本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)稱分裂的方法。

背景技術(shù)：

神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細(xì)胞，它可以通過不對(duì)等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞。根據(jù)分化潛能的時(shí)序分為：主要存在胚胎時(shí)期的神經(jīng)管上皮細(xì)胞、放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)母細(xì)胞，其中，放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元主要存在于幼年時(shí)期，可以分裂并同時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或是膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)母細(xì)胞主要存在于成年動(dòng)物體中，可以產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞、神經(jīng)元和各類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)部位主要分兩類：神經(jīng)嵴干細(xì)胞和中樞神經(jīng)干細(xì)胞。目前將具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞都統(tǒng)稱為神經(jīng)干細(xì)胞。

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面，除了傳統(tǒng)的藥物、手術(shù)及康復(fù)治療外，近年來細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究得到了廣泛開展，主要包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞移植等。2009年，研究者成功的將人胚胎干細(xì)胞注射到脊髓損傷的大鼠體內(nèi)，從而使大鼠恢復(fù)了運(yùn)動(dòng)能力，但直接注射胚脂干細(xì)胞存在形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)證明，利用神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是有效且安全的選擇，神經(jīng)干細(xì)胞不具有成瘤性，具有向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能；是未分化的原始細(xì)胞，不表達(dá)成熟的細(xì)胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識(shí)別，具有低免疫源性；其組織融合性好，可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，并在宿主體內(nèi)長期存活，是最理想的細(xì)胞移植材料。因此，業(yè)內(nèi)一直致力于神經(jīng)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究。

神經(jīng)干細(xì)胞可以由胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和其它干細(xì)胞分化而來。胚胎干細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物的囊胚內(nèi)細(xì)胞群和原始的生殖細(xì)胞著床前胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的一種全能性的多功能神經(jīng)干細(xì)胞，這種細(xì)胞可以在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，因此，提供無致瘤性、且能夠在體外快速增殖、穩(wěn)定傳代、大量培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞成為目前的當(dāng)務(wù)之急。

神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)一直是一個(gè)比較困難的課題，其難點(diǎn)在于兩點(diǎn)，一是所需試劑和因子的濃度配比需要摸索，花費(fèi)了大量的時(shí)間和精力才能達(dá)到最佳的配方；二是傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)是通過懸浮培養(yǎng)神經(jīng)球，觀察神經(jīng)球數(shù)量倍增后，通過離心，擴(kuò)瓶培養(yǎng)達(dá)到傳代的目的。這種懸浮培養(yǎng)的方法，神經(jīng)干細(xì)胞增殪緩慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很難收獲大量的神經(jīng)干細(xì)胞。因此這使得相關(guān)的科研工作者很難得到大量的神經(jīng)干細(xì)胞來進(jìn)行相關(guān)的研究工作。為解決傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)是通過懸浮培養(yǎng)神經(jīng)球，觀察神經(jīng)球數(shù)量倍增后，通過離心，擴(kuò)瓶培養(yǎng)達(dá)到傳代的目的，這種懸浮培養(yǎng)的方法，神經(jīng)干細(xì)胞增殖緩慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很難收獲大量的神經(jīng)干細(xì)胞等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)稱分裂的方法。

達(dá)到上述目的，本發(fā)明所述的進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)稱分裂的方法，

其特征步驟包括：

(1)、獲取包含神經(jīng)干細(xì)胞的混合細(xì)胞群體，

(2)、將細(xì)胞重新接種在包含下述成分的培養(yǎng)基中：(a)egf家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物；和(b)fgf受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物，

(3)、培養(yǎng)細(xì)胞，

(4)、收獲細(xì)胞聚集體，

(5)、將細(xì)胞重新接種在包含下述成分的培養(yǎng)基中：(a)egf家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物和(b)fgf受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物，

(6)培養(yǎng)細(xì)胞，

(7)將細(xì)胞以單細(xì)胞形式重新接種在包含下述成分的培養(yǎng)基中：

(a)egf家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物和(b)fgf受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物。

本發(fā)明可通過選擇表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異標(biāo)記的細(xì)胞補(bǔ)充本方法，例如將此類表達(dá)標(biāo)記連接于與其在分化后代中的表達(dá)相比，優(yōu)選在神經(jīng)干細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。該方法優(yōu)選包括于65%或低于65%匯合，更優(yōu)選于55%或低于55%匯合，特別是低于50%匯合時(shí)傳代細(xì)胞。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：提供了一種更加穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)方法，通過原代神經(jīng)干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，達(dá)到純化細(xì)胞的目的，之后加入血清進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，極大的加強(qiáng)了神經(jīng)干細(xì)胞的活性，提高了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖速度。使神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)更加的穩(wěn)定，更容易建成相應(yīng)的神經(jīng)干細(xì)胞系，可以收獲大量的神經(jīng)干細(xì)胞而不會(huì)出現(xiàn)像傳統(tǒng)培養(yǎng)方法那樣因沒有足夠的神經(jīng)干細(xì)胞而不能進(jìn)行相關(guān)科研工作的尷尬情況，培養(yǎng)過程中可以更加直觀的觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)，可以做一些懸浮細(xì)胞無法進(jìn)行的鑒定工作，并且本發(fā)明的制備方法更加簡單，便于操作，節(jié)省了大量的工作時(shí)間，方法簡單，操作容易，非常適合科研工作的使用，節(jié)省了科研工作人員大量的時(shí)間和精力。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描迷。

本發(fā)明實(shí)施例所采用的，包括神經(jīng)組織保存液、神經(jīng)組織洗滌液、神經(jīng)組織分解液、細(xì)胞洗滌液、原代細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞消化液、繼代細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞凍存液等，其中，繼代細(xì)胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細(xì)胞的含血清生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50ug/ml的胎牛血清、long／ml的bfgf、long／ml的egf、0.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成。繼代細(xì)胞培養(yǎng)液為獲得的神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)液，使神經(jīng)干細(xì)胞得以貼壁培養(yǎng)，具有更強(qiáng)的活性。所述的神經(jīng)組織保存液為含有鏈霉素50ug/ml、青霉素50ug／ml的rpmi-1640、dmem、a-mem、dmem/f12中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基。神經(jīng)組織保存液的作用是保證神經(jīng)組織在取樣后的活性以及滅菌。神經(jīng)組織洗滌液為含有青霉素50ug/ml、鏈霉素50ug/ml的生理鹽水、pbs、d-hanks中的一種。神經(jīng)組織洗滌液的作用是洗滌神經(jīng)組織并除去血液以及滅菌。神經(jīng)組織分解液為含膠原酶i／膠原酶ivlmg／ml、脫氧核糖核酸io.img／ml的dmem、dmem/f12、mem、rpmi-1640中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基。神經(jīng)組織分解液的作用是消化神經(jīng)組織，獲得單細(xì)胞懸液。細(xì)胞洗滌液為pbs/d-hanks。細(xì)胞洗滌液的作用是洗滌獲得的干細(xì)胞去除各種液體殘留。原代細(xì)胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細(xì)胞的無血清生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、long／ml的bfgf、long／ml的egf、15ug/ml的b27、loug／ml的n2、0.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成。原代細(xì)胞培養(yǎng)液為無血清生長培養(yǎng)基，用于懸浮神經(jīng)干細(xì)胞形成神經(jīng)球。細(xì)胞消化液為含1.5mg/ml的胰蛋白酶、0.img／ml的edta晌pbs。細(xì)胞消化液的作用是細(xì)胞傳代時(shí)，消化貼壁的神經(jīng)干細(xì)胞。細(xì)胞凍存液為含dms050mg/ml的神經(jīng)干細(xì)胞胎牛血清生長培養(yǎng)基。細(xì)胞凍存液的作用是凍存獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。

其制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法如下，

l、在無菌條件取得神經(jīng)組織放入神經(jīng)組織保存液中，并在4。c的溫度條件下密封保存；

2、將步驟l中的神經(jīng)組織從神經(jīng)組織保存液中取出，并使用神經(jīng)組織洗滌液漂洗；

3、將步驟2中漂洗后的腦神經(jīng)組織切成碎塊，并加入2倍體積的神經(jīng)組織分解液，同時(shí)放入35。c的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化分解45分鐘，每隔3分鐘取出震蕩一次；

4、向步驟3中消化分解后的液體中加入繼代細(xì)胞培養(yǎng)液，均勻混合盾，混合液通過200目的細(xì)胞篩，收集過濾液，并使過濾液在1500轉(zhuǎn)／分鐘的條件下離心8分鐘，其中，繼代細(xì)胞培養(yǎng)液是神經(jīng)組織分解液體積的2倍；

5、離心后的過濾液去掉上清液，加入原代細(xì)胞培養(yǎng)液，使溶液中的細(xì)胞濃度為2×105個(gè)／毫升，并保持溶液中細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)后即得到po代神經(jīng)干細(xì)胞。

利用步驟5中培養(yǎng)得到的po代神經(jīng)干細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)的方法包括以下步驟：

(1)pl代神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)：①繼續(xù)培養(yǎng)po代神經(jīng)干細(xì)胞，當(dāng)po代神經(jīng)干細(xì)胞聚集成球后，將其在1500轉(zhuǎn)／分鐘的條件下離心8分鐘；②離心后的培養(yǎng)液去掉上清液，加入繼代細(xì)胞培養(yǎng)液，并使培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度為l×105個(gè)／毫升，接種培養(yǎng)后即得到pl代神經(jīng)干細(xì)胞；

(2)p2代神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)：繼續(xù)培養(yǎng)pl代神經(jīng)干細(xì)胞，當(dāng)pl代神經(jīng)干細(xì)胞密度5/11頁達(dá)到80%時(shí)，將繼代細(xì)胞培養(yǎng)液倒出，加入細(xì)胞洗滌液，震蕩洗滌后將細(xì)胞洗滌液倒出，重復(fù)洗滌2次后，加入細(xì)胞消化液，同時(shí)放入35。c的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化30秒后取出，加入繼代細(xì)胞培養(yǎng)液貼壁傳代培養(yǎng)后即得到p2代神經(jīng)干細(xì)胞；

(3)p3代神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)：①繼續(xù)培養(yǎng)p2代神經(jīng)干細(xì)胞，p2代神經(jīng)干細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，將繼代細(xì)胞培養(yǎng)液倒出，加入細(xì)胞洗滌液，震蕩洗滌后將細(xì)胞洗滌液倒出，重復(fù)洗滌2次后，加入細(xì)胞消化液，同時(shí)放入35。c的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化30秒后取出，加入

繼代細(xì)胞培養(yǎng)液并使細(xì)胞懸浮，將培養(yǎng)液在1500轉(zhuǎn)／分鐘的條件下離心8分鐘，去掉上清液，再次將培養(yǎng)液在1500轉(zhuǎn)／分鐘的條件下離心8分鐘，去掉上清液，加入細(xì)胞凍存液，使培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度為1×105個(gè)／毫升，并將培養(yǎng)液在-80。c的溫度條件下凍存；②取出凍存的p2代神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，放入至37。c水浴鍋中快速震蕩使其融化，加入繼代細(xì)胞培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)后即得到p3代神經(jīng)干細(xì)胞。

本發(fā)明的培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，原代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，而純化細(xì)胞之后，采取了貼壁培養(yǎng)的方式來獲得神經(jīng)干細(xì)胞。如此操作使得神經(jīng)干細(xì)胞的活性大大增強(qiáng)，使細(xì)胞的培養(yǎng)過程更加穩(wěn)定，使細(xì)胞可以進(jìn)行更高代次的傳代甚至可以形成神經(jīng)干細(xì)胞系；可以收獲大量的神經(jīng)干細(xì)胞而不會(huì)出現(xiàn)像傳統(tǒng)培養(yǎng)方法那樣因沒有足夠的神經(jīng)干細(xì)胞而不能進(jìn)行相關(guān)科研工作的尷尬情況；貼壁培養(yǎng)使得觀察細(xì)胞更直觀，可以做一些懸浮細(xì)胞無法進(jìn)行的鑒定工作，如免疫組化等；并且本發(fā)明的制備方法更加簡單，便于操作，節(jié)省了大量的工作時(shí)間。

另外經(jīng)過試驗(yàn)得知，使用實(shí)施例方法可以得到如下結(jié)果，可以在3周內(nèi)(21天)獲得pl代神經(jīng)干細(xì)胞2.3×107個(gè)，至p3代可得1×109個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，因此可以表明利用本試劑盒及該制備方法可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的神經(jīng)干細(xì)胞。