方法，具體過程和實施例相同，不同之處僅在于：菌渣與浸提液的料液比為1g：8.2ml，浸泡36h。

上述方法得到的漆酶酶粉的表征結(jié)果如下：比活力為9400u/g，溫度20-60℃下的酶活力穩(wěn)定；室溫下，ph值在4.0～6.6范圍內(nèi)的酶活力變化小于11.7％。

需要說明的是，本發(fā)明權(quán)利要求書中涉及數(shù)值范圍時，應(yīng)理解為每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用，由于采用的步驟方法與實施例1～3相同，為了防止贅述，本發(fā)明的描述了優(yōu)選的實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。