本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因(mmmlo)的克隆和其在脅迫條件下的表達(dá)。

背景技術(shù)：

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列復(fù)雜而嚴(yán)密的防御機(jī)制，使自身免受病原物的侵害，其中涉及到一系列抗病相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控。mlo(mildewresistancelocus0)基因是一類(lèi)與植物廣譜高效抗性相關(guān)的基因，在植物廣譜抗白粉病理論和應(yīng)用研究方面具有重要價(jià)值，同時(shí)在調(diào)控植物抵抗生物和非生物脅迫方面起著重要作用。

mlo基因最初在大麥中被發(fā)現(xiàn)，具有完整的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(tm1-tm7)。mlo對(duì)植物的抗病過(guò)程起負(fù)調(diào)控作用，在一定程度上相當(dāng)于植物“感病”基因。野生型mlo基因是大麥(hordeumvulgare))抗白粉病的負(fù)調(diào)控因子，隱性突變的m1o基因介導(dǎo)了大麥對(duì)白粉菌(b.graminisf.sp.hordei，bgh)的廣譜抗性。

目前除大麥、擬南芥外，在番茄、甜瓜、水稻、月季和大豆等作物中均發(fā)現(xiàn)mlo基因。無(wú)論是利用反義干擾阻止mlo表達(dá)、通過(guò)誘變技術(shù)獲得新的m1o種質(zhì)資源、還是天然突變材料，均對(duì)白粉病具有廣譜抗性。但作為防御蛋白，目前關(guān)于mlo基因和非生物環(huán)境脅迫之間的關(guān)系研究還較少。

我國(guó)是桑樹(shù)的起源中心，種質(zhì)資源極為豐富。經(jīng)過(guò)桑樹(shù)種質(zhì)資源及育種工作者幾十年的努力，現(xiàn)在全國(guó)已收集保存有近3000份桑樹(shù)種質(zhì)資源，其中不少資源都具有果用價(jià)值、藥用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值等。我們用克隆得到的魯桑品種(morusmulticaulis)育71-1mmmlo基因全長(zhǎng)序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析其序列特征。同時(shí)，利用熒光定量pcr的方法檢測(cè)了mmmlo在干旱、高鹽、低溫脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律。通過(guò)對(duì)該基因的研究，使我們從分子水平了解到桑樹(shù)mmmlo基因在不同脅迫條件下的表達(dá)情況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因(mmmlo)克隆和其在非生物脅迫條件下的表達(dá)，可以看桑樹(shù)中的白粉病相關(guān)基因在環(huán)境脅迫下的表達(dá)調(diào)控。

對(duì)于桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因作為植物非生物脅迫表達(dá)標(biāo)志物中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述植物為桑樹(shù)，其拉丁文學(xué)名為morusmulticaulis。

作為優(yōu)選，所述的非生物脅迫為干旱、高鹽、低溫脅迫。

對(duì)于桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因編碼的mlo蛋白，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

上述桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因編碼的mlo蛋白作為植物非生物脅迫表達(dá)標(biāo)志物中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述植物為桑樹(shù)，其拉丁文學(xué)名為morusmulticaulis。

作為優(yōu)選，所述的非生物脅迫為干旱、高鹽、低溫脅迫。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明完善桑樹(shù)基因組同時(shí)探究桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因(mmmlo)在非生物脅迫條件的表達(dá)分析，桑樹(shù)mmmlo的克隆將為進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病桑樹(shù)新品種奠定基礎(chǔ)，，可有效彌補(bǔ)常規(guī)育種技術(shù)的不足，從而加速桑樹(shù)抗性新品種的選育進(jìn)程。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1為熒光定量rt-pcr檢測(cè)mmmlo基因在高鹽脅迫下桑苗嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量圖；ck：對(duì)照；1d：高鹽處理1天；2d：高鹽處理2天；4d：高鹽處理4天；7d：高鹽處理7天；10d：高鹽處理10天。

圖2為熒光定量rt-pcr檢測(cè)mmmlo基因在干旱脅迫下桑苗嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量圖；ck：對(duì)照；1d：干旱處理1天；3d：干旱處理3天；5d：干旱處理5天；10d：干旱處理10天；15d：干旱處理15天。

圖3為熒光定量rt-pcr檢測(cè)mmmlo基因在4℃低溫脅迫下桑苗嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量圖；ck：對(duì)照；12h：干旱處理12小時(shí)；1d：干旱處理1天；3d：干旱處理3天；6d：干旱處理6天；10d：干旱處理10天；rn2d：常溫復(fù)性2天；rn5d：常溫復(fù)性5天。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因mmmlo的克隆

1.1設(shè)計(jì)引物

供試桑樹(shù)品種為保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國(guó)家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹(shù)圃的育71-1。利用已獲得的包含mmmlocdna片段的ests序列，設(shè)計(jì)引物，分段克隆，并加以驗(yàn)證，引物序列如下：

mmmlo-f1：5′-atgagtggcggagggagtg-3′；

mmmlo-r1：5′-ctcagcaacttcatgtgccaa-3′

mmmlo-f2：5′-aaatacatgatacgtgccctt-3′；

mmmlo-r2：5′-gacaaccgaaaacaatgatatg-3′

根據(jù)已克隆并驗(yàn)證的基因中間片段結(jié)果，設(shè)計(jì)5′rlm-race巢式pcr擴(kuò)增所需目的基因的下游特異性引物，引物序列如下：

gsp-outer：5′-caaaagcatcagctcctcc-3′

gsp-inner：5′-aggcttctggttcttcctc-3′

根據(jù)已獲得的基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)進(jìn)行熒光定量分析的引物，引物序列如下：

qmmmlo-f：5′-gctccaagtgagaccagttt-3′

qmmmlo-r：5′-tcgaagagtttgcggaagag-3′

根據(jù)ncbi上查找的在桑樹(shù)中穩(wěn)定表達(dá)的β-actin基因(genebank登錄號(hào)：dq785808)序列設(shè)計(jì)內(nèi)參基因的上下游引物，上游引物序列β-actin-f為5′-agcaactgggatgacatggaga-3′，下游引物序列β-actin-r為5′-cgaccactggcgtaaaggga-3′。

1.2桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因mmmlocdna片段的克隆

使用takara試劑盒提取桑樹(shù)嫩葉rna，提取步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，電泳檢測(cè)rna條帶完整；并按照takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。以合成的cdna第1鏈為模板，利用mmmlo-f1/r1和mmmlo-f2/r2為引物分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，測(cè)序分別得到858bp和1009bp的片段，與預(yù)測(cè)大小相符，blast分析并拼接獲得mmmlo基因的完整orf、完整3′-utr和不完整5′-utr。其中，pcr酶使用takara公司生產(chǎn)的extaq酶，pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，59℃退火35s，72℃延伸40s，37個(gè)循環(huán)；72℃復(fù)性5min；4℃保存。使用takara公司agarosegeldnapurificationkit試劑盒純化回收pcr產(chǎn)物，得到桑樹(shù)mmmlo基因片段，純化方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因mmmlo全長(zhǎng)的擴(kuò)增

根據(jù)所獲得的序列設(shè)計(jì)巢式pcr下游特異性引物gsp-outer和gsp-inner，利用invitrogen公司的rlm-racekit試劑盒進(jìn)行5′rlm-race巢式pcr擴(kuò)增mmmlo基因5′-utr，步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其中，gsp-outer和rlm-racekit5′raceouterprimer配對(duì)進(jìn)行外側(cè)5′rlm-racepcr，pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃復(fù)性7min；以外側(cè)pcr產(chǎn)物為模板，gsp-inner和rlm-racekit5′raceinnerprimer配對(duì)進(jìn)行內(nèi)側(cè)5′rlm-racepcr，pcr反應(yīng)程序同外側(cè)5′rlm-racepcr。

電泳檢測(cè)目的片段大小，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，將目的片段用dna連接酶與pmdtm18-t載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主菌e.colitop10菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布于在含有amp的lb固體平板上。挑取單菌落培養(yǎng)后送樣，由生工生物工程(上海)有限公司完成測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行blast分析，拼接獲得1943bp的基因全長(zhǎng)序列(genbankaccessionnumber：kx683296)，包括106bp的5′-utr，160bp的3′utr和1677bp的orf。

實(shí)施例2桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因mmmlo的生物信息學(xué)分析

利用在線(xiàn)工具psort，根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)對(duì)目的基因進(jìn)行核定位序列的預(yù)測(cè)及相關(guān)保守基因序列的分析。

利用dnastar軟件和在線(xiàn)分析軟件expasy(http：//prosite.expasy.org/prosite.htm1/)、smart(http：//smart.emb1-heidelberg.de/)對(duì)桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因mmmlo進(jìn)行較全面的分析，獲得該基因所編碼的氨基酸序列seqidn0.2，基因編碼mmmlo蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為9.03，分子質(zhì)量為62.48kda。

運(yùn)用ncbi的blast工具對(duì)mmmlo蛋白進(jìn)行同源搜索和比對(duì)，并下載部分同源氨基酸序列；利用clustalx軟件將桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因mmmlo編碼的氨基酸序列與其他物種mlo相關(guān)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)。

用mega6軟件構(gòu)建不同物種mlo蛋白進(jìn)化樹(shù)，并研究相關(guān)蛋白的關(guān)系。

實(shí)施例3桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因mmmlo在各種脅迫條件下的表達(dá)模式

在供試桑苗的新梢生長(zhǎng)至約20cm長(zhǎng)時(shí)，對(duì)桑苗分別進(jìn)行干旱、高鹽、低溫脅迫處理。在整個(gè)脅迫誘導(dǎo)處理過(guò)程中，所有試驗(yàn)用苗的溫度，光照強(qiáng)度，光周期以及濕度等非生物條件均保持不變。當(dāng)桑苗在各種脅迫處理下表現(xiàn)出明顯受害癥狀時(shí)，分別取對(duì)照和各種脅迫條件下的桑樹(shù)幼葉，用鋁箔紙包裹后迅速投入液氮中，放于-80℃的冰箱中保存。采用熒光定量pcr的方法，以桑樹(shù)穩(wěn)定表達(dá)的肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)作為內(nèi)參，測(cè)定桑樹(shù)在脅迫條件下目的基因的表達(dá)水平。所有脅迫實(shí)驗(yàn)均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

高鹽脅迫：供試桑苗用濃度為300mm的nacl溶液進(jìn)行鹽脅迫誘導(dǎo)處理。試驗(yàn)桑苗和對(duì)照桑苗放置于同一個(gè)光照培養(yǎng)箱，溫度25℃，每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗。分別于1天、2天、4天、7天和10天時(shí)取鹽脅迫條件下的桑樹(shù)幼葉(第1-3葉位)作為實(shí)驗(yàn)材料。

干旱脅迫：供試桑苗放置于溫度25℃光照培養(yǎng)箱，一直不澆水，每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗。分別于1天、3天、5天、10天和15天取桑樹(shù)幼葉(第1-3葉位)作為實(shí)驗(yàn)材料。

低溫脅迫：供試桑苗放置于溫度4℃光照培養(yǎng)箱，每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗。分別于12小時(shí)、1天、3天、6天和10天取桑樹(shù)幼葉(第1-3葉位)作為實(shí)驗(yàn)材料，后放置于溫度25℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行常溫復(fù)性，每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，復(fù)性2天和5天取桑樹(shù)幼葉(第1-3葉位)作為實(shí)驗(yàn)材料

不同非生物脅迫下桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因mmmlo相對(duì)表達(dá)量變化顯示：高鹽脅迫條件下，mmmlo基因表達(dá)量均比正常生長(zhǎng)條件下高，總體的趨勢(shì)是先急劇上升到最大值(對(duì)照的10.56倍)，然后下降，后再上升，最后到第10天下降到對(duì)照的1.58倍(圖1)。干旱脅迫條件下，mmmlo基因表達(dá)量均遠(yuǎn)高于正常生長(zhǎng)條件，總體的趨勢(shì)是先緩慢上升到最大值(對(duì)照的6.46倍)，再緩慢下降然后上升，并保持在一個(gè)較高的穩(wěn)定值(圖2)。低溫脅迫條件下，mmmlo基因表達(dá)量總體的趨勢(shì)是先稍下降，然后逐漸上升到這幾個(gè)階段的最大值(對(duì)照的7.44倍)，然后緩慢下降，經(jīng)常溫復(fù)性2天，表達(dá)量升高，繼續(xù)復(fù)性5天，表達(dá)量回落下降(圖3)。mmmlo基因在各種脅迫條件下都有明顯的波動(dòng)狀態(tài)，這表明mmmlo可能發(fā)揮其功能，在非生物脅迫條件下，誘發(fā)mmmlo基因的表達(dá)，使植物積極響應(yīng)外界脅迫。通過(guò)熒光定量pcr分析，利用mmmlo基因在干旱脅迫、高鹽脅迫和低溫脅迫條件下總體表達(dá)的升降情況、在不同的脅迫時(shí)間內(nèi)相對(duì)基因表達(dá)量指標(biāo)，以及mmmlo基因在植物中的保守性，可以以此標(biāo)識(shí)植物是否處于高鹽、低溫或干旱脅迫等生長(zhǎng)環(huán)境。

以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所

<120>桑樹(shù)白粉病相關(guān)基因及其應(yīng)用

<130>no

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1943

<212>dna

<213>mmmlo

<400>1

aaagatatgtagatgatgcaatgctccaacaaaataaaagcagaacaaaagaaagataga60

gagagtctagagagagagagagagagagagagagagagagaggaaaatgagtggcggagg120

gagtgaagaaggcgcgtcgttggagtacacgccgacatggatagtcgccgtcgtgtgctc180

cgtcatcgtcgccatctctctggccgcggagcggcttctgcactacttggggcaggttct240

gaagaggaagaaccagaagcctctctacgaggctttgcagaaagtcaaggaggagctgat300

gcttttgggttttatttctcttcttctcactgtctcccaaaacgccatctccaaaatctg360

cgttcccaagagcttgatggacaatcttctcccctgtaagctctcggaagccgaggaggc420

gaaaggtcacggcggagaatctgcgagtacttcccaccatttaggcgtcgccaccattac480

cggcgttttcaggaaacttcttgccgaagaagcgtccggcgagcagatcggttactgcgc540

tcgcaagaacaaagtgccgcttttatctgttgaagcattgcatcatctacatatctttat600

ctttgtcctagcaatcgtccatgtgaccttctgtgttctcactgttctgtttggaggggc660

tcagatacgtcaatggaagcactgggaggattccattgctaaagagaactatgattcagc720

acaagttcttaagtcaaggaaggtcaccaacgtccatcagcatgcttttatcagggatca780

ttttctgggtattggtagaaattcagccctgctgggttgggcgcattcttttatcaagca840

attttacgcatctgtgacaagatcagattatgtgacattgcgcctcggattcattacgac900

ccactgcaaaggaaatcccaagtttaattttcacaaatacatgatacgtgcccttgaaga960

tgattttaagaaagttgtcggtataagctggtatctttgggtctttgtggtcatcttctt1020

gttgctaaatgttaacggctggcacacatatttctggattgcattcattcctttcattct1080

tctacttgctgtgggcactaaactagagcacgtgattacccagttggctcatgaagttgc1140

tgagaaacacatagcaatagaaggagaacttgtagttcaaccatcagatgaacacttttg1200

gtttggtcatccccaagttgtcctcttcttgattcatttcatccttttccaaaatgcttt1260

tgagattgcattctttttctggatatgggttcaatattcatttgactcctgcataatggg1320

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cctcctgctcatagctaaagcaaagatggcagacctctggcctctcgtttgtgtggctct1740

tccgcaaactcttcgactgtgtttgtatttatataggtggtagatgcattaccttgtatg1800

gacctctaatatggtgtaatacgagtgatgagaaagtgacacgaggcaataggatccaaa1860

ggggcgtacattattaccgttgtttgtgcatagtaatcctgttgcaactttatgggaata1920

tcatatcattgttttcggttgtc1943

<210>2

<211>558

<212>蛋白質(zhì)1

<213>mmmlo蛋白

<400>1

msgggseegasleytptwivavvcsvivaislaaerllhylgqvlkrknqkplyealqkv60

keelmllgfisllltvsqnaiskicvpkslmdnllpcklseaeeakghggesastshhlg120

vatitgvfrkllaeeasgeqigycarknkvpllsvealhhlhififvlaivhvtfcvltv180

lfggaqirqwkhwedsiakenydsaqvlksrkvtnvhqhafirdhflgigrnsallgwah240

sfikqfyasvtrsdyvtlrlgfitthckgnpkfnfhkymiraleddfkkvvgiswylwvf300

vviflllnvngwhtyfwiafipfilllavgtklehvitqlahevaekhiaiegelvvqps360

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