本公開涉及細胞培養(yǎng)領域，具體地，涉及一種組蛋白去乙?；敢种苿┰诩毎囵B(yǎng)中的用途及細胞培養(yǎng)基。
背景技術：
：多能干細胞(pluripotentstemcells，pscs)在體外特定生長因子誘導下可定向分化得到肝臟細胞，是肝臟細胞生物功能分析、藥物篩選、毒理檢測、體內(nèi)移植等操作的潛在的重要細胞來源。但目前由多能干細胞分化所得到的肝臟細胞大都存在以下缺陷：1)細胞成熟性不夠，分化得到的肝臟細胞大都處于發(fā)育的幼稚期，表現(xiàn)為幼稚肝臟細胞標示物afp(alphafetalprotein)蛋白水平較高，一些解毒酶(如cyp3a4)活性較低等；2)細胞群體處于雜合狀態(tài)，體外分化效率無法達到100％，在主要細胞群體外混雜有多種其他細胞類型，表現(xiàn)為肝臟細胞標示物(如albumin白蛋白)染色比例<100％；3)不同多能干細胞株系的定向分化效率相差較大，不同多能干細胞株系建立方法和來源差異以及遺傳和表觀遺傳背景差異，導致不同株系分化得到不同功能體細胞的體外分化效率相差很大，表現(xiàn)為不同干細胞株分化后得到的肝臟細胞在成熟標記物(如albumin白蛋白)表達水平和表達細胞比例相差較大。由于上述問題的存在，多能干細胞分化得到的肝臟細胞在基礎科研和轉(zhuǎn)化醫(yī)學方面的應用受到較大限制。為進一步改善體外分化體系，提高所得肝臟細胞的質(zhì)量，需要對體外分化體系進行針對性的改進。另一方面，體外培養(yǎng)的原代肝臟細胞(來源于人、鼠或其他模式動物肝臟組織)在培養(yǎng)較短時間內(nèi)肝臟細胞特征會有大量丟失，表現(xiàn)為細胞形態(tài)變化，肝臟標示物(如albumin)表達水平等顯著下降。為解決該問題，需要進一步改善原代肝臟細胞的體外培養(yǎng)體系，減緩原代肝臟細胞肝臟特征的丟失。目前用于改進肝臟細胞體外定向分化體系和原代細胞培養(yǎng)體系的方法主要有兩種，第一種是通過調(diào)整生長因子或化合物的使用對體外分化體系或培養(yǎng)體系進行優(yōu)化，該方法的缺陷在于使用的生長因子和化合物種類來源有限制，且往往價格較貴；第二種方法是優(yōu)化體外二維培養(yǎng)體系，通過增加滋養(yǎng)層細胞或利用三維培養(yǎng)體系，對體外分化體系或培養(yǎng)體系進行優(yōu)化，該方法的缺陷在于需要復雜的培養(yǎng)體系，體系的復雜程度高也導致可變因素増多、培養(yǎng)難度大且難以保證細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性和安全性。技術實現(xiàn)要素：本公開的目的是克服現(xiàn)有的肝臟細胞體外定向分化誘導技術和原代肝臟細胞體外培養(yǎng)技術中存在的上述缺陷，提供一種簡便、高效的肝臟細胞體外定向分化及原代肝臟細胞體外培養(yǎng)技術。為達到以上目的，本公開的第一個方面提供組蛋白去乙酰化酶抑制劑在細胞培養(yǎng)中的用途，其中，所述用途為多能干細胞向肝臟細胞的體外定向分化培養(yǎng)或原代肝臟細胞的體外培養(yǎng)。可選的，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑為ci-994(tacedinaline，cas號：112522-64-2)、ms-275(entinostat，cas號：209783-80-2)、fk228(romidepsin，cas-號：128517-07-7)?？蛇x的，所述用途為多能干細胞向肝臟細胞的體外定向分化培養(yǎng)，包括在誘導不成熟肝臟細胞向成熟肝臟細胞分化的培養(yǎng)基中添加濃度為5-10μmol/l的組蛋白去乙酰化酶抑制劑?？蛇x的，所述的用途包括以下步驟：(1)將多能干細胞在含有激活素a和/或p13k抑制劑的第一誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得內(nèi)胚層細胞；(2)將所述內(nèi)胚層細胞在含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白4和/或成纖維生長因子2的第二誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得肝臟祖細胞；(3)將所述肝臟祖細胞在含有肝細胞生長因子的第三誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得不成熟肝臟細胞；(4)將所述不成熟肝臟細胞在含有5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿┮约爸屏鏊豰、肝細胞生長因子和地塞米松的第四誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得肝臟細胞?？蛇x的，所述用途為原代肝臟細胞體外培養(yǎng)，包括在含有工作濃度為5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿┑脑闻K細胞體外培養(yǎng)基中進行原代肝臟細胞體外培養(yǎng)。可選的，所述原代肝臟細胞體外培養(yǎng)基的組成成分包括：在基礎原代肝臟培養(yǎng)基中添加5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿?。本公開的第二個方面提供一種多能干細胞向肝臟細胞體外定向分化培養(yǎng)體系，其中，在誘導不成熟肝臟細胞向成熟肝臟細胞分化的培養(yǎng)基中添加濃度為5-10μmol/l的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑為ci-994、ms-275或fk228?？蛇x的，所述培養(yǎng)體系包括：第一誘導培養(yǎng)基：以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基，添加0.8-1.2％的b27補充物、80-120ng/ml激活素a和4-6μm的p13k抑制劑；第二誘導培養(yǎng)基，以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基，添加0.8-1.2％的b27補充物、16-24ng/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、4-6ng/ml的成纖維生長因子2和0.4-0.6％二甲基亞砜；第三誘導培養(yǎng)基，以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基，添加0.8-1.2％的b27補充物、16-24ng/ml肝細胞生長因子和0.4-0.6％二甲基亞砜；第四誘導培養(yǎng)基，以肝臟培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加16-24ng/ml肝細胞生長因子、16-24ng/ml制瘤素m、80-120nm地塞米松、0.4-0.6％二甲基亞砜和5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿?。本公開的第三個方面提供一種原代肝臟細胞體外培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基含有濃度為5-10μmol/l的組蛋白去乙酰化酶抑制劑。可選的，所述培養(yǎng)基為以原代肝臟培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基添加濃度為5-10μmol/l的ci-994、ms-275或fk228。組蛋白去乙?；敢种苿?histonedeacetylaseinhibitor，hdaci)，簡稱hdacis，是一類化合物，有干擾與組蛋白去乙?；傅墓δ?。組蛋白去乙?；敢种苿┩ǔ？煞譃閮纱箢悾簄ad+依賴性酶和zn2+依賴性酶。zn2+依賴性蛋白酶包括hdacsi、ii、iv亞族；nad+依賴性酶主要是hdacsiii亞族。組蛋白去乙酰化酶抑制劑通過增加細胞內(nèi)組蛋白的乙?；潭?，提高p21等基因的表達水平等途徑，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞分化和(或)凋亡。本公開的發(fā)明人在對肝臟細胞體外定向分化培養(yǎng)的研究和原代肝臟細胞體外培養(yǎng)的研究過程中意外的發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)體系中添加hdaci特別是4-乙酰氨基-n-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(ci-994)能顯著促進分化所得到的肝臟細胞的質(zhì)量和減緩原代肝臟細胞體外培養(yǎng)過程中肝臟特征的丟失。因此，利用本公開所提供的技術方案一方面可以促進多能干細胞向肝臟細胞的分化，獲得分化程度均一、細胞特征保持良好的成熟干細胞；另一方面在原代肝臟細胞的體外培養(yǎng)過程中，能夠幫助原代肝臟細胞在長時間體外培養(yǎng)后仍較好的保持其肝臟細胞特征。本公開的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明附圖是用來提供對本公開的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本公開，但并不構成對本公開的限制。在附圖中：圖1是肝臟細胞成熟標記物白蛋白(albumin)細胞染色；圖2是肝臟細胞成熟標記物白蛋白(albumin)分泌量和不成熟標記物甲胎蛋白(afp)分泌量；圖3是多種肝臟細胞成熟標記物mrna表達水平；圖4是體外培養(yǎng)不同天數(shù)后，肝臟細胞的細胞形態(tài)；圖5是體外培養(yǎng)不同天數(shù)后，肝臟細胞成熟標記物白蛋白(albumin)細胞染色；圖6是體外培養(yǎng)7天數(shù)后，肝臟細胞成熟標記物白蛋白(albumin)分泌量；圖7是體外培養(yǎng)7天數(shù)后，多種肝臟細胞成熟標記物mrna表達水平。具體實施方式以下結合附圖對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。本公開的第一個方面提供組蛋白去乙酰化酶抑制劑在細胞培養(yǎng)中的用途，其中，所述用途為多能干細胞向肝臟細胞的體外定向分化培養(yǎng)或原代肝臟細胞體外培養(yǎng)，其中所述組蛋白去乙?；敢种苿閏i-994(4-乙酰氨基-n-(2-氨基苯基)苯甲酰胺，tacedinaline，cas號：112522-64-2)、ms-275(entinostat，cas號：209783-80-2)、fk228(romidepsin，cas-號：128517-07-7)。在本公開的一種優(yōu)選的實施方式中，所述用途為4-乙酰氨基-n-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(ci-994)細胞培養(yǎng)中的用途。當所述組蛋白去乙?；敢种苿?-乙酰氨基-n-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(ci-994)時，誘導獲得的干細胞的成熟性更高、細胞純度高，原代肝細胞體外培養(yǎng)后肝臟特征保持效果好。其中，所述多能干細胞為具有自我更新、自我復制能力的多潛能細胞，在本公開中，所述多能干細胞可以為任何具有向干細胞方向分化能力的干細胞，其來源可以為從動物體直接分離的多能干細胞，也可以為通過誘導方法所獲得的誘導多能干細胞?？蛇x的，所述用途為多能干細胞向肝臟細胞的體外定向分化培養(yǎng)，包括在誘導不成熟肝臟細胞向成熟肝臟細胞分化的培養(yǎng)基中添加濃度為5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿?，特別優(yōu)選的，所述組蛋白去乙?；敢种苿┑臐舛葹?-10μmol/l。在本公開中，所述不成熟肝臟細胞的概念為本領域技術人員所公知，是指多能干細胞向肝臟細胞定向分化過程中的一個階段，即由肝臟祖細胞進一步分化而來但是還沒有完全發(fā)育為成熟肝臟細胞的細胞分化階段。以胚胎肝臟細胞發(fā)育為例，所述不成熟肝臟細胞可以對應為胎兒肝臟(fetalliver)。所述不成熟肝臟細胞為甲胎蛋白(afp)高表達、白蛋白(albumin)低表達或不表達特征的細胞；誘導獲得的成熟肝臟細胞為具有甲胎蛋白低表達，白蛋白(albumin)、抗去唾液酸糖蛋白受體(asgpr)等高表達特征的細胞。本公開中，對于誘導多能干細胞向肝臟細胞定向分化的方法和所使用的試劑沒有特別的限制，可以為本領域常規(guī)使用的方法和試劑，只要在誘導不成熟肝臟細胞向成熟肝臟細胞分化的培養(yǎng)基中添加組蛋白去乙酰化酶抑制劑即可。可選的，可以為二維或三維培養(yǎng)體系定向分化方法。在本公開的一種具體的實施方式中，所述用途包括以下步驟：(1)將多能干細胞在含有激活素a和/或p13k抑制劑的第一誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天獲得內(nèi)胚層細胞，其中第一誘導培養(yǎng)基具體組成成分包括以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基，添加0.8-1.2％的b27補充物、80-120ng/ml激活素a和4-6μm的p13k抑制劑；(2)將所述內(nèi)胚層細胞在含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白4或成纖維生長因子2的第二誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天獲得肝臟祖細胞，其中第二誘導培養(yǎng)基具體組成為包括以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基，添加0.8-1.2％的b27補充物、16-24ng/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、4-6ng/ml的成纖維生長因子2和0.4-0.6％二甲基亞砜；(3)將所述肝臟祖細胞在含有肝細胞生長因子的第三誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天獲得不成熟肝臟細胞，其中第三誘導培養(yǎng)基具體組成成分包括以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基，添加0.8-1.2％b27補充物、16-24ng/ml肝細胞生長因子和0.4-0.6％二甲基亞砜；(4)將所述不成熟肝臟細胞在含有5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿┮约爸屏鏊豰、肝細胞生長因子和地塞米松的第四誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天獲得肝臟細胞，其中第四誘導培養(yǎng)基具體組成成分包括以肝臟培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加16-24ng/ml肝細胞生長因子、16-24ng/ml制瘤素m、80-120nm地塞米松、0.4-0.6％二甲基亞砜和5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿?。其中，所述肝臟培養(yǎng)基，可以為本領域常規(guī)使用的用于肝臟細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、用于將不成熟肝臟細胞定向分化培養(yǎng)為成熟肝臟細胞的培養(yǎng)基?？梢酝ㄟ^購買商品化產(chǎn)品的方式獲得，或者配制獲得。值得注意的是，針對不同來源的多能干細胞株，所述組蛋白去乙?；敢种苿┑淖钸m用量可能存在一定的差異，可以根據(jù)細胞標記物變化整體分析確定最適用量，而這樣的調(diào)整應被視為沒有脫離本公開的保護范圍。在本公開的一種實施方式中，所述用途為原代肝臟細胞體外培養(yǎng)，包括在含有工作濃度為5-10μmol/l的組蛋白去乙酰化酶抑制劑的原代肝臟細胞體外培養(yǎng)基中進行原代肝臟細胞體外培養(yǎng)；優(yōu)選的，組蛋白去乙酰化酶抑制劑的濃度為8-10μmol/l。其中，所述原代肝臟細胞的來源可以為通過直接膠原酶灌注消化動物肝臟組織或者通過商業(yè)服務機構購買獲得的原代肝臟細胞。本方法對于原代肝臟細胞培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基的組成方式?jīng)]有特別的限制，可以按照本領域常規(guī)的肝臟原代細胞培養(yǎng)方法進行，可以理解的是，只要在原代肝臟細胞的體外培養(yǎng)過程中的任何時間段添加組蛋白去乙?；敢种苿┘纯稍谝欢ǔ潭冉档透渭毎卣鞯膩G失和細胞形態(tài)變化；優(yōu)選的，在整個原代肝臟細胞的培養(yǎng)過程中都添加組蛋白去乙?；敢种苿?。在本公開的一種實施方式中，原代肝臟細胞體外培養(yǎng)的方法為：將獲得的原代肝臟細胞接種在膠原酶預處理的培養(yǎng)板中，在原代肝臟細胞體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)若干天，所述原代肝臟細胞體外培養(yǎng)基為基礎原代肝臟培養(yǎng)基中添加5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿?。本公開的第二個方面提供一種多能干細胞向肝臟細胞體外定向分化培養(yǎng)體系，其中，在誘導不成熟肝臟細胞向成熟肝臟細胞分化的培養(yǎng)基中添加濃度為5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿鼋M蛋白去乙?；敢种苿閏i-994(tacedinaline，cas號：112522-64-2)、ms-275(entinostat，cas號：209783-80-2)、fk228(romidepsin，cas-號：128517-07-7)。優(yōu)選的，所述組蛋白去乙?；敢种苿閏i-994，添加濃度為5-10μmol/l。其中，所述不成熟肝臟細胞為甲胎蛋白(afp)高表達、白蛋白(albumin)低表達或不表達特征的細胞；誘導獲得的成熟肝臟細胞為具有甲胎蛋白低表達，白蛋白(albumin)、抗去唾液酸糖蛋白受體(asgpr)等高表達特征的細胞。本公開中，對于誘導多能干細胞向肝臟細胞定向分化的方法和所使用的培養(yǎng)體系的種類沒有特別的限制，可以為領域常規(guī)培養(yǎng)體系，只要在誘導不成熟肝臟細胞向成熟肝臟細胞分化的培養(yǎng)基中添加組蛋白去乙?；敢种苿┘纯?。可選的，可以為二維或三維培養(yǎng)體系定向分化培養(yǎng)體系。在本公開的一種優(yōu)選的實施方式中，所述培養(yǎng)體系包括：第一誘導培養(yǎng)基：以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基，添加0.8-1.2％的b27補充物、80-120ng/ml激活素a和4-6μm的p13k抑制劑；第二誘導培養(yǎng)基，以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基，添加0.8-1.2％的b27補充物、16-24ng/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、4-6ng/ml的成纖維生長因子2和0.4-0.6％二甲基亞砜；第三誘導培養(yǎng)基，以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基，添加0.8-1.2％b27補充物、16-24ng/ml肝細胞生長因子和0.4-0.6％二甲基亞砜；第四誘導培養(yǎng)基，以肝臟培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加16-24ng/ml肝細胞生長因子、16-24ng/ml制瘤素m、80-120nm地塞米松、0.4-0.6％二甲基亞砜和5-10μmol/l的組蛋白去乙酰化酶抑制劑。本公開的第三個方面提供一種原代肝臟細胞體外培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基含有濃度為5-10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿?。在本公開的一種具體的實施方式中，所述培養(yǎng)基為基礎原代肝臟培養(yǎng)基(購自gibco，貨號17705-021)中添加5-10μmol/l的ci-994、ms-275或fk228。優(yōu)選的，所述組蛋白去乙?；敢种苿?-乙酰氨基-n-(2-氨基苯基)苯甲酰胺，添加濃度為8-10μmol/l。實施例以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。以下實施例中，如無特別說明，所用的各試劑均可通過商購獲得，所用的方法為本領域的常規(guī)方法。實施例1多能干細胞體外定向分化為肝臟細胞(1)將1016誘導性人多能干細胞在含有激活素a或p13k抑制劑的第一誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天獲得內(nèi)胚層細胞。第一誘導培養(yǎng)基具體組成為以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基(購自invitrogen，貨號11875093)，添加1％的b27補充物(購自invitrogen，貨號12587010)、100ng/ml激活素a(購自peprotech，貨號af-120-14e)和5μm的p13k抑制劑(ly-294002，購自selleck，貨號s1105)；(2)將所述內(nèi)胚層細胞在含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白4或成纖維生長因子2的第二誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天獲得肝臟祖細胞。第二誘導培養(yǎng)基具體組成為以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基(購自invitrogen，貨號11875093)，添加1％的b27補充物(購自invitrogen，貨號12587010)、20ng/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4，購自peprotech，貨號120-05)、5ng/ml的成纖維生長因子2(fgf2，購自peprotech，貨號af-100-18b)和0.5％的二甲基亞砜(dmso)；(3)將所述肝臟祖細胞在含有肝細胞生長因子的第三誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天獲得不成熟肝臟細胞。第三誘導培養(yǎng)基具體組成為以rpmi-1640為基礎培養(yǎng)基(購自invitrogen，貨號11875093)，添加1％的b27補充物(購自invitrogen，貨號12587010)、20ng/ml的肝細胞生長因子(hgf，購自peprotech，貨號100-39)和0.5％的二甲基亞砜(dmso)10mol/l的組蛋白去乙?；敢种苿┮约爸屏鏊豰、肝細胞生長因子和地塞米松的第四誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天獲得肝臟細胞。第四誘導培養(yǎng)基具體組成為以肝臟培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基(購自lonza，貨號cc-3198)，添加20ng/ml的肝細胞生長因子(hgf，購自peprotech，貨號100-39)、20ng/ml的制瘤素m(oncostatinm，購自peprotech，貨號300-10)、100nm的地塞米松(dexamethasone，購自sigma，貨號d4902)、0.5％的二甲基亞砜(dmso)和10μmol/l的組蛋白去乙酰化酶抑制劑(ci-994，購自selleck，貨號s2818)。定向誘導分化獲得肝臟細胞1。實施例2利用實施例1的方法將1016誘導性人多能干細胞體外定向分化為肝臟細胞，區(qū)別僅在于，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑ci-994的用量為5μmol/l。獲得肝臟細胞2。實施例3利用實施例1的方法誘導多能干細胞體外定向分化為肝臟細胞，區(qū)別僅在于，所述多能干細胞為hues9人胚胎多能干細胞，組蛋白去乙酰化酶抑制劑ci-994的用量為10μmol/l。獲得肝臟細胞3。實施例4利用實施例1的方法將多能干細胞體外定向分化為肝臟細胞，區(qū)別僅在于，所述多能干細胞為hues9人胚胎多能干細胞，組蛋白去乙?；敢种苿ヽi-994的用量為5μmol/l。獲得肝臟細胞4。實施例5利用實施例1的方法將多能干細胞體外定向分化為肝臟細胞，區(qū)別僅在于，所述多能干細胞為bjrips人誘導性多能干細胞，組蛋白去乙?；敢种苿ヽi-994的用量為10μmol/l。獲得肝臟細胞5。實施例6利用實施例1的方法將多能干細胞體外定向分化為肝臟細胞，區(qū)別僅在于，所述多能干細胞為bjrips人誘導性多能干細胞，組蛋白去乙?；敢种苿ヽi-994的用量為5μmol/l。獲得肝臟細胞6。對比例1利用實施例1的方法將1016誘導性人多能干細胞體外定向分化為肝臟細胞，區(qū)別僅在于，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑替換為等量的dmso。獲得肝臟細胞7。對比例2利用實施例1的方法將hues9人胚胎多能干細胞體外定向分化為肝臟細胞，區(qū)別僅在于，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑替換為等量的dmso。獲得肝臟細胞8。對比例3利用實施例1的方法將bjrips人誘導性多能干細胞體外定向分化為肝臟細胞，區(qū)別僅在于，所述組蛋白去乙?；敢种苿┨鎿Q為等量的dmso。獲得肝臟細胞9。測試例1本測試例用于檢測上述肝臟細胞1-9的分化效果。(1)免疫熒光方法檢測肝臟細胞成熟標記物白蛋白(albumin)表達量對所述肝臟細胞1和7進行albumin免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞的熒光強度。圖1為肝臟細胞1和肝臟細胞7的免疫熒光染色結果，結果顯示，利用本公開所提供的方法的肝臟細胞1的白蛋白細胞表達量顯著增加。(2)利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)檢測肝臟細胞成熟標記物白蛋白(albumin)分泌量和肝臟細胞不成熟標記物甲胎蛋白(afp)分泌量，并用細胞總的rna量進行細胞量的標準化，結果顯示為與相對應的對照組相比的倍數(shù)變化，如表1和圖2所示。表1肝臟細胞albumin分泌量(倍數(shù)變化)afp分泌量(倍數(shù)變化)1016-ci-994-10μmol/l1.790.331016-ci-994-5μmol/l2.560.89hues9-ci-994-10μmol/l2.580.31hues9-ci-994-5μmol/l4.840.95bjrips-ci-994-10μmol/l1.890.67bjrips-ci-994-5μmol/l1.950.231016-dmso11hues9-dmso11bjrips-dmso11圖2為肝臟細胞1和肝臟細胞7的檢測結果，結果顯示，相比于dmso處理組，利用本公開所提供的方法的肝臟細胞1的白蛋白細胞表達量顯著增加，afp分泌量下降。(3)利用熒光定量pcr法檢測多種肝臟細胞成熟標記物mrna表達水平，并用細胞18s表達水平進行標準化，結果顯示為與相對應的對照組相比的倍數(shù)變化，如表2和圖3所示。表2肝臟細胞albafpa1atasgprcyp3a4glut2115.70.322.912.420.982.45220.10.902.572.310.992.3233.10.511.253.140.872.98410.10.982.122.780.892.8754.050.982.572.890.982.8963.970.582.782.741.033.12711111181111119111111圖3為肝臟細胞1和肝臟細胞7的檢測結果，結果顯示，相比于dmso處理組，利用本公開所提供的方法的肝臟細胞多種肝臟細胞成熟標記物mrna表達水平顯著上升(cyp3a4沒有顯著變化)，肝臟細胞不成熟標記物甲胎蛋白(afp)表達量顯著降低。當所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑的用量為10μmol/l范圍內(nèi)時，對多能干細胞向肝臟細胞分化的促進效果更好。實施例7本實施例用于說明原代肝臟細胞的體外培養(yǎng)。(1)取8-10周的小鼠，用膠原酶灌流方法進行原代肝臟細胞分離；(2)將獲得的原代肝臟細胞接種在膠原酶(購自sigma，貨號為c3867-1vl)預處理的培養(yǎng)板中，接種密度為1×105/cm2；(3)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后進行收樣觀察。所述培養(yǎng)基為基礎原代肝臟培養(yǎng)基(購自gibco，貨號17705-021)中添加10μmol/l的組蛋白去乙?；敢种苿＋@得原代肝臟細胞1。實施例8利用實施例1的方法進行原代肝臟細胞的體外培養(yǎng)，區(qū)別僅在于，所述組蛋白去乙?；敢种苿ヽi-994的用量為5μmol/l。獲得原代肝臟細胞2。對比例4利用實施例1的方法進行原代肝臟細胞的體外培養(yǎng)，區(qū)別僅在于，所述組蛋白去乙?；敢种苿┨鎿Q為等量的dmso。獲得原代肝臟細胞3。測試例2本測試例用于檢測上述原代肝臟細胞1和2的培養(yǎng)效果。(1)鏡檢觀察體外培養(yǎng)第3天、第5天、第7天原代肝臟細胞形態(tài)。圖4為原代肝臟細胞1和原代肝臟細胞3的細胞形態(tài)，結果顯示，利用本公開所提供的方法的原代肝臟細胞1的形態(tài)保持好，原代肝臟細胞3的形態(tài)呈現(xiàn)為扁平化、細胞邊緣以及細胞核形態(tài)模糊等凋亡狀態(tài)。(2)免疫熒光方法檢測原代肝臟細胞培養(yǎng)第3天、第5天、第7天成熟標記物白蛋白(albumin)表達量。對所述原代肝臟細胞1和3進行albumin免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞的熒光強度差異。圖5為原代肝臟細胞1和原代肝臟細胞3的免疫熒光染色結果，結果顯示，利用本公開所提供的方法的原代肝臟細胞1的白蛋白細胞表達量更高。(3)利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)檢測肝臟細胞成熟標記物白蛋白(albumin)分泌量，并用細胞總的rna量進行細胞量的標準化，結果顯示為與相對應的對照組相比的倍數(shù)變化，如表3和圖6所示。表3原代肝臟細胞albumin分泌量(倍數(shù)變化)12.7722.331圖6為原代肝臟細胞1和肝臟細胞8的檢測結果，結果顯示，培養(yǎng)7天后，相比于dmso處理組，利用本公開所提供的方法的肝臟細胞1的白蛋白細胞表達量維持在較高水平。(3)為利用熒光定量pcr法檢測多種肝臟細胞成熟標記物mrna表達水平，并用細胞18s表達水平進行標準化，結果顯示為與相對應的對照組相比的倍數(shù)變化，如表4和圖7所示。表4原代肝臟細胞albasgprapoa1apoa5apoc3arg1glut2ces1g18.917.63.418.13.94.32.612.225.613.63.115.22.53.52.19.8311111111圖7為原代肝臟細胞1和原代肝臟細胞3的檢測結果，結果顯示，相比于dmso處理組，培養(yǎng)7天后，利用本公開所提供的方法的原代肝臟細胞多種肝臟細胞成熟標記物mrna表達水平維持在較高水平。當所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑的用量為10μmol/l時，對原代肝臟細胞體外培養(yǎng)過程中肝臟細胞特征保持的效果更好。以上結合附圖詳細描述了本公開的優(yōu)選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本公開的技術構思范圍內(nèi)，可以對本公開的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內(nèi)容。當前第1頁12