本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體來說，涉及一種可視化基因芯片檢測(cè)肺部感染病原菌的方法。
背景技術(shù)：
：長(zhǎng)期以來，呼吸道病原體引起的急性重癥肺部感染一直是威脅人類健康的重要疾病，如不能得到及時(shí)有效救治，不僅可引起呼吸衰竭，還可導(dǎo)致多器官功能障礙，嚴(yán)重威脅患者生命，近20年來，肺部感染的細(xì)菌譜發(fā)生了變化，是當(dāng)前醫(yī)務(wù)工作者面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。對(duì)病原菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，是臨床診治肺部感染的前提與關(guān)鍵，對(duì)于降低患者死亡率，減少住院時(shí)間、降低住院費(fèi)用及避免醫(yī)療資源的浪費(fèi)具有重要意義。目前我國(guó)對(duì)于感染性疾病的病原菌檢測(cè)、鑒定手段仍停留在培養(yǎng)、血清和生化檢測(cè)水平。病原菌檢測(cè)的經(jīng)典方法是細(xì)菌培養(yǎng)，其作為病原菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，至少需要3-5天時(shí)間，對(duì)于一些非典型菌株培養(yǎng)則需時(shí)間更長(zhǎng)，不能在第一時(shí)間給臨床醫(yī)生提供詳盡的病原菌信息，導(dǎo)致臨床治療多僅憑經(jīng)驗(yàn)用藥，嚴(yán)重影響治療準(zhǔn)確性及效果。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)在病原學(xué)檢測(cè)方面得到了迅猛發(fā)展，pcr等雖然有較好的特異性及靈敏性，但每次只能檢測(cè)一種或幾種致病菌，存在通量低的缺陷，只能作為常規(guī)檢測(cè)方法的補(bǔ)充和輔助。因此，臨床迫切需要對(duì)肺部感染的病原體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，以指導(dǎo)抗感染藥物選擇，提高臨床治療效果。利用高新分子生物學(xué)技術(shù)，建立多種感染性致病菌的快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)方法，使之操作簡(jiǎn)便、適合臨床應(yīng)用，確保臨床醫(yī)生在較短的時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確獲得病原菌結(jié)果，對(duì)于提高肺部感染的診治和防控能力，防止疾病的傳播，都具有重要的價(jià)值?；蛐酒夹g(shù)為病原微生物的診斷提供了一種強(qiáng)有力的手段?；蛐酒?genechip)又稱為dna微陣列(dnamicroarray)，該技術(shù)采用原位合成或微量點(diǎn)樣方法，將大量dna探針如基因片段、人工合成的寡核苷酸等有序固定在載體(玻璃、硅片、尼龍膜等表面)與標(biāo)記的核酸樣品雜交后通過計(jì)算機(jī)等信號(hào)處理系統(tǒng)獲取樣品核酸序列信息。與傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)相比較，具有準(zhǔn)確、快速、高通量、平行化等無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)鑒定已顯示出良好的應(yīng)用前景?；蛐酒夹g(shù)主要包括四個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品制備、生物分子反應(yīng)、信號(hào)的檢測(cè)與分析?；蛐酒系奶结樤O(shè)計(jì)是決定芯片檢測(cè)效能的關(guān)鍵因素之一，16srrna基因在細(xì)菌的分類鑒定學(xué)上具有重要的生物學(xué)意義，其在生物進(jìn)化過程中比其他基因演變得慢，被稱為“細(xì)菌進(jìn)化的活化石。迄今為止，幾乎所有已知細(xì)菌16srrna基因的堿基序列已被測(cè)定并存入基因庫。一般認(rèn)為，對(duì)于同一種細(xì)菌其基因組的同源性應(yīng)大于70％，對(duì)16srrna而言，如果出現(xiàn)3個(gè)以上堿基差異就可斷定細(xì)菌不屬于同一種屬，因此，可設(shè)計(jì)出針對(duì)所有細(xì)菌共同的pcr反應(yīng)引物?；蛐酒糜诩?xì)菌分類鑒定，常用的檢測(cè)區(qū)域和目的基因有：16srrna、23srrna、16s～23srrnaisr(基因間隔區(qū))等。但現(xiàn)有的序列特異性探針設(shè)計(jì)算法缺乏足夠的覆蓋度、靈活性以及效率，不能滿足大規(guī)模細(xì)菌檢測(cè)基因芯片的設(shè)計(jì)要求，而采用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的基于相對(duì)熵和遺傳算法的組合探針設(shè)計(jì)，使得基于組合探針識(shí)別的大規(guī)模細(xì)菌分類16srrna基因芯片設(shè)計(jì)成為可能。芯片的信號(hào)采集和分析方法是獲得病原菌感染結(jié)果的關(guān)鍵步驟。目前，熒光檢測(cè)法是基因芯片常規(guī)檢測(cè)方法，方法成熟、簡(jiǎn)便，能夠達(dá)到一般的檢測(cè)要求，但有機(jī)熒光染料有自身難以克服的缺點(diǎn)：易淬滅、信號(hào)強(qiáng)度低等，在各種環(huán)境中穩(wěn)定性差，影響檢測(cè)信號(hào)的均一性和實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性，其最大的缺點(diǎn)是檢測(cè)儀器的昂貴、體積笨重，檢測(cè)成本較高，限制了基因芯片的臨床及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用與推廣，也是生物芯片技術(shù)發(fā)展面臨的瓶頸問題。為解決這個(gè)問題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索研究基因芯片的可視化技術(shù)?？梢暬酒纯捎萌庋壑苯佑^察到生物大分子的反應(yīng)信號(hào)，其原理是在酶的催化作用下產(chǎn)生的沉淀，沉積在芯片表面，使芯片的厚度發(fā)生變化，致使反射在芯片上的光的波長(zhǎng)發(fā)生改變，由此可以通過芯片上顏色的變化來觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。近年已有研究者將免疫組化的金銀染色的技術(shù)應(yīng)用于基因芯片的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了可視化檢測(cè)，大大降低了檢測(cè)成本，但缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度低，不能達(dá)到分子檢測(cè)的要求。在傳統(tǒng)金標(biāo)銀染(goldlabelsilverstain，glss)技術(shù)基礎(chǔ)上，應(yīng)用酪胺信號(hào)放大金標(biāo)銀染(tsa-glss)的方法，將tsa信號(hào)放大與量子點(diǎn)銀染信號(hào)放大相結(jié)合，通過兩步放大，實(shí)現(xiàn)了基因芯片高靈敏度的檢測(cè)。該方法的原理是：將待檢測(cè)物標(biāo)記生物素分子，使其與親和素特異性結(jié)合，親和素分子上連有的辣根過氧化物酶(hrp)可以催化酪胺分子大量地沉積在hrp分子表面，起到級(jí)聯(lián)放大的作用，將酪胺分子標(biāo)記生物素分子，進(jìn)而可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，與常規(guī)的方法相比，檢測(cè)的靈敏度可提高10-100倍，對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)靈敏度達(dá)103cfu/ml，且結(jié)果肉眼可見，實(shí)現(xiàn)了基因芯片的可視化(原理見圖1)，檢測(cè)過程在5小時(shí)內(nèi)完成?？梢暬蛐酒云涓咄?、特異、快速，又可以擺脫昂貴的基因芯片實(shí)驗(yàn)設(shè)備的限制等優(yōu)勢(shì)，在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用逐漸得到重視。但迄今為止，基于臨床致病菌譜的肺部感染病原體篩查的可視化基因芯片研究，國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。近年來，課題組對(duì)老年肺部感染及導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征早期預(yù)警和預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了研究，觀察老年肺部感染致病菌譜變化，在以往研究的基礎(chǔ)上，本課題緊密結(jié)合臨床實(shí)際，針對(duì)肺部感染病原菌檢測(cè)結(jié)果滯后的矛盾，選取近年醫(yī)院常見的10種肺部感染致病菌，應(yīng)用基因芯片結(jié)合高靈敏的可視化技術(shù)，研究、建立一種新的適用于臨床、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的肺部感染病原菌篩選、檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌快速、靈敏、高通量、低成本的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，以期為肺部感染的診斷、抗感染治療提供依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)相關(guān)技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種可可視化基因芯片檢測(cè)肺部感染病原菌的方法，能夠克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種可視化基因芯片檢測(cè)肺部感染病原菌的方法，包括以下步驟：s1基于臨床的肺部感染病原菌譜確定，在若干例肺部感染患者致病菌中，通過統(tǒng)計(jì)、分析選取10種常見致病菌作為檢測(cè)的靶細(xì)菌；s2根據(jù)細(xì)菌的特定基因做檢測(cè)靶點(diǎn)；s3設(shè)計(jì)通用引物和探針；s4芯片制備；s5靶基因擴(kuò)增；s6芯片雜交、洗滌；s7基因芯片可視化檢測(cè)；s8優(yōu)化條件，建立方法；s9臨床驗(yàn)證；s10與細(xì)菌培養(yǎng)進(jìn)行比對(duì)；s11建立肺部感染病原菌可視化基因芯片檢測(cè)。進(jìn)一步的，步驟s2和s3中，以取篩查的10種細(xì)菌為檢測(cè)靶點(diǎn)，采用計(jì)算機(jī)clustal×1.8mswalignment軟件對(duì)多種細(xì)菌的靶基因進(jìn)行序列比對(duì)，采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物與探針，并進(jìn)行blast分析篩選，篩選通用性引物和多種呼吸道致病菌特異性檢測(cè)探針，所有下游引物在5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記，全部寡核苷酸探針在3′端進(jìn)行氨基修飾。進(jìn)一步的，步驟s4中，成引物、探針，將探針用點(diǎn)樣液稀釋至終濃度后，各取20ul置于384孔板，用點(diǎn)樣儀將探針點(diǎn)到空白的醛基化修飾玻片上，于室溫放置至少18h，每張芯片10個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)為7×7探針矩陣。進(jìn)一步的，步驟s7中，依次點(diǎn)加鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶、生物素-標(biāo)記的酪胺和鏈霉親和素-納米金孵育，最后加入銀增強(qiáng)試劑顯色，觀測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的有益效果：建立基于臨床致病菌譜的肺部感染病原體篩查的可視化基因芯片檢測(cè)技術(shù)；實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床常見呼吸道感染菌群的重要病原微生物快速、靈敏、高通量檢測(cè)，為呼吸道急性、重癥感染性疾病的臨床疾病診斷、抗感染治療提供依據(jù)；為應(yīng)急、防控提供有效提供高效的甄檢手段方法。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明tsa-glss生物芯片檢測(cè)原理圖；和圖2為本發(fā)明實(shí)施例所述的可視化基因芯片檢測(cè)肺部感染病原菌的方法的流程框圖；圖3-4為本發(fā)明實(shí)施例所述的可視化基因芯片檢測(cè)肺部感染病原菌的方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。如圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例所述的可視化基因芯片檢測(cè)肺部感染病原菌的方法包括以下步驟：s1在近年300例肺部感染患者致病菌中，通過統(tǒng)計(jì)、分析選取10種常見致病菌作為檢測(cè)的靶細(xì)菌；s2設(shè)計(jì)通用引物及特異性探針：以取篩查的10種細(xì)菌為檢測(cè)靶點(diǎn)，采用計(jì)算機(jī)clustal×1.8mswalignment軟件對(duì)多種細(xì)菌的靶基因進(jìn)行序列比對(duì)，采用primerprimer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物與探針，并進(jìn)行blast分析篩選。篩選通用性引物和多種呼吸道致病菌特異性檢測(cè)探針，所有下游引物在5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記，全部寡核苷酸探針在3′端進(jìn)行氨基修飾。s3芯片制備：合成引物、探針，將探針用點(diǎn)樣液稀釋至終濃度后，各取20ul置于384孔板，用點(diǎn)樣儀將探針點(diǎn)到空白的醛基化修飾玻片上，于室溫放置至少18h，每張芯片10個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)為7×7探針矩陣。s4核酸提?。喊凑諏?shí)驗(yàn)室建立的一步法，提取細(xì)菌dna。s5、靶基因擴(kuò)增：取5ul上清作為模板，按試劑盒方法進(jìn)行pcr反應(yīng)。s6、進(jìn)行生物素、酪胺的制備：按照實(shí)驗(yàn)室建立方法進(jìn)行。s7、進(jìn)行芯片雜交、洗滌：按照實(shí)驗(yàn)室建立方法進(jìn)行。s8、可視化檢測(cè)：依次點(diǎn)加鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(streptavidin-hrp)、生物素-標(biāo)記的酪胺(biotin-tyramine)和鏈霉親和素-納米金(streptavidn-nanogld)孵育，最后加入銀增強(qiáng)試劑顯色，觀測(cè)結(jié)果。s9、最后用可視化生物芯片掃描儀掃描并記錄結(jié)果，進(jìn)行分析。s10、優(yōu)化上述各項(xiàng)反應(yīng)條件：包括：引物比例、鎂離子濃度、退火溫度、退火時(shí)間、雜交溫度、雜交液成分等因素。s11、進(jìn)行特異性、靈敏度、重復(fù)性評(píng)價(jià)，進(jìn)一步完善基因芯片檢測(cè)方法：①、特異性評(píng)價(jià)：由我院微生物實(shí)驗(yàn)室及軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供致病菌陽性及陰性參考品進(jìn)行。②、靈敏度評(píng)價(jià)：各種致病菌靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，使靈敏度在101-103cfu/ml之間。③、重復(fù)性測(cè)定：同一芯片不同點(diǎn)及不同批次芯片變異系數(shù)＜15％。三、臨床驗(yàn)證研究：(一)、病例選擇及標(biāo)本留取1、入選標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡大于16歲，根據(jù)臨床癥狀、查體、檢驗(yàn)及影像學(xué)結(jié)果符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的社區(qū)獲得性肺炎(hap)、呼吸機(jī)相關(guān)肺炎(vap)、醫(yī)院獲得性肺炎(hap)診斷標(biāo)準(zhǔn)。2、排除標(biāo)準(zhǔn)：①活動(dòng)性肺結(jié)核；②肺部腫瘤；③咯血的肺部疾??；④單純病毒性肺炎、真菌性肺炎。3、自愿簽署知情同意書。4、標(biāo)本留?。夯颊呷朐簳r(shí)及治療過程中均可收集，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)范留取、存放各種標(biāo)本。(二)、研究設(shè)計(jì)與方案1、研究設(shè)計(jì)：隨機(jī)、開放的臨床研究。選取150例在我院門診就診及住院治療的肺部感染患者為研究對(duì)象，留取臨床標(biāo)本(包括咽鼻試子、含漱液、痰、氣管分泌物及支氣管肺泡灌洗液致病菌)標(biāo)本進(jìn)行可視化基因芯片檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定，用于芯片檢測(cè)結(jié)果的復(fù)核，進(jìn)行臨床驗(yàn)證。2、研究方案與流程：①、確定最常見的10種致病菌。②、制備基因芯片。③、選取150例在我院門診就診及住院治療的肺部感染患者，進(jìn)行臨床標(biāo)本(包括咽試子、含漱液、痰、氣管分泌物及支氣管肺泡灌洗液致病菌)可視化基因芯片檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定，進(jìn)行臨床驗(yàn)證。前期研究檢測(cè)50-120例患者標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn)，后期根據(jù)結(jié)果調(diào)整研究進(jìn)度。④、可對(duì)同一患者的咽拭子、含漱液、痰液及支氣管肺泡灌洗液同時(shí)檢測(cè)，但用于基因芯片與細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定的標(biāo)本須為同一類型標(biāo)本。⑤、臨床首診及住院治療過程中的患者標(biāo)本均可應(yīng)用于研究。⑥、急危重癥及住院治療過程中感染加重患者可根據(jù)病情再次留取標(biāo)本檢測(cè)，患者臨床治愈停止可標(biāo)本檢測(cè)。⑦、患者常規(guī)化驗(yàn)血常規(guī)、生化及各項(xiàng)炎癥等相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)行血?dú)夥治?、影像學(xué)等相關(guān)檢查。⑧、不能同時(shí)進(jìn)行基因芯片、細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)的病例退出實(shí)驗(yàn)研究。3、主要評(píng)價(jià)指標(biāo)：可視化基因芯片陽性與細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果符合比例。4、樣本量的估算：由于國(guó)內(nèi)尚無相關(guān)研究，但本實(shí)驗(yàn)室及課題組應(yīng)用該技術(shù)篩查呼吸道病毒技術(shù)已建立，方法較成熟，且肺部感染病例來源豐富，易于收集，預(yù)計(jì)可在3個(gè)月內(nèi)收集150例病例，去除可能不符合實(shí)驗(yàn)要求的病例，按照20％退出率，考慮實(shí)驗(yàn)條件及成本預(yù)算，可先選擇研究病例對(duì)象120例。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：兩種檢測(cè)方法的比較采用：①、符合率的比較，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)；②、采用一致性檢驗(yàn)，kappa系數(shù)＞0.7為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖3-4和表1是本發(fā)明實(shí)施例所述的可視化基因芯片檢測(cè)肺部感染病原菌的方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果。標(biāo)1標(biāo)2標(biāo)3標(biāo)4標(biāo)5標(biāo)6標(biāo)7標(biāo)8標(biāo)9標(biāo)2actg1ta2sp61yta3hi6p6-12pa-12toxa3標(biāo)3actg1ta2sp61yta3hi6p6-12pa-12toxa3標(biāo)4mp48p1-2sianucbc12reca3sm11chita14標(biāo)5mp48p1-2stanucbc12reca3sm11chita14標(biāo)6fe31fpcp13cppkp32mdh12dnaj3phoa3標(biāo)7fe31fpcp13cppkp32mdh12dnaj3phoa3標(biāo)8es11spleg2mig1陰性3陰性4陰性5陽性標(biāo)9es11spleg2mig1陰性3陰性4陰性5陽性以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12