本發(fā)明涉及微生物固定技術領域，具體涉及一種微生物載體的制備方法。

背景技術：

固定化微生物技術自問世以來，顯示出廣闊的發(fā)展前景。固定化微生物在乙醇發(fā)酵工業(yè)上成果較為顯著，固定化酵母菌用于發(fā)酵酒精與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝相比，具有速度快、周期短、生產(chǎn)能力高、工藝設備簡單，易于實現(xiàn)連續(xù)化及自動化和產(chǎn)物容易提取等優(yōu)點，并在一定程度上減少發(fā)酵工廠的設備投資和環(huán)境污染。

選擇適宜的固定化微生物載體是實現(xiàn)工業(yè)化的關鍵，而載體的好壞又取決于載體的機械強度、壽命和包埋微生物細胞的容量和活性。固定載體中應用最廣泛的是海藻酸鈣，雖易成形、無毒、成本低廉，但強度差，使用壽命短。其它的一些天然高分子化合物，如瓊脂，明膠和卡拉膠等，雖強度得到改善，但價格偏高。聚乙烯醇作為包埋載體的優(yōu)點有機械強度高、化學性能穩(wěn)定，但是其生物相容性差，對微生物的負載量小。

因此，發(fā)明一種既具有良好的生物相容性，又具有較強的機械強度的新型微生物載體對微生物固定技術領域具有積極的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術問題，針對目前常見的微生物固定載體存在機械強度低、生物相容性差、微生物負載量低的缺陷，提供了一種微生物載體的制備方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是：

一種微生物載體的制備方法，其特征在于具體制備步驟為：

（1）稱取牡蠣殼放入水中加熱煮沸處理，取出煮沸后的牡蠣殼粉碎得到牡蠣殼粉末，將牡蠣殼粉末和鹽酸混合后攪拌反應，再離心處理，分離得到上層液，備用；

（2）稱取棉花秸稈切割成小段，得到棉花秸稈段，將棉花秸稈段和沼液混合后靜置微腐處理，微腐處理結束后粉碎并過50目篩，得到微腐棉花秸稈粉末；

（3）將微腐棉花秸稈粉末和無水乙醇混合后加熱升溫，攪拌反應后得到混合懸浮液，將五氧化二磷和混合懸浮液混合后超聲分散處理，得到分散液，再用氨水調(diào)節(jié)分散液ph至9.0～9.5，得到前驅液；

（4）將備用的上層液和乙二胺四乙酸混合均勻得到滴加液，將滴加液滴入上述前驅液中，進行微波輻照處理，處理結束后靜置陳化，過濾分離得到濾渣；

（5）將上述濾渣放入馬弗爐中，保溫煅燒，得到多孔羥基磷灰石支架，將細葉泥炭蘚和水按等質(zhì)量比混合后研磨，得到苔蘚漿，將多孔羥基磷灰石支架和苔蘚漿混合得到預處理混合物；

（6）將上述預處理混合物放入溫室中，靜置7～9天，靜置結束后得到產(chǎn)物，用水沖洗產(chǎn)物15～20min，自然晾干后即得微生物載體。

根據(jù)權利要求1所述的一種微生物載體的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述的煮沸處理時間為1～2h，牡蠣殼粉末和鹽酸的質(zhì)量比為1:5，鹽酸的濃度為0.1mol/l，攪拌反應時間為1～2h，離心處理轉速為2000～3000r/min，離心處理時間為10～15min。

步驟（2）中所述的小段的長度為1～2cm，棉花秸稈段和沼液的質(zhì)量比為1:3，靜置微腐處理的溫度為35～45℃，靜置微腐處理的時間為3～5天。

步驟（3）中所述的微腐棉花秸稈粉末和無水乙醇的質(zhì)量比為1：10，加熱升溫后的溫度為40～50℃，攪拌反應時間為1～2h，五氧化二磷和混合懸浮液的質(zhì)量比為1:15，超聲分散處理頻率為30～40khz，超聲分散處理時間為30～40min。

步驟（4）中所述的上層液和乙二胺四乙酸的質(zhì)量比20:1，滴加液和前驅液的質(zhì)量比為1:3，微波輻照處理溫度為40～50℃，微波輻照處理功率為450～550w，微波輻照處理時間為4～5h，靜置陳化溫度為4～6℃，靜置陳化時間為5～8h。

步驟（5）中所述的保溫煅燒溫度為800～900℃，保溫煅燒時間為3～4h，多孔羥基磷灰石支架和苔蘚漿的質(zhì)量比為1:3。

步驟（6）中所述的溫室溫度為20～25℃，空氣相對濕度為60～70%，光照強度為800～900lx。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明以主要成分為碳酸鈣的牡蠣殼作為原料，首先煮沸去除有機雜質(zhì)，粉碎后和鹽酸混合，攪拌反應，離心后得到以氯化鈣為主的上層液，再以具有豐富內(nèi)部孔隙結構的棉花秸稈為原料，將其和沼液混合，利用沼液中豐富的微生物對棉花秸稈進行微腐，進一步增加棉花秸稈的孔隙率和比表面積，得到微腐棉花秸稈，再將微腐棉花秸稈和乙醇混合，利用乙醇對其進行羥基化改性，增加了微腐棉花秸稈表面以及內(nèi)部孔隙中的羥基數(shù)量，之后再加入五氧化二磷，利用五氧化二磷和乙醇反應生成磷脂，在氨水作用下，磷脂逐漸水解，磷脂水解產(chǎn)物上的羥基和微腐棉花表面以及內(nèi)部孔隙中的羥基產(chǎn)生化學吸附，使得磷脂水解產(chǎn)物附著在微腐棉花秸稈的內(nèi)部孔隙及表面上，再將以氯化鈣為主的上層液和edta混合，利用edta作為導向劑，首先絡合上層液中的金屬離子，同時利用上層液中各種金屬離子和edta之間絡合穩(wěn)定性的差異來去除雜質(zhì)金屬離子，提高鈣離子的純度，由于鈣離子和edta的絡合穩(wěn)定性最差，使得磷脂水解產(chǎn)物上的磷酸根從edta金屬離子絡合物中最容易奪取鈣離子，奪取的鈣離子和磷脂水解產(chǎn)物上的羥基緩慢結合，產(chǎn)生晶核，隨著時間增長逐漸長大，得到表面負載羥基磷酸鈣的微腐棉花秸稈，最后高溫煅燒去除微腐棉花秸稈模板即可得到高孔隙率的羥基磷灰石載體，再將載體和苔蘚漿混合后在溫室中培養(yǎng)，得到表面負載苔蘚的高孔隙率羥基磷灰石，從而制得微生物載體，首先本發(fā)明的載體骨架為羥基磷灰石，而羥基磷灰石具有極佳的生物相容性，有效解決了常見微生物固定載體生物相容性差的問題，羥基磷酸鈣相比于明膠、聚乙烯醇等載體，其機械強度也得到明顯提高，又彌補了常見微生物載體機械強度低的缺陷；

（2）本發(fā)明將高孔隙率的羥基磷酸鈣作為微生物載體骨架，可以為微生物提供更多的附著位點，提高了微生物的負載量，另外在羥基磷酸鈣骨架外層還附著了一層苔蘚層，苔蘚層疏松多孔的結構又進一步增加了微生物附著的空間，再次提高了微生物載體的負載量，并且苔蘚降解后的產(chǎn)物還能為微生物提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，提高微生物的存活率，具有廣闊的應用前景。

具體實施方式

稱取牡蠣殼放入水中加熱煮沸處理1～2h，取出煮沸后的牡蠣殼放入氣流粉碎機中粉碎30～40min得到牡蠣殼粉末，再按質(zhì)量比為1:5將牡蠣殼粉末和濃度為0.1mol/l鹽酸混合后攪拌反應1～2h，再用離心機以2000～3000r/min轉速離心處理10～15min，分離得到上層液；稱取棉花秸稈切割成長度為1～2cm的小段，得到棉花秸稈段，將棉花秸稈段和沼液按質(zhì)量比為1:3混合后放置在溫度為35～45℃的條件下，靜置微腐處理3～5天，微腐處理結束后粉碎并過50目篩，得到微腐棉花秸稈粉末；將微腐棉花秸稈粉末和無水乙醇按質(zhì)量比為1：10混合后加熱升溫至40～50℃，攪拌反應1～2h后得到混合懸浮液，再按質(zhì)量比為1:15將五氧化二磷和混合懸浮液加入到超聲分散儀中，在頻率為30～40khz的條件下超聲分散處理30～40min得到分散液，再用質(zhì)量分數(shù)為20%氨水調(diào)節(jié)分散液ph至9.0～9.5，得到前驅液；將上層液和乙二胺四乙酸按質(zhì)量比20:1混合均勻得到滴加液，按質(zhì)量比為1:3將滴加液滴入上述前驅液中，在40～50℃下以450～550w的功率微波輻照處理4～5h，處理結束后放置在溫度為4～6℃的條件下靜置陳化5～8h，過濾分離得到濾渣；將濾渣放入馬弗爐中，加熱升溫至800～900℃，保溫煅燒3～4h，得到多孔羥基磷灰石支架，將細葉泥炭蘚和水按等質(zhì)量比混合后放入研缽中研磨20～30min，得到苔蘚漿，再按質(zhì)量比為1:3將多孔羥基磷灰石支架和苔蘚漿混合得到預處理混合物；將預處理混合物放入溫度為20～25℃，空氣相對濕度為60～70%，光照強度為800～900lx的溫室中，靜置7～9天，靜置結束后得到產(chǎn)物，用水沖洗產(chǎn)物15～20min，自然晾干后即得微生物載體。

實例1

稱取牡蠣殼放入水中加熱煮沸處理1h，取出煮沸后的牡蠣殼放入氣流粉碎機中粉碎30min得到牡蠣殼粉末，再按質(zhì)量比為1:5將牡蠣殼粉末和濃度為0.1mol/l鹽酸混合后攪拌反應1h，再用離心機以2000r/min轉速離心處理10min，分離得到上層液；稱取棉花秸稈切割成長度為1cm的小段，得到棉花秸稈段，將棉花秸稈段和沼液按質(zhì)量比為1:3混合后放置在溫度為35℃的條件下，靜置微腐處理3天，微腐處理結束后粉碎并過50目篩，得到微腐棉花秸稈粉末；將微腐棉花秸稈粉末和無水乙醇按質(zhì)量比為1：10混合后加熱升溫至40℃，攪拌反應1h后得到混合懸浮液，再按質(zhì)量比為1:15將五氧化二磷和混合懸浮液加入到超聲分散儀中，在頻率為30khz的條件下超聲分散處理30min得到分散液，再用質(zhì)量分數(shù)為20%氨水調(diào)節(jié)分散液ph至9.0，得到前驅液；將上層液和乙二胺四乙酸按質(zhì)量比20:1混合均勻得到滴加液，按質(zhì)量比為1:3將滴加液滴入上述前驅液中，在40℃下以450w的功率微波輻照處理4h，處理結束后放置在溫度為4℃的條件下靜置陳化5h，過濾分離得到濾渣；將濾渣放入馬弗爐中，加熱升溫至800℃，保溫煅燒3h，得到多孔羥基磷灰石支架，將細葉泥炭蘚和水按等質(zhì)量比混合后放入研缽中研磨20min，得到苔蘚漿，再按質(zhì)量比為1:3將多孔羥基磷灰石支架和苔蘚漿混合得到預處理混合物；將預處理混合物放入溫度為20℃，空氣相對濕度為60%，光照強度為800lx的溫室中，靜置7天，靜置結束后得到產(chǎn)物，用水沖洗產(chǎn)物15min，自然晾干后即得微生物載體。

實例2

稱取牡蠣殼放入水中加熱煮沸處理2h，取出煮沸后的牡蠣殼放入氣流粉碎機中粉碎35min得到牡蠣殼粉末，再按質(zhì)量比為1:5將牡蠣殼粉末和濃度為0.1mol/l鹽酸混合后攪拌反應2h，再用離心機以2500r/min轉速離心處理13min，分離得到上層液；稱取棉花秸稈切割成長度為1cm的小段，得到棉花秸稈段，將棉花秸稈段和沼液按質(zhì)量比為1:3混合后放置在溫度為40℃的條件下，靜置微腐處理4天，微腐處理結束后粉碎并過50目篩，得到微腐棉花秸稈粉末；將微腐棉花秸稈粉末和無水乙醇按質(zhì)量比為1：10混合后加熱升溫至45℃，攪拌反應2h后得到混合懸浮液，再按質(zhì)量比為1:15將五氧化二磷和混合懸浮液加入到超聲分散儀中，在頻率為35khz的條件下超聲分散處理35min得到分散液，再用質(zhì)量分數(shù)為20%氨水調(diào)節(jié)分散液ph至9.3，得到前驅液；將上層液和乙二胺四乙酸按質(zhì)量比20:1混合均勻得到滴加液，按質(zhì)量比為1:3將滴加液滴入上述前驅液中，在45℃下以500w的功率微波輻照處理4h，處理結束后放置在溫度為5℃的條件下靜置陳化7h，過濾分離得到濾渣；將濾渣放入馬弗爐中，加熱升溫至850℃，保溫煅燒3h，得到多孔羥基磷灰石支架，將細葉泥炭蘚和水按等質(zhì)量比混合后放入研缽中研磨25min，得到苔蘚漿，再按質(zhì)量比為1:3將多孔羥基磷灰石支架和苔蘚漿混合得到預處理混合物；將預處理混合物放入溫度為23℃，空氣相對濕度為65%，光照強度為850lx的溫室中，靜置8天，靜置結束后得到產(chǎn)物，用水沖洗產(chǎn)物18min，自然晾干后即得微生物載體。

實例3

稱取牡蠣殼放入水中加熱煮沸處理2h，取出煮沸后的牡蠣殼放入氣流粉碎機中粉碎40min得到牡蠣殼粉末，再按質(zhì)量比為1:5將牡蠣殼粉末和濃度為0.1mol/l鹽酸混合后攪拌反應2h，再用離心機以3000r/min轉速離心處理15min，分離得到上層液；稱取棉花秸稈切割成長度為2cm的小段，得到棉花秸稈段，將棉花秸稈段和沼液按質(zhì)量比為1:3混合后放置在溫度為45℃的條件下，靜置微腐處理5天，微腐處理結束后粉碎并過50目篩，得到微腐棉花秸稈粉末；將微腐棉花秸稈粉末和無水乙醇按質(zhì)量比為1：10混合后加熱升溫至50℃，攪拌反應2h后得到混合懸浮液，再按質(zhì)量比為1:15將五氧化二磷和混合懸浮液加入到超聲分散儀中，在頻率為40khz的條件下超聲分散處理40min得到分散液，再用質(zhì)量分數(shù)為20%氨水調(diào)節(jié)分散液ph至9.5，得到前驅液；將上層液和乙二胺四乙酸按質(zhì)量比20:1混合均勻得到滴加液，按質(zhì)量比為1:3將滴加液滴入上述前驅液中，在50℃下以550w的功率微波輻照處理5h，處理結束后放置在溫度為6℃的條件下靜置陳化8h，過濾分離得到濾渣；將濾渣放入馬弗爐中，加熱升溫至900℃，保溫煅燒4h，得到多孔羥基磷灰石支架，將細葉泥炭蘚和水按等質(zhì)量比混合后放入研缽中研磨30min，得到苔蘚漿，再按質(zhì)量比為1:3將多孔羥基磷灰石支架和苔蘚漿混合得到預處理混合物；將預處理混合物放入溫度為25℃，空氣相對濕度為70%，光照強度為900lx的溫室中，靜置9天，靜置結束后得到產(chǎn)物，用水沖洗產(chǎn)物20min，自然晾干后即得微生物載體。

對照例

以廣東省某公司生產(chǎn)的聚乙烯醇微生物載體作為對比例

用本發(fā)明制得的微生物載體和對照例中的微生物載體同時負載相同的微生物，采用脂磷法測定本發(fā)明和對照例的單位質(zhì)量微生物負載量，并測定本發(fā)明和對照例的抗壓強度值，測定結果如表1

表1

由上述測試數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明制得微生物載體具有良好的生物相容性和優(yōu)異的機械強度，并且生物負載量高，具有廣闊的應用前景。