本發(fā)明涉及一種生物菌株，具體涉及一株天然藥用真菌子實體伴生細菌-黃褐假單胞菌，本發(fā)明還涉及該菌株在提高竹紅菌素產(chǎn)量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

竹黃菌（shiraiabambusicolap.heen）又名天竹花、竹三七等，屬于子囊菌亞門（ascomycotina）、肉座菌科（hypocreaceae）、竹黃屬（sharaia）。竹黃菌主要寄生于短穗竹屬（brachystachyumkeng.）竹子的細嫩枝干上，形成粉紅色、龜裂瘤狀的子實體，稱作竹黃，其主要分布在中國南部的浙江、云南等地，作為我國傳統(tǒng)珍稀藥用真菌，具有止咳祛痰、祛風利濕等功效，常被用于治療虛寒胃痛、坐骨神經(jīng)痛、氣管炎等疾癥?，F(xiàn)代藥理學研究表明竹紅菌素（hypocrellins,has）是竹黃菌的主要活性成分，包括竹紅菌甲素（hypocrellina,ha）、乙素（hypocrellinb,hb）、丙素（hypocrellinc,hc）及丁素（hypocrellind,hd），其中竹紅菌甲素ha是最主要的成分。目前竹紅菌素在臨床上用于治療外陰白斑、皮膚白色病變以及瘢痕疙瘩等皮膚病。同時，竹紅菌素作為非卟啉類的新型光敏劑，有更廣的吸收光譜、更好的光誘導(dǎo)單線態(tài)氧（molecularsingleoxygen,¹o2）產(chǎn)生能力、較低的光暗毒性等優(yōu)點，使其在各種皮膚病、腫瘤、病毒等的光化學療法（photodynamictherapy，pdt）上的應(yīng)用潛能受到人們廣泛的關(guān)注，具有廣泛的應(yīng)用價值。

由于竹黃野生資源有限，竹紅菌素產(chǎn)量低成為了其醫(yī)療及工業(yè)中應(yīng)用最大的障礙，因此竹黃菌液態(tài)深層發(fā)酵成了生產(chǎn)竹紅菌素的首選方法。但目前通過人工發(fā)酵方法所產(chǎn)竹紅菌素產(chǎn)量較低，為了提高竹紅菌素產(chǎn)量，常用的方法包括人工培育子實體、化學合成、選育高產(chǎn)菌株、優(yōu)化培養(yǎng)條件、添加誘導(dǎo)子等。而通過外源誘導(dǎo)提高竹紅菌素產(chǎn)量的研究較少。如：du等人從竹子中分離得到的內(nèi)生真菌的甲醇/氯仿提取物能夠刺激提高竹紅菌素產(chǎn)量，但粗提物有效成分未見報道，所以并不能確定發(fā)揮刺激作用的有效成分（duw,liangz,zoux,etal.effectsofmicrobialelicitoronproductionofhypocrellinbyshiraiabambusicola.foliamicrobiologica,2013,1-7.）。另有在竹黃菌中轉(zhuǎn)入竹紅菌素合成過程中關(guān)鍵基因來提高其含量，如deng等人將竹紅菌素合成關(guān)鍵酶基因多銅氧化酶(mco)在竹黃菌中過表達，該方法對于提高竹紅菌素產(chǎn)量效果顯著（dengh,gaor,chenj,etal.anefficientpolyethyleneglycol-mediatedtransformationsystemoflentiviralvectorinshiraiabambusicola.processbiochemistry,2016,1357-1362.），但由于基因工程目前處于嘗試階段，尚無大規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用。

因此，尋求新的外源誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，以提高竹紅菌素產(chǎn)量，對于竹紅菌素的推廣應(yīng)用有著重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一株提高竹紅菌素發(fā)酵產(chǎn)率的伴生細菌菌株，并提供利用該菌株提高竹紅菌素產(chǎn)量的方法。

為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一株提高竹紅菌素發(fā)酵產(chǎn)率的伴生細菌菌株，其分類名稱為：黃褐假單胞菌（pseudomonasfulva），其保藏編號為cgmccno.13931，保藏日期為2017年3月27日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

本發(fā)明的上述細菌是從竹黃子實體分離得到的野生型菌株，已進行保藏，其生物學特征：

1、菌落形態(tài)特征：在基礎(chǔ)lb培養(yǎng)基上生長良好，細菌菌落特征：黃褐假單胞菌（pseudomonasfulva）菌株在lb平板培養(yǎng)基上為奶油黃色，菌落混濁半透明，表面光滑濕潤，邊緣整齊。

2、菌體形態(tài)特征：菌體細胞呈短桿狀，有莢膜，大小為0.5×1.0μm。

3、主要生理生化特征：在4～37℃條件下生長狀況良好，最優(yōu)條件為30℃，革蘭氏染色鑒定其為革蘭氏陰性菌，通過極性鞭毛運動，具有嚴格的呼吸型代謝，具有精氨酸水解途徑，可利用d-核糖、甘露糖核糖醇、酮基-d-葡萄糖酸葡萄糖等。

該菌株16srdna基因序列見附頁，與黃褐假菌（p.fulva）及類黃色假單胞菌（p.parafulva）相似度達99%。

該菌株基因序列，經(jīng)序列同源性分析、blast比對、形態(tài)特征及生理生化指標等比對，鑒定為黃褐假單胞菌（p.fulva）。

本發(fā)明實現(xiàn)另一發(fā)明目的的技術(shù)方案是，伴生細菌菌株黃褐假單胞菌（p.fulva）在發(fā)酵法制備竹紅菌素中的應(yīng)用。

具體的應(yīng)用方法為，將所述伴生細菌活菌加入到培養(yǎng)了5～7d的竹黃菌發(fā)酵液中，繼續(xù)培養(yǎng)獲得竹紅菌素。優(yōu)選地，將所述伴生細菌活菌加入到培養(yǎng)了6d的竹黃菌發(fā)酵液中，促進效果最為明顯。

上述技術(shù)方案中，每50ml竹黃菌發(fā)酵液中加入所述伴生細菌活菌的菌液1ml，菌液濃度為10³～10⁵/ml。

所述伴生細菌活菌的菌液制備方法是，取黃褐假單胞菌單個菌落置于lb培養(yǎng)基中，在30℃下，搖床震蕩培養(yǎng)8h獲得種子液，取1ml種子液于lb培養(yǎng)基中同樣條件下培養(yǎng)12h，4000rpm離心10min，去上清，加入無菌水調(diào)整菌液濃度為10³～10⁵/ml。

其中，所述lb培養(yǎng)基為，胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，ph7.2-7.4。

上述技術(shù)方案中，所述竹黃菌發(fā)酵液的制備方法是，取竹黃菌小塊置于pdb培養(yǎng)基，在28℃下，搖床震蕩培養(yǎng)6d。

其中，竹黃菌小塊的大小為3×3mm，pdb培養(yǎng)基的組分為，土豆200g/l，葡萄糖20g/l，酵母浸膏5g/l，kh2po43g/l，mgso40.75g/l，鹽酸硫胺0.01g/l。

加入所述伴生細菌活菌后，繼續(xù)培養(yǎng)至8d收取竹黃菌菌絲。

由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點：

本發(fā)明的伴生細菌加入培養(yǎng)中的竹黃菌培養(yǎng)液中，可使竹紅菌素含量提高至2.7倍左右，且對人畜無毒害作用，對環(huán)境無污染。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1中培養(yǎng)的黃褐假單胞菌（pseudomonasfulva）的形態(tài)特征。

本發(fā)明提供的黃褐假單胞菌（pseudomonasfulva）已經(jīng)于2017年3月27日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號）進行保藏，保藏編號為cgmccno.13931。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述：

實施例1：

本實施例中采用了一株提高竹紅菌素發(fā)酵產(chǎn)率的伴生細菌菌株，其分類名稱為：黃褐假單胞菌（pseudomonasfulva），其保藏編號為cgmccno.13931，保藏日期為2017年3月27日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

黃褐假單胞菌（pseudomonasfulva）的形態(tài)特征參見附圖1所示。

本實施例中，lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，ph7.2-7.4。pdb培養(yǎng)基：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，酵母浸膏5g/l，kh2po43g/l，mgso40.75g/l，鹽酸硫胺0.01g/l。

取本發(fā)明的黃褐假單胞菌單個菌落置于lb培養(yǎng)基中，在30℃下，搖床震蕩培養(yǎng)8h，取1ml種子液于lb培養(yǎng)基中同樣條件下培養(yǎng)12h，4000rpm離心10min，去上清，加入無菌水調(diào)整菌液濃度為10³/ml。

取竹黃菌小塊（3×3mm）置于pdb培養(yǎng)基，在28℃下，搖床震蕩培養(yǎng)6d，取1ml細菌種子液（10³/ml）加入，繼續(xù)培養(yǎng)至8d收取竹黃菌菌絲，稱重，并提取檢測竹紅菌素含量。

將相同體積的無菌水代替菌液，其余內(nèi)容相同，作空白對照組。

結(jié)果如下：

細菌處理后的竹黃菌其竹紅菌素含量（18.66mg/g）明顯優(yōu)于對照組（8.30mg/g），竹紅菌素含量提高了2.25倍。

實施例2：

本實施例中，lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，ph7.2-7.4。pdb培養(yǎng)基：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，酵母浸膏5g/l，kh2po43g/l，mgso40.75g/l鹽酸硫胺0.01g/l。

取本發(fā)明的黃褐假單胞菌單個菌落置于lb培養(yǎng)基中，在30℃下，搖床震蕩培養(yǎng)8h，取1ml種子液于lb培養(yǎng)基中同樣條件下培養(yǎng)12h，4000rpm離心10min，去上清，加入無菌水調(diào)整菌液濃度為10⁴/ml。

取竹黃菌小塊（3×3mm）置于pdb培養(yǎng)基，在28℃下，搖床震蕩培養(yǎng)6d，取1ml細菌種子液（10⁴/ml）加入，繼續(xù)培養(yǎng)至8d收取竹黃菌菌絲，稱重，并提取檢測竹紅菌素含量。

將相同體積的無菌水代替菌液，其余內(nèi)容相同，作空白對照組。

結(jié)果如下：

細菌處理后的竹黃菌其竹紅菌素含量（22.52mg/g）明顯優(yōu)于對照組（8.30mg/g），竹紅菌素含量提高了2.71倍。

實施例3：

本實施例中，lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，ph7.2-7.4。pdb培養(yǎng)基：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，酵母浸膏5g/l，kh2po43g/l，mgso40.75g/l鹽酸硫胺0.01g/l。

取本發(fā)明的黃褐假單胞菌單個菌落置于lb培養(yǎng)基中，在30℃下，搖床震蕩培養(yǎng)8h，取1ml種子液于lb培養(yǎng)基中同樣條件下培養(yǎng)12h，4000rpm離心10min，去上清，加入無菌水調(diào)整菌液濃度10⁵/ml。

取竹黃菌小塊（3×3mm）置于pdb培養(yǎng)基，在28℃下，搖床震蕩培養(yǎng)6d，取1ml細菌種子液（10⁵/ml）加入，繼續(xù)培養(yǎng)至8d收取竹黃菌菌絲，稱重，并提取檢測竹紅菌素含量。

將相同體積的無菌水代替菌液，其余內(nèi)容相同，作空白對照組。

結(jié)果如下：

細菌處理后的竹黃菌其竹紅菌素含量（17.43mg/g）明顯優(yōu)于對照組（8.30mg/g），竹紅菌素含量提高了2.10倍。

實施例4：

在實施例1中其它條件相同的情況下，改變加入菌液的時間進行效果對比實驗，結(jié)果表明，在竹黃菌培養(yǎng)0-4d時加入菌液，會抑制竹紅菌素的合成，處理后的竹黃菌中竹紅菌素含量低于5.44mg/g，在第5天和第7天加入菌液，竹紅菌素含量為10.35～13.48mg/g，與對照組相比能明顯促進竹紅菌素的合成，在第6天加入菌液促進效果最明顯。

sequencelisting

<110>蘇州大學

<120>一株提高竹紅菌素發(fā)酵產(chǎn)率的伴生細菌菌株及其應(yīng)用

<130>t17189t

<160>1

<210>1

<211>1075

<212>dna

<213>黃褐假單胞菌(pseudomonasfulva)

<400>1

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