本發(fā)明屬于熒光免疫分析、有機(jī)合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種均相時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體、螯合劑及制備方法。

背景技術(shù)：

均相免疫分析是一種不經(jīng)沖洗分離結(jié)合與游離標(biāo)記物，在液相中即可直接測(cè)量的分析方法。此方法由于操作簡(jiǎn)便，快速，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，故長(zhǎng)期以來(lái)成為免疫分析方法學(xué)研究追求的主要目標(biāo)之一。

自1972年rubenstein報(bào)告均相酶標(biāo)記免疫分析方法之后，有關(guān)均相和非均相酶標(biāo)記分析報(bào)告多達(dá)10000余份，研究報(bào)告證明均相分析由于不能排除血漿中蛋白，血紅素和多種酶的干擾，使其靈敏度降低，因此最多用于體液中濃度較高的某些藥物的分析。

為解決上述酶作用底物顯色易受血漿成分及外環(huán)境干擾，boguslaski等(1980)用熒光染料代替酶標(biāo)記發(fā)表了熒光均相免疫分析方法。熒光染料光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，被廣泛應(yīng)用，但又遇到新的問(wèn)題，在液相產(chǎn)生raman散射以及其他大分子產(chǎn)生的波長(zhǎng)為300-600nm的本底熒光，與檢測(cè)熒光波長(zhǎng)大部分重疊，而且其發(fā)光壽命都在1-50ns，降低了信號(hào)/噪聲比，使分析的靈敏度降低。均相免疫分析的靈敏度還有一個(gè)限制因素,是其測(cè)量信號(hào)依賴加入啟動(dòng)劑或淬滅劑產(chǎn)生的測(cè)量信號(hào)或清除測(cè)量信號(hào)，這種機(jī)制難以提供足夠強(qiáng)的測(cè)量信號(hào)。

時(shí)間分辨熒光免疫分析(trfia)技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型非放射性免疫分析技術(shù)，它以稀土離子作為熒光探針，量子產(chǎn)率高，stokes位移大，發(fā)射峰窄，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)理想，熒光壽命長(zhǎng)。采用時(shí)間分辨技術(shù)，可消除激發(fā)光源的光、電干擾及樣品池等發(fā)出的短壽命熒光,成為目前無(wú)放射污染的高靈敏度的又有發(fā)展前途的免疫分析方法。

1948年forster提出了熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論,描述了當(dāng)一對(duì)合適的熒光物質(zhì)可以構(gòu)成一個(gè)能量供體(donor)和能量受體(acceptor)對(duì),它們之間由于偶極-偶極的相互作用,激發(fā)供體分子的光子能量hm可能被傳遞至受體分子而后受體分子通過(guò)發(fā)射出光子hmc(hm>hmc)而松弛,其直觀的表現(xiàn)就是供體和受體之間達(dá)到合適的間隔內(nèi)(1～10nm),以供體的激發(fā)光激發(fā),供體產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低得多,而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng),同時(shí)伴隨它們的熒光壽命的相應(yīng)縮短和拉長(zhǎng)。能量傳遞的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對(duì)取向、供體與受體之間的間隔等有關(guān)。

將時(shí)間分辨熒光免疫分析(trfia)技術(shù)和能量共振轉(zhuǎn)移理論(fret)相結(jié)合，為均相免疫分析提供了新的途徑,但實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移的條件是供體(d)與受體(a)之間的距離必須在10nm內(nèi),使d的能量轉(zhuǎn)移至a，使后者發(fā)射出可供測(cè)量的信號(hào),由此可顯著提高信號(hào)/噪聲比。

由于生物樣品的高度復(fù)雜性，對(duì)于均相標(biāo)記用的稀土熒光探針作為能量供體d提出了很高的要求，例如較大的熒光量子產(chǎn)率、摩爾吸光系數(shù)和較長(zhǎng)的熒光壽命、較好的水溶性、穩(wěn)定性，合成簡(jiǎn)便，易于生物分子標(biāo)記，對(duì)所標(biāo)記的生物分子的影響盡可能小等。迄今只有少數(shù)能達(dá)到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用要求，因此，稀土雙功能螯合劑面臨著結(jié)構(gòu)的改進(jìn)和性能的完善。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了提供均相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑，同時(shí)提供了螯合劑的中間體及制備方法。該螯合劑具有較好的水溶性和較長(zhǎng)的熒光壽命。

本發(fā)明首先提供一種均相時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體，該中間體的結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示：

式ⅰ中，r為酯基。

優(yōu)選的是，所述的酯基為甲酯基、乙酯基或叔丁酯基。

本發(fā)明還提供一種均相時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體的制備方法，該方法包括：

將4,13-二氮雜-18-冠-6-醚、naco3和ch3cn加入反應(yīng)瓶中,攪拌溶解,升溫至77-87℃，然后加入6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-酯基溶液，回流反應(yīng)24-60h,冷卻到室溫，減壓濃縮后過(guò)硅膠柱，得到一種時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體。

優(yōu)選的是，所述的6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-酯基為6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酯、6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-乙酯或6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-叔丁酯。

優(yōu)選的是，所述的4,13-二氮雜-18-冠-6-醚與6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-酯基的摩爾比為1:1-1:1.5。

本發(fā)明還提供一種上述中間體制備得到的均相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑，該螯合劑的結(jié)構(gòu)式如式ⅱ所示：

式ⅱ中，r為酯基。

本發(fā)明還提供一種均相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑的制備方法，該方法包括：

將溶劑和中間體加入反應(yīng)瓶，再加入eucl3氯仿液，回流20-60h，冷卻到室溫，減壓濃縮、分離，得到時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑。

優(yōu)選的是，所述中間體與eucl3的質(zhì)量比為1:1-1:2。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明首先提供一種均相時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體及其制備方法，該中間體的結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示，該結(jié)構(gòu)利用含氮雜冠醚具有良好的水溶性，且能與聯(lián)吡啶經(jīng)過(guò)取代反應(yīng)形成穴狀化合物，所述的穴狀結(jié)構(gòu)的化合物既能吸收激發(fā)光并傳遞能量給eu³⁺，又對(duì)eu³⁺有較強(qiáng)的螯合作用，既增加螯合劑的穩(wěn)定性和抗干擾性，又提高了螯合劑的水溶性；且含氮雜冠醚的配位能力介于與堿金屬、堿土金屬?gòu)?qiáng)配位的全氧冠醚和與過(guò)渡金屬離子強(qiáng)配位的全氮大環(huán)多胺之間,它們對(duì)有機(jī)離子及多種金屬離子及有良好的配位能力；在聯(lián)吡啶4位上引入單羧酸乙酯用于連接蛋白分子，有利于減少蛋白質(zhì)分子連接過(guò)程中的副反應(yīng)。

本發(fā)明還提供一種均相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑及其制備方法，該螯合劑的結(jié)構(gòu)式如式ⅱ所示，該螯合劑具有熱穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)螯合穩(wěn)定性、水溶性、有合適的激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)，能與稀土離子實(shí)行能量轉(zhuǎn)移的三重態(tài)和允許在螯合劑和生物分子之間形成共價(jià)連接的功能基團(tuán)，并具有較長(zhǎng)的熒光壽命，可用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。本發(fā)明的螯合劑激發(fā)光譜波長(zhǎng)范圍較寬為200-380nm，最大激發(fā)光為363nm，相對(duì)于原有的對(duì)稱聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)紅移約50nm，有效擴(kuò)展了其激發(fā)范圍；最大發(fā)射光為583nm(⁵d0-⁷f0)⁾,621nm(⁵d0-⁷f2)；斯托克斯位移為258nm；并且獲得了在不同溶劑(dmf、ch3oh)中的熒光光譜和熒光壽命。該螯合劑較好地解決了“提高水溶性”和“激發(fā)波長(zhǎng)紅移”的問(wèn)題，為時(shí)間分辨熒光免疫分析提供了關(guān)鍵技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到均相時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體的質(zhì)譜圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到均相時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體的核磁譜圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例5制備得到的螯合劑的熒光激發(fā)光譜圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例5制備得到的螯合劑的熒光發(fā)射光譜圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例5制備得到的螯合劑在甲醇和dmf溶劑中的熒光壽命圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明首先提供一種均相時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體，該中間體的結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示：

式ⅰ中，r為酯基，優(yōu)選為甲酸甲酯基、甲酸乙酯基或乙酸丁酯基。

本發(fā)明還提供一種均相時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體的制備方法，該方法包括：

將4,13-二氮雜-18-冠-6-醚、naco3和ch3cn加入反應(yīng)瓶中,攪拌溶解,升溫至77-87℃，然后加入6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-酯基溶液，回流反應(yīng)24-60h,優(yōu)選30-40h，冷卻到室溫，減壓濃縮后過(guò)硅膠柱(ch2cl2:ch3oh＝85:15)，得到一種時(shí)間分辨熒光免疫分析中間體。

按照本發(fā)明，所述的6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-酯基優(yōu)選為6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸甲酯、6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-乙酯或6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-叔丁酯。

按照本發(fā)明，所述的4,13-二氮雜-18-冠-6-醚與6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-酯基的摩爾比優(yōu)選為1:1-1:1.5，更優(yōu)選為1：1；所述的4,13-二氮雜-18-冠-6-醚與naco3摩爾比優(yōu)選為1：10。

本發(fā)明還提供一種上述中間體制備得到的均相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑，該螯合劑的結(jié)構(gòu)式如式ⅱ所示：

式ⅱ中，r為酯基，優(yōu)選為甲酯基、乙酯基或叔丁酯基。

本發(fā)明的螯合劑具有熱穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)螯合穩(wěn)定性、水溶性、有合適的激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)，能與稀土離子實(shí)行能量轉(zhuǎn)移的三重態(tài)和允許在螯合劑和生物分子之間形成共價(jià)連接的功能基團(tuán)，并具有較長(zhǎng)的熒光壽命，可用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。本發(fā)明的螯合劑激發(fā)光譜波長(zhǎng)范圍較寬為200-380nm，最大激發(fā)光為363nm，相對(duì)于原有的對(duì)稱聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)紅移約50nm，有效擴(kuò)展了其激發(fā)范圍；最大發(fā)射光為583nm(⁵d0-⁷f0)⁾,621nm(⁵d0-⁷f2)；斯托克斯位移為258nm；并且獲得了在不同溶劑(dmf、ch3oh)中的熒光光譜和熒光壽命。

本發(fā)明還提供一種均相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑的制備方法，該方法包括：

將溶劑和中間體加入反應(yīng)瓶，再加入eucl3氯仿液，回流20-60h，冷卻到室溫，減壓濃縮、分離，得到時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑。

按照本發(fā)明，先將中間體溶于溶劑中，然后將eucl3的氯仿溶液加入到中間體溶液中，回流20-60h，優(yōu)選為24-40h，冷卻到室溫，減壓濃縮、優(yōu)選用三氧化二鋁柱(ch3cn:0.1％的tfa溶液＝7:3)分離，得到時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑。所述的溶劑優(yōu)選為甲醇或乙腈。

按照本發(fā)明，所述中間體與eucl3的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1-1:2；所述的中間體的質(zhì)量(mg)：溶劑的體積(ml)比為16.93：(5-30)，所述的eucl3的質(zhì)量(mg)：氯仿的體積(ml)比為(16.93-33.86)：10。

本發(fā)明的螯合劑在紫外光源激發(fā)下，發(fā)出583nm(⁵d0-⁷f0)⁾,621nm(⁵d0-⁷f2)銪離子特征峰。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

6,6’-{[4，13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸甲酯-na的合成

將78.6mg的4,13-二氮雜-18-冠-6-醚、318mgnaco3、150mlch3cn加入反應(yīng)瓶中,攪拌溶解,升溫至82℃，加入120mg6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸甲酯的ch3cn(50ml)溶液，回流反應(yīng)24h,冷卻到室溫，減壓濃縮后過(guò)硅膠柱(ch2cl2:ch3oh＝85:15)，得到白色固體。產(chǎn)率為45.3％。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的中間體的質(zhì)譜圖，ms(70ev)m/z(％):(m+na)⁺＝523，(m+k)⁺＝539與6,6’-{[4，13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸甲酯-na的分子量理論值相符。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的中間體的核磁譜圖，¹h-nmr(cdcl3,400mhz)δ：8.40-7.41(5h,-c5n)；4.03(3h,-ch3)；3.93(4h,-ch2n)；3.88-2.65(s,24h,c12o4h24n2)。具體解析為：δ：8.40-7.41多重峰，是吡啶環(huán)上的6個(gè)氫；δ：4.03單重峰，4-位羧酸酯中-ch3中的3個(gè)氫；δ：3.93是6,6’-兩個(gè)亞甲基的4個(gè)氫；δ：3.88-2.65為含氮雜冠醚上的24個(gè)氫；δ:7.26是測(cè)樣時(shí)溶劑cdcl3的出峰位置，δ：1.67是水峰，其對(duì)數(shù)據(jù)分析無(wú)影響。¹h-nmr數(shù)據(jù)各氫總數(shù)、出峰位置與c2結(jié)構(gòu)吻合。從上述譜圖可以看出，6,6’-{[4,13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸甲酯na⁺的結(jié)構(gòu)正確。

實(shí)施例2

6,6’-{[4，13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸甲酯-na的合成

將78.6mg的4,13-二氮雜-18-冠-6-醚、318mgnaco3、150mlch3cn加入反應(yīng)瓶中,攪拌溶解,升溫至82℃，加入120mg6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸甲酯的ch3cn(50ml)溶液，回流反應(yīng)30h,冷卻到室溫，減壓濃縮后過(guò)硅膠柱(ch2cl2:ch3oh＝85:15)，得到白色固體。產(chǎn)率36.8％。

實(shí)施例3

6,6’-{[4，13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-乙酯-na的合成

將78.6mg的4,13-二氮雜-18-冠-6-醚、318mgnaco3、150mlch3cn加入反應(yīng)瓶中,攪拌溶解,升溫至77℃，加入120mg6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-乙酯的ch3cn(50ml)溶液，回流反應(yīng)40h,冷卻到室溫，減壓濃縮后過(guò)硅膠柱(ch2cl2:ch3oh＝85:15)，得到白色固體。產(chǎn)率38.8％。

實(shí)施例4

6,6’-{[4，13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-叔丁酯-na的合成

將78.6mg的4,13-二氮雜-18-冠-6-醚、318mgnaco3、150mlch3cn加入反應(yīng)瓶中,攪拌溶解,升溫至87℃，加入120mg6,6’-二溴二甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-叔丁酯的ch3cn(50ml)溶液，回流反應(yīng)24h,冷卻到室溫，減壓濃縮后過(guò)硅膠柱(ch2cl2:ch3oh＝85:15)，得到白色固體。產(chǎn)率38.8％。

實(shí)施例5

6,6’-{[4,13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸甲酯-eu³⁺合成

將實(shí)施例1制備得到的16.93mg中間體溶于5ml甲醇中，得到中間體溶液，將16.93mgeuc13溶解在10ml氯仿，得到euc13溶液，將euc13溶液加入到中間體溶液中回流反應(yīng)20h，冷卻到室溫，減壓濃縮，然后過(guò)三氧化二鋁柱(ch3cn:0.1％的tfa溶液＝7:3)，得到淡黃色晶體。產(chǎn)率為35.3％。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例5制備得到的螯合劑的熒光激發(fā)光譜圖；由圖3可知，該螯合劑的激發(fā)光譜的波長(zhǎng)范圍為200-380nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)為363nm。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例5制備得到的螯合劑的熒光發(fā)射光譜圖；由圖4可知，該螯合劑的激發(fā)波長(zhǎng)為363nm，發(fā)射波長(zhǎng)為583nm、594nm、621nm。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例5制備得到的螯合劑在甲醇和dmf溶劑中的熒光壽命圖，從圖5看出，該螯合劑甲醇液和dmf液的熒光壽命基本相同,約為1456μs.

實(shí)施例6

6,6’-{[4,13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸甲酯-eu³⁺合成

將實(shí)施例2制備得到的16.93mg中間體溶于10ml甲醇中，得到中間體溶液，將16.93mgeuc13溶解在10ml氯仿中，得到euc13溶液，將euc13溶液加入到中間體溶液中回流反應(yīng)24h，冷卻到室溫，減壓濃縮，然后過(guò)三氧化二鋁柱(ch3cn:0.1％的tfa溶液＝7:3)，得到淡黃色晶體。產(chǎn)率39.5％。

實(shí)施例7

6,6’-{[4,13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-乙酯-eu³⁺合成

將實(shí)施例3制備得到的16.93mg中間體溶于25ml甲醇中，得到中間體溶液，將16.93mgeuc13溶入10ml氯仿中，得到euc13溶液，將euc13溶液加入到中間體溶液中，回流反應(yīng)40h，冷卻到室溫，減壓濃縮，然后過(guò)三氧化二鋁柱(ch3cn:0.1％的tfa溶液＝7:3)，得到淡黃色晶體。產(chǎn)率39％。

實(shí)施例8

6,6’-{[4,13-二氮雜-18-冠-6-醚]二(氨甲基)}-2,2’-聯(lián)吡啶-4-叔丁酯-eu³⁺合成

將實(shí)施例4制備得到的16.93mg中間體溶于30ml甲醇中，得到中間體溶液，將33.86mgeuc13溶解在10ml氯仿，得到euc13溶液，將euc13溶液加入到中間體溶液中回流反應(yīng)40h，冷卻到室溫，減壓濃縮，然后過(guò)三氧化二鋁柱(ch3cn:0.1％的tfa溶液＝7:3)，得到淡黃色晶體。產(chǎn)率39％。