技術領域:

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于對不同銀杏進行基因分型的snp引物及檢測方法。

背景技術：

銀杏(ginkgobilobal.)作為裸子植物銀杏綱(ginkgopsida)現(xiàn)存唯一種，典型的中生代孑遺物種，素有“活化石”之美譽。銀杏為落葉大喬木，樹干高大，雌雄異株。樹皮幼時淺綠色，老樹呈灰褐色，深縱裂，粗糙；分枝繁茂，分長短枝。種子核果狀，有臭味；中種皮骨質，白色，具2～3棱；內種皮膜質淡褐色，子葉2片；花期4～5月，9～10月種子成熟。銀杏集材用、果用、葉用、園林綠化、觀賞于一體，是一種全能的樹種。銀杏葉中含有大量的銀杏黃酮類和銀杏內酯類物質，對治療神經(jīng)病，骨髓病和腦病有獨特的效用。銀杏葉的非凡藥用價值，已經(jīng)使銀杏葉制劑形成了一個巨大的產業(yè)。

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)是指單個核苷酸的變異引起的基因組水平上dna序列的多態(tài)性，其形式包括單堿基的插入、缺失、轉換和顛換。在群體中，其等位基因頻率大于1％，但有時也把cdna中頻率小于1％的單堿基變異稱之為snp。snp標記是繼rflp和ssr之后發(fā)展起來的第三代分子標記，并廣泛應用于植物遺傳育種中，具有遺傳穩(wěn)定性高；密度高、分布廣；二態(tài)性和等位基因性；富有代表性；易于實現(xiàn)高通量、自動化檢測的特點。因此，snp被認為是應用前景最好的遺傳標記之一。

隨著測序技術的發(fā)展，測序質量的提高和成本的降低，挖掘snp位點并借此進行相關研究的例子越來越多。但該技術在植物中的應用多集中于農作物，在林木類方面的研究相對較少，且在銀杏這一物種上的研究更是未見報道。隨著時代的發(fā)展，野生資源的保護至關重要，對于孑遺樹種古銀杏保護不容忽視。因此，現(xiàn)急需一種快速、方便、可靠的銀杏古樹名木資源分子鑒定技術。利用dna分子標記方法繪制dna指紋圖譜，能從本質上反映生物個體間的差異。常規(guī)的dna指紋圖譜是采用第二代分子標記簡單序列重復(ssr)進行的，但是第三代分子標記snp，無須基于凝膠電泳進行指紋圖譜的檢測，減少誤差，省時，且高通量，準確性高。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于對不同銀杏進行基因分型的snp引物，為84株古樹名木建立指紋圖譜。本發(fā)明的另一目的是提供上述snp引物的應用。

技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

一種用于對不同古銀杏進行基因分型的snp引物，由22對引物組成，各引物的核苷酸序列如下表所示：

應用所述的snp引物構建銀杏古樹名木的指紋圖譜，獲得84個銀杏古樹名木對應的指紋圖譜，如下表所示：

所述的應用snp引物構建銀杏古樹名木的指紋圖譜，所使用的引物為11，名稱分別：snp1，snp4，snp6，snp8，snp10，snp14，snp16，snp17，snp19，snp20，snp22。

所述snp引物在不同古銀杏基因組dna的snp位點基因分型檢測中的應用。

所述的應用，包括以下步驟：

1)待測銀杏樣品dna的提??；

2)使用相同反應體系及程序對銀杏樣本基因組dna進行pcr擴增，得到待測銀杏的pcr產物；

3)對pcr擴增產物進行高分辨率溶解曲線分析確定snp位點的基因型；

4)sanger測序再次驗證snp基因型。

步驟2)中，pcr反應體系10μl：25ng模板dna；1xforget-me-not^tmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o補齊。

步驟2)中，pcr反應程序：預變性95℃2min；95℃變性5s，45個循環(huán)；60℃復性30s。

步驟3)中，hrm的反應程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

本發(fā)明通過實驗證明：本發(fā)明的引物共22對，其中11對snp引物組合可以用于構建銀杏古樹名木的指紋圖譜。本發(fā)明利用銀杏轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的snp引物能夠對銀杏進行基因分型，并且本發(fā)明操作方法簡單，通量高，成本低。此外，本發(fā)明開發(fā)的11對snp引物構建了不同銀杏古樹名木的指紋圖譜，驗證的22個snp位點還可以用來分子標記輔助育種，遺傳多樣性研究，基于snp的關聯(lián)分析，以及用于種質資源鑒定與分類等。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下的技術優(yōu)勢：

1)結果高度準確、可靠：利用本發(fā)明進行檢測與鑒定，檢測結果100％準確，檢測結果提供了高度的可靠性，為銀杏古樹名木提供指紋圖譜，對野生資源的保護意義重大。

2)操作快速簡便：進行不同個體間的樣本檢測，一般整個試驗過程只需幾小時即可完成，與傳統(tǒng)的測序技術相比，省時省力，可以實現(xiàn)高通量。

3)無需基于凝膠電泳進行，減少試劑和耗材的使用，更佳環(huán)保，同時節(jié)省人力和減少人工誤差。

4)檢測結果靈敏度高：對待檢測樣品僅需提供模板dna25ng即可準確進行鑒定。

附圖說明

圖1是從銀杏轉錄組測序數(shù)據(jù)中鑒定出的snp及其變異類型和數(shù)目結果圖；

圖2是以引物snp18為例，在不同古銀杏個體表現(xiàn)出的擴增曲線圖；

圖3是以引物snp18為例，利用高分辨率溶解曲線分析后，不同古銀杏個體表現(xiàn)出不同的溶解曲線峰圖；

圖4是以引物snp18為例，根據(jù)不同古銀杏個體表現(xiàn)出的差異溶解曲線峰，對其進行基因分型結果的溶解曲線，紅色為cc，藍色為ct，綠色為tt。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

實施例1

1、初步篩選對銀杏進行基因分型的snp引物

1)轉錄組數(shù)據(jù)的獲得

根據(jù)制造商的說明書使用rneasyplantminikit(qiagen，hilde，germany)進行銀杏總rna提取。提取后，在1.0％的瓊脂糖凝膠上檢測rna的降解和污染。使用分光光度計(implen，westlakevillage，ca，usa)檢查rna純度。使用2.0flurometer(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)中的rnaassaykit測定rna的濃度。使用anagilentbioanalyzer2100system(agilenttechnologies,santaclara,ca,usa)中的rnanano6000assaykit評估rna的完整性。

每個樣品的總量為3μgrna用作rna樣品制備的輸入材料。按照制造商的說明書，使用ultratmrnalibraryprepkit(neb，usa)生成測序文庫，并將索引代碼添加到每個樣品的屬性序列中。簡而言之，使用poly-toligo附著磁珠從總rna純化mrna。在nebnextfirststrandsynthesisreactionbuffer(5×)中，在高溫下使用二價陽離子打斷成短片段。以mrna為模板，使用六堿基隨機引物和m-mulv逆轉錄酶(rnaseh-)合成第一鏈cdna。隨后使用dna聚合酶i和rna酶h進行第二鏈cdna合成。通過外切核酸酶/聚合酶活性將剩余突出部分轉化為平端。在dna片段的3'末端腺苷酸化后，連接具有發(fā)夾環(huán)結構的nebnext適配子以進行雜交。為了選擇長度優(yōu)先為150-200bp的cdna片段，文庫片段用ampurexp系統(tǒng)(beckmancoulter，beverly，usa)純化。然后將3μluserenzyme(neb，usa)與大小選擇的接頭連接的cdna在37℃下使用15min，然后在95℃下pcr5min。進而使用phusion高保真dna聚合酶，通用pcr引物和index(x)引物進行pcr。最后，將pcr產物純化(ampurexp系統(tǒng))，并在agilentbioanalyzer2100系統(tǒng)上評估文庫質量。根據(jù)制造商的說明書，使用truseqpeclusterkitv3-cbot-hs(illumia)在cbot群集生成系統(tǒng)上進行索引編碼樣本的聚類。集群生成后，在illuminahiseqtm2500高通量平臺上對其準備進行測序，并生成配對末端讀取。

fastq格式的原始數(shù)據(jù)(rawreads)首先通過內部perl腳本進行處理。在此步驟中，通過刪除包含適配器的讀取，包含poly-n的讀取以及從原始數(shù)據(jù)讀取的低質量來獲取干凈的數(shù)據(jù)(cleanreads)。同時，計算了cleandata的q20，q30，gc含量和序列重復水平。所有的下游分析都是以高質量的cleandata為基礎。然后，將所有庫/樣本中的左文件(read1files)合并到一個大的left.fq文件中，將正確的文件(read2files)合并到一個大的right.fq文件中。基于left.fq和right.fq使用trinity(grabherretal.，2011)完成轉錄組組裝，默認情況下min_kmer_cov設置為2，其他所有參數(shù)設置為默認值。選擇具有最長長度的每個基因的轉錄本作為unigenes。

2)snp的識別

本實施例通過使用picard-toolsv1.41和samtoolsv0.1.18來排序，刪除重復讀取，對齊合并獲得每個樣本的bam結果。采用gatk2v3.2軟件用于執(zhí)行snpcalling(mckennaetal，2010)。原始的vcf文件使用gatk標準方法過濾(參數(shù)為clusterwindowsize:10；mq0>＝4and(mq0/(1.0*dp))>0.1；qual<10；qual<30.0orqd<5.0orhrun>5)，最后僅保留距離大于5的snp。通過該方法鑒定出65535個snp，snp變異的形式有多種，但類型主要有轉換和顛換，轉換是顛換的2倍左右，如圖1所示。

3)snp引物的設計

根據(jù)轉錄組unigenes序列，挑選60個snp位點，利用oligo6.0軟件設計60對snp引物。設計的方法如下：首先確定snp位點所在序列的位置，然后在snp位點的上下游分別設計正向引物和反向引物，引物設計的參數(shù)為引物長度18-23bp；tm60℃左右，盡可能保證上下游引物的tm值一致，一般不超過2℃；gc含量在40-60％(45-55％最佳)；pcr產物大小為100-300bp；其它還應注意引物3'端不應出現(xiàn)超過3個的連續(xù)g或c；引物不能形成發(fā)夾結構，即不能有4bp以上的回文序列；引物自身、引物之間盡量不能有連續(xù)4個以上的堿基互補，尤其避免3'端的互補。

4)snp引物的有效性驗證

提取銀杏基因組dna，以銀杏基因組dna為模板，采用待檢測snp引物進行pcr擴增，獲得pcr擴增產物；反應結束后，取3μl的pcr產物加入4μlloadingbuffer，再加3μlddh2o，利用8％聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后采用銀染方法對pcr擴增產物進行檢測。能檢測到目的條帶且無其它雜帶和引物二聚體的，該待檢測引物即為有效引物。

10μl的pcr反應體系中包括：10×buffer；0.2mmol/ldntps；2.5mmol/lmg²⁺；0.2μmol/lsnp引物；1utaqdna聚合酶和40ngdna模版；剩余ddh2o補齊。

pcr的反應程序為：預變性94℃5min；30循環(huán)的94℃30s，最佳tm55℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最終4℃保存。

結果表明：挑選的60對snp引物中，有45對引物能夠擴增出條帶，說明引物設計的方法較好，但其中的18對引物擴增出的條帶不單一，可能存在多個snp位點，暫不考慮進行hrm分析，另外27對引物擴增條帶單一且產物大小與預期一致，暫為有效snp引物，用于hrm分析。1對引物對應1個目標snp位點，1對引物的擴增產物為含有對應snp位點的dna片段。

2、再次篩選對銀杏進行基因分型的snp引物

1)pcr擴增及高分辨率溶解曲線(hrm)分析進行基因分型

以90個銀杏個體(其中6個銀杏個體為轉錄組測序的銀杏；84棵銀杏古樹名木，分別來自3個群體，貴州盤縣28株，浙江天目山28株和湖北安陸28株)的基因組dna為模板，分別采用上述27對snp有效性引物進行pcr擴增，得到每個個體的27個引物對應的pcr擴增產物，每個引物對的pcr擴增產物為含有某個snp位點的dna片段。

pcr反應體系10μl：25ng模板dna；1×forget-me-not^tmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o補齊。采用viia7中的highresolutionmelt進行pcr及基因分型。第一步，10μl的pcr反應程序：預變性95℃2min；45個循環(huán)的95℃變性5s，60℃復性30s；第二步，hrm的反應程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

結果表明：有22對引物能夠進行基因分型，其余5對引物(snp23，snp24，snp25，snp26，snp27)因有雜峰或基因分型時可信度不高，所以被淘汰。采用appliedhrmsoftwarev2.0進行溶解曲線分析。22對引物對應的snp位點得到hrm驗證，其中，高分辨率溶解曲線部分結果如下：

圖2為以snp18為例，在不同銀杏個體表現(xiàn)出的擴增曲線；圖3為以snp18為例，利用高分辨率溶解曲線分析后，不同銀杏個體表現(xiàn)出不同的溶解曲線峰；圖4為以snp18為例，根據(jù)不同銀杏個體表現(xiàn)出的差異溶解曲線峰，對其進行基因分型結果的溶解曲線，紅色為cc，藍色為ct，綠色為tt。22對snp引物對90個銀杏個體的基因分型結果如下表所示：

其中，11對snp引物組合(snp1，snp4，snp6，snp8，snp10，snp14，snp16，snp17，snp19，snp20，snp22)構建銀杏古樹名木指紋代碼，獲得84個銀杏古樹名木對應的指紋圖譜，序號1-28為貴州盤縣這個群體的28株古銀杏，序號29-56為浙江天目山這個群體的28株古銀杏，序號57-84為湖北安陸這個群體的28株古銀杏，如下表所示:

2)高分辨率溶解曲線分析結果的驗證

通過對pcr產物測序對高分辨率溶解曲線分析得到的基因分型的結果進行驗證。具體步驟如下：挑選snp的不同分型的pcr產物10μl，進行sanger測序，根據(jù)測序峰圖和等位基因出現(xiàn)的頻率確定基因型，并與hrm技術的snp基因分型結果進行比較，以驗證引物基因分型的準確性。

經(jīng)過sanger測序驗證本發(fā)明的引物通過hmr分析對銀杏進行基因分型的結果100％正確，結果可靠。