本發(fā)明涉及一種基于2-氨基十六烷酸的生物可降解材料，具體涉及一種2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐及其合成，以及由其開(kāi)環(huán)聚合制備的聚合物和該聚合物制備的聚合物膠束和囊泡。
背景技術(shù)：
：聚氨基酸由于具有免疫原性較低、良好的降解性能和機(jī)械性能以及性能可控而廣泛應(yīng)用于藥物控釋、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。但是，通過(guò)α-氨基酸-n-羧基內(nèi)酸酐聚合得到的疏水性聚氨基酸（例如：聚亮氨酸，聚苯丙氨酸，聚異亮氨酸和聚蛋氨酸等）在有機(jī)溶劑中的溶解性極差，進(jìn)而導(dǎo)致聚合不可控、所得聚合物分子量較小。所以，研究人員通常通過(guò)后修飾的方式在聚谷氨酸、聚賴氨酸或聚天冬氨酸等親水性聚合物的側(cè)鏈修飾疏水性基團(tuán)來(lái)得到疏水性的聚合物嵌段。但是，這種方式一般要經(jīng)過(guò)一系列的保護(hù)和脫保護(hù)等過(guò)程，從而導(dǎo)致最終產(chǎn)率較低，合成耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。所以，需要研究合成既具有強(qiáng)疏水性又具有較好的溶劑選擇窗的疏水性聚氨基酸；并且這些聚氨基酸具有良好的溶劑選擇性和合成可控性，制備所得的兩親性聚合物可以制備得到靶向載藥的聚合物膠束或囊泡用于腫瘤的靶向治療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐單體及其制備方法，并用2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合制備嵌段共聚物聚氨基酸，這些聚合物能通過(guò)自組裝形成聚合物膠束及聚合物囊泡。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種具有式i結(jié)構(gòu)的2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐：式ⅰ。本發(fā)明公開(kāi)了上述2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐的制備方法，包括如下步驟，以2-氨基十六烷酸、蒎烯、三光氣為反應(yīng)物，在有機(jī)溶劑如無(wú)水四氫呋喃中反應(yīng)，制備得到所述2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐。上述技術(shù)方案中，2-氨基十六烷酸、蒎烯以及三光氣的摩爾比為2∶4～6∶1～2；所述反應(yīng)的時(shí)間為1～2小時(shí)，反應(yīng)的溫度為30～70℃。優(yōu)選的，2-氨基十六烷酸、α-蒎烯及三光氣的摩爾比為2∶3∶1。上述技術(shù)方案中，具體反應(yīng)過(guò)程如下：將2-氨基十六烷酸、三光氣和α-蒎烯加入到無(wú)水四氫呋喃中，攪拌均勻，在50℃下反應(yīng)1小時(shí)后，將反應(yīng)液自然冷卻至室溫后旋蒸濃縮，然后用石油醚沉淀得到粗產(chǎn)品；再將該粗產(chǎn)品用無(wú)水的四氫呋喃和石油醚重結(jié)晶2-3次，最終得到白色粉末狀固體，即為2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐（apa-nca）。上述制備方案可表示如下：本發(fā)明還公開(kāi)了一種聚氨基酸，包括不含靶向分子聚氨基酸或者含靶向分子聚氨基酸；所述不含靶向分子聚氨基酸由上述2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐在引發(fā)劑存在下制備得到；所述含靶向分子聚氨基酸由上述2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐在引發(fā)劑和靶向分子存在下制備得到。本發(fā)明制備的聚氨基酸分子結(jié)構(gòu)中，引發(fā)劑鏈段的分子量為2000～10000，（2-氨基十六烷酸）鏈段的分子量為1000～50000。本發(fā)明還公開(kāi)了一種聚氨基酸的制備方法，由上述2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐用引發(fā)劑開(kāi)環(huán)聚合制備得到；或者由上述2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐用引發(fā)劑開(kāi)環(huán)聚合后偶聯(lián)靶向分子制備得到。優(yōu)選的，本發(fā)明公開(kāi)了由上述2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐用聚乙二醇化合物為引發(fā)劑聚合制備的嵌段共聚物聚氨基酸，其中聚乙二醇鏈段的分子量為2000-10000，聚（2-氨基十六烷酸）鏈段的分子量為1000～50000。所述聚乙二醇化合物可以為不同分子量的甲氧基聚乙二醇氨基、甲氧基聚乙二醇硅氮烷、丙烯酸酯聚乙二醇氨基、丙烯酸酯聚乙二醇硅氮烷、烯丙基聚乙二醇氨基、烯丙基聚乙二醇硅氮烷、馬來(lái)酰亞胺聚乙二醇氨基、馬來(lái)酰亞胺聚乙二醇硅氮烷、疊氮聚乙二醇氨基、疊氮聚乙二醇硅氮烷、炔基聚乙二醇氨基、炔基聚乙二醇硅氮烷、生物素聚乙二醇氨基、生物素聚乙二醇硅氮烷。優(yōu)選的，所述嵌段共聚物由上述2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐用聚乙二醇為引發(fā)劑經(jīng)開(kāi)環(huán)聚合制備得到，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式ii所示：式ii。上述技術(shù)方案中，r為聚乙二醇化合物引發(fā)劑的末端官能基團(tuán)，本發(fā)明優(yōu)選聚乙二醇氨基引發(fā)劑。分子式見(jiàn)式iii：式iii其中，r為，，，或者。上述聚氨基酸的制備過(guò)程在有機(jī)溶劑如n,n-二甲基甲酰胺（dmf）、二氯甲烷（dcm）、三氯甲烷、四氫呋喃（thf）中進(jìn)行，本發(fā)明優(yōu)選n,n-二甲基甲酰胺作溶劑。本發(fā)明得到的聚合物的親水段peg的末端可以化學(xué)偶聯(lián)特異性靶向分子得到含靶向分子聚氨基酸，包括短肽（crgd、cngq、cc-9、cpp33、cpp44等），小分子靶向分子（葉酸、茴香酰胺等），抗體及抗體片段，多糖和單糖等。本發(fā)明制備的聚合物可應(yīng)用于制備聚合物納米結(jié)構(gòu)，包括聚合物膠束和聚合物囊泡，并可包載藥物，得到納米藥物，結(jié)合分散介質(zhì)比如緩沖液，得到納米藥物體系。本發(fā)明還公開(kāi)了一種聚合物納米結(jié)構(gòu)及其制備方法，由上述不含靶向分子聚氨基酸和/或含靶向分子聚氨基酸制備得到；或者在上述不含靶向分子聚氨基酸制備得到的納米結(jié)構(gòu)后再偶聯(lián)靶向分子制備得到所述聚合物納米結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還公開(kāi)了一種納米藥物，包括上述聚合物納米結(jié)構(gòu)以及藥物，包括多肽和蛋白質(zhì)藥物、疏水性化藥及親水性化藥。本發(fā)明還公開(kāi)了一種納米藥物的制備方法，由上述不含靶向分子聚氨基酸和/或含靶向分子聚氨基酸、藥物制備得到所述納米藥物；或者在上述不含靶向分子聚氨基酸與藥物制備得到的載藥納米結(jié)構(gòu)后再偶聯(lián)靶向分子制備得到所述納米藥物。本發(fā)明還公開(kāi)了一種納米藥物體系及其制備方法，包括上述納米藥物以及分散介質(zhì)；將上述納米藥物以及分散介質(zhì)混合，得到所述納米藥物體系；分散介質(zhì)可以為緩沖液或者生理鹽水等。本發(fā)明還公開(kāi)了2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐、聚氨基酸、聚合物納米結(jié)構(gòu)或者納米藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的聚合物具有合適的親疏水比例，因此可以通過(guò)溶劑置換法制備得到一系列尺寸可控的聚合物膠束和聚合物囊泡。具體制備方法可以為：聚合物膠束和囊泡是通過(guò)溶劑置換法制備得到。將聚合物溶于n,n-二甲基甲酰胺（dmf）或四氫呋喃（thf）中，然后將聚合物溶液逐滴滴加到水或者是pb中，最后用截留分子量為7000的透析袋透析除去有機(jī)溶劑即可得到粒徑在50-200nm的聚合物膠束或囊泡。可以通過(guò)調(diào)節(jié)上述靶向和非靶向聚合物的比例制備得到特異性靶向的聚合物膠束或囊泡。靶向分子的引入還可以在聚合物膠束或囊泡制備好以后，通過(guò)后修飾方法實(shí)現(xiàn)，比如在膠束或囊泡表面的peg端引入短肽（crgd、cngq、cc-9、cpp33、cpp44等），小分子靶向分子（葉酸、茴香酰胺等），抗體及抗體片段，多糖和單糖等。由于上述技術(shù)方案的應(yīng)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明制備的α-氨基酸-n-羧基內(nèi)酸酐為一種長(zhǎng)鏈脂質(zhì)內(nèi)酸酐單體，可以通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合得到性能可控的聚脂肽，該類聚氨基酸相較于其他疏水性聚氨基酸具有更寬的溶劑選擇窗和更好的溶解性；本發(fā)明利用聚乙二醇為引發(fā)劑、通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合得到分子量可控、分子量分布較窄聚合物，豐富了雙親性生物相容性聚合物的種類；本發(fā)明公開(kāi)的聚合物具有優(yōu)異的生物相容性，可以制備（腫瘤靶向）聚合物膠束和囊泡，可用于多肽和蛋白質(zhì)藥物、疏水性化藥及親水性化藥的高效裝載；本發(fā)明公開(kāi)的聚氨基酸是一種聚脂肽，能組裝形成納米結(jié)構(gòu)，同時(shí)可裝載疏水性化藥（如伊立替康）等多種藥物用于多種癌癥的治療，還可以作為一種輔料鏈接到抗原上用于抗癌疫苗的制備，可廣泛應(yīng)用于納米醫(yī)藥研究領(lǐng)域；本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，所用原料來(lái)源廣泛，從而具有良好的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例一中apa-nca的核磁氫譜和核磁碳譜圖；圖2是實(shí)施例二中peg5k-b-papa3.5k的核磁氫譜圖；圖3是實(shí)施例三中aa-peg6k-b-papa4.2k的核磁氫譜圖；圖4是實(shí)施例三中crgd-peg6k-b-papa4.2k的核磁氫譜圖；圖5是實(shí)施例四和實(shí)施例五中crgd修飾的聚合物膠束的粒徑分布（a）及透射電子顯微鏡圖（b），血清穩(wěn)定性（c）和體外釋放（d）；圖6是實(shí)施例六和實(shí)施例七中crgd修飾的聚合物囊泡的粒徑分布（a）及透射電子顯微鏡圖（b），血清穩(wěn)定性（c）和體外釋放（d）；圖7是實(shí)施例八中空聚合物膠束對(duì)l929小鼠成纖維細(xì)胞和b16f10小鼠黑色素瘤細(xì)胞（a）和空聚合物囊泡對(duì)l929小鼠成纖維細(xì)胞和a549人肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果圖（b）；圖8是實(shí)施例九中載多西紫杉醇聚合物膠束對(duì)b16f10小鼠黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性（a），和載阿霉素聚合物囊泡對(duì)a549人肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性（b）；圖9是實(shí)施例十中聚合物膠束（a）和囊泡（b）在小鼠體內(nèi)的血液循環(huán)研究結(jié)果圖；圖10是實(shí)施例十一載藥聚合物膠束在荷b16f10小鼠黑色素瘤小鼠體內(nèi)的生物分布研究結(jié)果圖（a）和載藥囊泡在荷a549-luc人肺癌小鼠體內(nèi)的生物分布研究結(jié)果圖（b）；圖11是實(shí)施例十二中載dtx的靶向聚合物膠束dtx-crgd-pms在荷小鼠b16f10黑色素瘤c57/bl6小鼠體內(nèi)的抑瘤情況圖，其中a為腫瘤生長(zhǎng)曲線，b為小鼠治療后腫瘤圖片，c為體重變化，d為生存曲線；圖12是實(shí)施例十三中載dox的靶向聚合物囊泡dox-crgd-lpps在荷人a549-luc肺癌原位腫瘤裸鼠體內(nèi)的抑瘤情況圖，其中a為腫瘤生長(zhǎng)曲線，b為小鼠體重變化，c為生存曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖以及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：實(shí)施例一2-氨基十六烷酸-n-羧基內(nèi)酸酐（apa-nca）的合成（1）將準(zhǔn)確稱取的2-氨基十六烷酸(3g，11mmol)置于經(jīng)過(guò)無(wú)水無(wú)氧處理的三頸圓底燒瓶中，加入無(wú)水thf（100ml），將反應(yīng)體系置于50℃的油浴中攪拌均勻，再將固體三光氣（1.64g，5.5mmol）和α-蒎烯（α-pinene，2.7ml，16.5mmol）加入反應(yīng)液中；反應(yīng)1h后用將反應(yīng)液自然冷卻至室溫后旋蒸濃縮，之后用石油醚沉淀得到apa-nca粗產(chǎn)品；再將粗產(chǎn)品溶于thf中，然后將溶液旋干，得到白色的產(chǎn)物，再用無(wú)水thf和石油醚重結(jié)晶三次，最終得到亮白色的粉末中固體即為apa-nca（1.65g，產(chǎn)率50%）。apa-nca核磁表征見(jiàn)附圖1，1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.07(s,1h,-chnhco-),4.41(m,1h,-cochnh-),1.65(d,2h,-ch2ch2ch-),1.29(d,2h,-ch2ch2ch3-),0.84(t,3h,-ch2ch3);13cnmr(100mhz,dmso-d6):δ171.66,151.96,57.04,31.33,30.95,29.06,28.91,28.76,28.43,24.26,22.12,13.93;apa-nca的元素分析為c,68.65;h,10.51;n,4.71(理論：c,68.37;h,10.07;n,4.65)。質(zhì)譜:[m+na]+320.2202；（理論：320.2205）。實(shí)施例二peg-b-papa聚氨基酸嵌段共聚物的制備本發(fā)明以端氨基聚乙二醇為引發(fā)劑，通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合制備了兩種papa鏈長(zhǎng)不同的聚合物peg-b-papa。以合成peg5k-b-papa3.5k為例：在n2環(huán)境下，將大分子引發(fā)劑聚乙二醇氨基（mn=5000g/ml，100mg，0.02mmol）的dmf溶液加入到密閉反應(yīng)器中，在攪拌的條件下將apa-nca（94mg，0.32mmol）的dmf溶液加入密閉反應(yīng)器，在35℃的恒溫油浴中反應(yīng)48h至apa-nca單體完全聚合（對(duì)反應(yīng)用紅外監(jiān)測(cè)，apa-nca單體酸酐的羰基吸收峰1841cm-1消失，表明聚合完全）；聚合物溶液在無(wú)水冰乙醚中沉淀，經(jīng)過(guò)過(guò)濾、常溫真空干燥的到產(chǎn)物peg5k-b-papa3.5k。產(chǎn)率：91%。peg-b-papa嵌段共聚物的核磁表征見(jiàn)附圖2。通過(guò)改變引發(fā)劑和單體投料比，可方便制備得到不同分子量和組成的聚合物（表1）。同時(shí)，papa聚氨基酸均聚物和peg-b-papa共聚物在氯仿和四氫呋喃溶劑中展現(xiàn)出了很好的溶解性（表2）。表1聚氨基酸共聚物的表征a：用1hnmr分析端基的計(jì)算結(jié)果；b：gpc的計(jì)算結(jié)果。表2聚氨基酸溶解性的表征溶劑papapeg5k-b-papa3.5kpeg5k-b-papa9.8k氯仿+++++++++四氫呋喃++++++n,n-二甲基甲酰胺-+-二甲亞砜---丙酮---+++:非常好溶解;++:好溶解;+:一定條件下可溶解;-:不溶。實(shí)施例三crgd修飾的peg-b-papa聚合物（crgd-peg-b-papa）的合成本發(fā)明合成了兩種papa鏈長(zhǎng)不同的crgd-peg-b-papa聚合物。以合成crgd-peg6k-b-papa4.2k為例：用丙烯酸修飾的聚乙二醇氨基（aa-peg-nh2，mw=6000g/mol）作為大分子引發(fā)劑，然后按實(shí)施例二方法制備聚合物。分兩步制備crgd-peg6k-b-papa4.2k。首先，aa-peg6k-b-papa4.2k聚合物的制備：在n2環(huán)境下，將大分子引發(fā)劑丙烯酸聚乙二醇氨基（mn=6000g/mol，100mg，0.0167mmol）的dmf溶液加入到密閉反應(yīng)器中，在攪拌的條件下將apa-nca（79.4mg，0.267mmol）的dmf溶液加入密閉反應(yīng)器，在35℃的恒溫油浴中反應(yīng)48h至apa-nca單體完全聚合（對(duì)反應(yīng)用紅外監(jiān)測(cè)，apa-nca單體酸酐的羰基吸收峰1841cm-1消失，表明聚合完全）；聚合物溶液在無(wú)水冰乙醚中沉淀，經(jīng)過(guò)過(guò)濾、常溫真空干燥的到產(chǎn)物aa-peg6k-b-papa4.2k。aa-peg6k-b-papa4.2k嵌段共聚物的核磁表征見(jiàn)附圖3。然后，通過(guò)光點(diǎn)擊化學(xué)法制備crgd-peg6k-b-papa4.2k。在n2環(huán)境下將上述聚合物溶于dmf中，再將crgd-sh和光引發(fā)劑i2959加入聚合物溶液中；然后將反應(yīng)轉(zhuǎn)移至紫外固化箱中冰浴條件下于365nm的紫外光中反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將聚合物溶液用截留分子量為3500的透析袋在dmf中透析24h，之后換蒸餾水透48h，最后冷凍干燥得到白色固體。產(chǎn)率：83%。crgd-peg6k-b-papa4.2k嵌段共聚物的核磁表征見(jiàn)附圖4。實(shí)施例二以及實(shí)施例三的反應(yīng)可表示如下，a為實(shí)施例二，b為實(shí)施例三。實(shí)施例四peg-b-papa聚合物膠束的制備在攪拌狀態(tài)下，將pb緩沖溶液或超純水逐滴滴到peg5k-b-papa3.5k的n,n-二甲基甲酰胺（dmf）溶液中，然后用截留分子量為7000的透析袋透析上述溶液除去有機(jī)溶劑，透析過(guò)程在ph=7.4的pb緩沖液或者純水中進(jìn)行。最終，由動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀（dls）測(cè)得聚合物膠束的尺寸為78nm，粒徑分布較窄。而crgd靶向膠束的制備則是將peg5k-b-papa3.5k和crgd-peg6k-b-papa4.2k按一定摩爾比溶解在1mldmf中，然后用上述透析法制得。靶向聚合物的peg分子量比非靶向聚合物的peg要長(zhǎng)，以保證靶向分子能更好的暴露在膠束表面。聚合物膠束表面crgd密度可通過(guò)調(diào)節(jié)含crgd的crgd-peg6k-b-papa4.2k聚合物的比例來(lái)控制。用含20%摩爾濃度的crgd-peg6k-b-papa4.2k制得的含靶向分子的膠束尺寸較?。?0nm），粒徑分布較窄（圖5a）。由圖5b可知，tem測(cè)得該聚合物膠束為實(shí)心球狀結(jié)構(gòu)。而且，聚合物膠束在10%的胎牛血清環(huán)境中具有較好的穩(wěn)定性（圖5c）。實(shí)施例五聚合物膠束裝載多西紫杉醇及體外釋放載藥膠束的制備與用溶劑置換法制備聚合物膠束的制備方法類似。具體為，將mpeg5k-b-papa3.5k和crgd-peg6k-b-papa4.2k按摩爾比4:1溶于dmf(5mg/ml)中。將聚合物溶液和多西紫杉醇（dtx,10mg/ml,dmf）混勻置于小瓶子中，再將pb（ph=7.4,10mm）緩沖溶液或超純水逐滴滴到其中，然后用截留分子量為7000的透析袋透析上述溶液除去有機(jī)溶劑和游離的藥物，透析過(guò)程在ph=7.4的pb緩沖液或者純水中進(jìn)行。最后用dls測(cè)得載藥膠束的粒徑為60nm左右，粒徑分布在0.18-0.19。hplc測(cè)定dtx的包載效率為74%（表3）。得到的載藥膠束命名為dtx-crgd-pms，表示包載的藥物為dtx，靶向分子為crgd。dtx的體外釋放實(shí)驗(yàn)在37℃恒溫?fù)u床中震蕩（200rpm）進(jìn)行，每組做三個(gè)平行樣。載dtx的靶向膠束在pb(10mm,ph7.4)中，膠束的濃度為0.2mg/ml，取0.5ml放入釋放透析袋（mwco：12,000）中，每個(gè)試管中加入響應(yīng)的透析介質(zhì)25ml，在預(yù)定的時(shí)間間隔取出5.0ml透析袋外部介質(zhì)用作測(cè)試，同時(shí)向試管中補(bǔ)加5.0ml響應(yīng)介質(zhì)。使用hplc測(cè)定溶液中藥物濃度。附圖5d為dtx累積釋放量與時(shí)間的關(guān)系，從圖中可以看出載藥膠束能通過(guò)擴(kuò)散作用釋放藥物。表3載多西紫杉醇膠束的表征（理論載藥量為15%）a：通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得；b：通過(guò)hplc測(cè)得；c：通過(guò)電泳測(cè)得。實(shí)施例六peg-b-papa聚合物囊泡的制備在攪拌狀態(tài)下，將peg5k-b-papa9.8k的thf溶液逐滴滴到pb緩沖溶液或超純水中，然后用截留分子量為7000的透析袋透析上述溶液除去有機(jī)溶劑，透析過(guò)程在ph=7.4的pb緩沖液或者純水中進(jìn)行。最終，由動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀（dls）測(cè)得聚合物囊泡的尺寸為80nm，粒徑分布較窄。而crgd靶向聚合物囊泡則是將peg5k-b-papa9.8k和crgd-peg6k-b-papa10k按摩爾比4:1溶于thf中，配成2mg/ml的溶液。在攪拌狀態(tài)下將聚合物溶液逐滴滴到pb或純水中，然后透析除去有機(jī)溶劑。由動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀（dls）測(cè)得聚合物囊泡的尺寸為80nm，粒徑分布較窄（圖6a）。由圖6b可知，tem測(cè)得聚合物囊泡為空心球狀結(jié)構(gòu)。而且，聚合物囊泡在10%的胎牛血清環(huán)境中仍然保持穩(wěn)定（圖6c）。實(shí)施例七聚合物囊泡載親水性藥物dox·hcl及體外釋放將peg5k-b-papa9.8k和crgd-peg6k-b-papa10k按摩爾比4:1溶于thf中，配成2mg/ml的溶液。將聚合物溶液200μl逐滴滴到800μl的檸檬酸緩沖液(10mm,ph4.0)中，然后用過(guò)飽和的na2hpo3將ph調(diào)至7.8~8.0，然后再將dox·hcl加到溶液中，而后置于37℃搖床（200rpm）中搖過(guò)夜；最后在透析介質(zhì)（pb,10mm,ph7.4）中透析8h，換五次透析液。載不同比例的藥（10~20wt.%）的聚合物囊泡的粒徑在80-90nm，粒徑分布在0.17-0.20。熒光光譜儀測(cè)得dox·hcl的包載效率為68-84%，得到dox-crgd-lpps（表4）。dox·hcl的體外釋放實(shí)驗(yàn)同實(shí)施例五。dox·hcl累積釋放量與時(shí)間的關(guān)系可以看出，dox·hcl可以通過(guò)自有擴(kuò)散作用跨膜釋放（圖6d）。靶向聚合物的peg分子量比非靶向聚合物的peg要長(zhǎng)，以保證靶向分子能更好的暴露在聚合物囊泡的表面。兩者按不同比例混合可制備表明具有不同靶向分子密度的聚合物膠束。本發(fā)明中，膠束體系和囊泡體系的靶向比例均優(yōu)先選擇20wt.%。表4載阿霉素靶向囊泡的表征a：通過(guò)熒光光譜儀測(cè)得；b：通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得；c：通過(guò)電泳測(cè)得。實(shí)施例八mtt法測(cè)試空聚合物膠束和囊泡的細(xì)胞毒性mtt法使用鼠黑色素瘤細(xì)胞（b16f10）人肺癌細(xì)胞（a549）和鼠成纖維細(xì)胞（l929）。以5×103個(gè)/ml將細(xì)胞種于96孔板，每孔100μl，24小時(shí)后養(yǎng)至細(xì)胞貼壁70%左右。然后，實(shí)驗(yàn)組各孔中分別加入含有不同濃度（0.1-1.0mg/ml)的膠束或囊泡樣品（以實(shí)施例四的空聚合物膠束和實(shí)施例六的空聚合物囊泡為例），另設(shè)細(xì)胞空白對(duì)照孔和培養(yǎng)基空白孔（復(fù)4孔）。培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入mtt（5.0mg/ml）10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后每孔加入150μldmso溶解生成的結(jié)晶子，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)吸光度值，以培養(yǎng)基空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。附圖7a為聚合物膠束對(duì)l929和b16f10的細(xì)胞毒性結(jié)果，可看出，當(dāng)聚合物膠束的濃度從0.1增到1.0mg/ml時(shí)，b16f10的存活率仍高于90%，說(shuō)明該聚合物膠束具有良好的生物相容性。聚合物囊泡的細(xì)胞毒性的測(cè)定于此類似，見(jiàn)附圖7b，毒性均很小，具有良好的生物相容性。實(shí)施例九mtt法測(cè)載藥聚合物膠束對(duì)b16f10黑色素瘤細(xì)胞和載藥聚合物囊泡對(duì)a549肺癌細(xì)胞的毒性測(cè)試對(duì)象為實(shí)施例五的dtx-crgd-pms和實(shí)施例七的dox-crgd-lpps，無(wú)靶向的dtx-pms及游離dtx，無(wú)靶向的dox-lpps及l(fā)ipo-dox組分別作為對(duì)照組。細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)施例八相同，納米?；蛩幬锱c細(xì)胞共同培養(yǎng)4小時(shí)后，換新培養(yǎng)基繼續(xù)孵育44h后加入mtt，處理和測(cè)定吸光度同實(shí)施例八。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)附圖8。圖8a結(jié)果顯示dtx-crgd-pms對(duì)b16f10細(xì)胞的半致死濃度（ic50）為0.15μg/ml，比dtx-pms的半致死濃度小2.6倍；附圖8b是載藥囊泡對(duì)a549細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從圖中可以看出dox-crgd-lpps對(duì)a549細(xì)胞的半致死濃度為15.17μg/ml，遠(yuǎn)低于lipo-dox，比dox-lpps的半致死濃度小1倍。說(shuō)明本發(fā)明的膠束和囊泡能很好的將藥物傳送到細(xì)胞內(nèi)，并且有效的釋放，最終殺死癌細(xì)胞，而靶向膠束和靶向囊泡的效果更好。實(shí)施例十靶向和非靶向膠束及囊泡的血液循環(huán)所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心規(guī)定。實(shí)驗(yàn)選用體重為18~20克左右，4~6周齡balb/c小鼠。cy5標(biāo)記的膠束pms-cy5由peg5k-b-papa3.5k和peg5k-b-papa3.5k-cy5按1:1混合制備，此比例形成的cy5標(biāo)記的膠束粒徑為60nm，粒徑分布為0.19。crgd-pms-cy5膠束是由crgd-peg6k-b-papa4.2k和peg5k-b-papa3.5k-cy5按1:1混合制備，形成的聚合物膠束粒徑為60nm左右，粒徑分布為0.18。將pms-cy5和crgd-pms-cy5同過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)（cy5濃度為4μm），在0、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小時(shí)定點(diǎn)取血約10μl，通過(guò)差量法準(zhǔn)確計(jì)算血液重量，再加100μl濃度為1%的曲拉通和600μldmf萃取24h；然后離心（20000rpm，20min）后，取上層清液，通過(guò)熒光光譜儀測(cè)得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)cy5的量。圖9a中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為每克血液中的cy5占總的cy5注射量（id%/g）。由圖9a可知，靶向聚合物膠束、非靶向聚合物膠束在小鼠體內(nèi)的消除半衰期分別為2.73和2.33小時(shí)，所以本發(fā)明的聚合物膠束在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定，有較長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。同上所述，將dox-lpps和dox-crgd-lpps通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)（dox的給藥量為10mg/kg），在0、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小時(shí)定點(diǎn)取血約10μl，通過(guò)差量法準(zhǔn)確計(jì)算血液重量，再加100μl濃度為1%的曲拉通和600μldmf萃取24h；然后離心（20000rpm，20min）后，取上層清液，通過(guò)熒光光譜儀測(cè)得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)dox的量。圖9b中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為每克血液中的dox占總的dox注射量（id%/g）。由圖9b可知，靶向聚合物囊泡、非靶向聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)的消除半衰期分別為3.74、3.33小時(shí)，所以本發(fā)明的聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定，有較長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。實(shí)施例十一dtx-pms和dtx-crgd-pms聚合物膠束在荷b16f10黑色素瘤小鼠及dox-lpps和dox-crgd-lpps聚合物囊泡在荷人a549-luc原位肺癌小鼠的體內(nèi)生物分布動(dòng)物同實(shí)施例十，在c57bl/6黑鼠皮下注射8×107個(gè)b16f10鼠黑色素瘤細(xì)胞，大約7~8天后腫瘤大小為200mm3左右時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將dtx-pms和dtx-crgd-pms和游離的dtx通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)（dtx：10mg/kg），6h后處死老鼠，將腫瘤及心、肝、脾、肺和腎組織取出，清洗稱重后加入500μl的無(wú)水甲醇，通過(guò)勻漿機(jī)磨碎后再加入500μl無(wú)水甲醇萃取24h。最后，離心（20000rpm,20min），取上清液，用高效液相色譜測(cè)所有樣品中dtx的量。圖10a中橫坐標(biāo)為組織器官，縱坐標(biāo)為每克腫瘤或組織中的dtx占總dtx注射量（id%/g）。dtx-pms、dtx-crgd-pms和游離dtx注射6小時(shí)在腫瘤積累的dtx量分別為2.9、7.9和1.3id%/g，dtx-crgd-pms分別為dtx-pms和dtx的2.5倍和5.5倍，說(shuō)明dtx-crgd-pms通過(guò)主動(dòng)靶向在腫瘤部位富集較多。在裸鼠左側(cè)肺葉原位注射8×107個(gè)a549-luc人肺癌細(xì)胞，大約10天后經(jīng)小鼠活體成像儀檢測(cè)小鼠肺部生物發(fā)光強(qiáng)度為106時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將dox-lpps、dox-crgd-lpps和商用lipo-dox通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)（dox·hcl：10mg/kg），6h后處死老鼠，將小鼠心、肝、脾、肺和腎組織取出，清洗稱重后加入500μl的濃度為1%的曲拉通溶液，通過(guò)勻漿機(jī)磨碎后再加入500μln,n-二甲基甲酰胺萃取24h。最后，離心（20000rpm,20min），取上清液，用熒光光譜儀測(cè)所有樣品中dox的量。圖10b中橫坐標(biāo)為組織器官，縱坐標(biāo)為每克腫瘤或組織中的dox占總dox注射量（id%/g）。dox-lpps、dox-crgd-lpps和lipo-dox注射6小時(shí)后在腫瘤積累的dox量分別為3.4、6.1和4.3id%/g，說(shuō)明dox-crgd-lpps通過(guò)主動(dòng)靶向在腫瘤部位富集較多。實(shí)施例十二dtx-crgd-pms和dtx-pms多次低劑量給藥和單次高劑量給藥在荷b16f10皮下黑色素瘤的小鼠中的抑瘤效果、體重變化和存活率腫瘤的接種以及尾靜脈給藥同實(shí)施例十一，在接種四天后，腫瘤大小為30~50mm3時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將dtx-crgd-pms(single-dose)、dtx-crgd-pms(multi-dose40&80mg/kg)、dtx-pms、dtx及pbs分別在第0、2、4、6天（單次給藥組只在第0天給）通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)（dtx藥量為10mg/kg）。在0~10天，每?jī)商鞙y(cè)量小鼠的體重和腫瘤體積，腫瘤體積的計(jì)算方法：v=(l×w2)/2，（其中l(wèi)、w分別為腫瘤的長(zhǎng)度和寬度）。持續(xù)觀察小鼠的生存到40天。由圖11可知，在第十天時(shí)，dtx-crgd-pms治療組腫瘤得到明顯的抑制，而dtx-pms組的腫瘤有一定的增長(zhǎng)，游離dtx對(duì)腫瘤的抑制效果并不明顯；而對(duì)于單次大劑量給藥組，40mg/kg組對(duì)腫瘤的抑制效果不佳，而80mg/kg組顯示出優(yōu)異的抑瘤效果，且各組腫瘤大小照片進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)論。而且各治療組小鼠的體重均沒(méi)有明顯變化，表明在此給藥量下小鼠耐受良好，毒副作用低。在小鼠的存活率方面，dtx-crgd-pms（multi-dose）、dtx-crgd-pms（single-dose40）、dtx-crgd-pms（single-dose80）、dtx-pms、dtx及pbs組的生存中值分別為35d、13d、23d、27d、9d、9d。實(shí)施例十三dox-crgd-lpps和dox-lpps在荷a549-luc原位肺癌的小鼠中的抑瘤效果、體重變化和存活率動(dòng)物同實(shí)施例十一，在5周齡的裸鼠在左側(cè)肺葉上注射5×106的a549-luc人肺癌細(xì)胞，大約2~3周后腫瘤熒光值大約為105~106時(shí)即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將dox-crgd-lpps、dox-lpps、lipo-dox和pbs分別在第0、4、8、12天通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)（dox·hcl注射量：dox-crgd-lpps，dox-lpps組為10.0mg/kg；lipo-dox組為7.5mg/kg）。在第0~20天，每4天稱量小鼠的體重，并對(duì)小鼠進(jìn)行生物發(fā)光成像，通過(guò)熒光值來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤的大小。由圖12可知，在第20天時(shí)，dox-crgd-lpps治療組腫瘤得到明顯的抑制，而dox-lpps和lipo-dox組的腫瘤有一定的增長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)觀察，dox-crgd-lpps、dox-lpps小鼠生存中值分別為36d、24d左右。以peg3.5k-b-papa7k、peg5k-b-papa13k、peg7.5k-b-papa21k、peg10k-b-papa50k為基礎(chǔ)制備的聚合物囊泡、靶向聚合物囊泡，測(cè)試細(xì)胞的存活率都大于90%，毒性均很小，具有良好的生物相容性；載阿霉素聚合物囊泡的粒徑在80納米左右，理論載藥為20%時(shí)包封率達(dá)到83%以上；對(duì)a549細(xì)胞的半致死濃度為15μg/ml左右；在小鼠體內(nèi)的消除半衰期都大于3.2小時(shí)；dox-lpps和dox-crgd-lpps聚合物囊泡納米藥物注射6小時(shí)后在腫瘤積累的dox量分別大于3.2id%/g、6.0id%/g，小鼠生存中值分別為36d、24d左右。以peg10k-b-papa8k、peg7.5k-b-papa6k、peg5k-b-papa5k、peg3.5k-b-papa4k為基礎(chǔ)制備的聚合物膠束、靶向聚合物膠束，測(cè)試細(xì)胞的存活率都大于90%，毒性均很小，具有良好的生物相容性；載多西他賽的聚合物膠束的粒徑在60納米左右，理論載藥為15%時(shí)包封率達(dá)到70%以上；對(duì)b16f10細(xì)胞的半致死濃度（ic50）為0.15μg/ml左右；在小鼠體內(nèi)的消除半衰期都大于2.2小時(shí)；dtx-pms和dtx-crgd-pms聚合物膠束納米藥物注射6小時(shí)后在腫瘤積累的dtx量分別大于2.8id%/g、7.8id%/g，小鼠生存中值分別為35d、26d左右。當(dāng)前第1頁(yè)12