本發(fā)明涉及納米材料生物安全性檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種原初態(tài)納米材料致哺乳動(dòng)物癌變的方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，癌癥的發(fā)生發(fā)展是由多基因、多因素、多階段共同長期相互作用的結(jié)果。機(jī)體自身遺傳因素(geneticfactors,基因突變及遺傳變異)和環(huán)境污染物(environmentalpollutants)為導(dǎo)致癌癥發(fā)生發(fā)展的兩大類重要因素。環(huán)境污染物一方面可能會(huì)導(dǎo)致基因突變而致癌，另一方面因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)生基因突變的機(jī)體對環(huán)境污染物的刺激更加敏感，而易發(fā)生癌癥。同時(shí)，有報(bào)道表明，環(huán)境污染物的持續(xù)作用還能增強(qiáng)多種腫瘤的發(fā)展。納米材料作為人類廣泛接觸的一種新型環(huán)境污染物，已被證實(shí)可致dna損傷和基因突變，但其致/促癌性目前尚無定論。為何納米材料可致突卻未見致癌？我們認(rèn)為不一定是納米材料沒有致癌性(納米二氧化鈦已被列為疑似致癌物)，而可能是由于目前研究思路和研究手段受限。我們推測其中一個(gè)重要的原因可能在于：受試模型的選擇還不是十分適合。我們需要更多的考慮“機(jī)體自身遺傳因素”的影響，選擇自身已具有某個(gè)/些基因突變的受試細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。事實(shí)上，我們現(xiàn)實(shí)生活中也有很多人很多動(dòng)物自身就具有遺傳不穩(wěn)定性。據(jù)報(bào)道，人類在進(jìn)化歷程中，突變可自然發(fā)生。保守的估計(jì)，自人類與黑猩猩區(qū)分的那一刻起，人類每代每個(gè)二倍體基因組平均發(fā)生4.2個(gè)氨基酸的突變。雖然這些突變至少有38％為自然選擇所去除，但每代二倍體細(xì)胞中每個(gè)基因組仍可保留1.6個(gè)新突變。這些已經(jīng)存在的突變可能會(huì)導(dǎo)致個(gè)體更容易受環(huán)境污染物(比如納米材料)的誘導(dǎo)而發(fā)生癌癥。納米材料致哺乳動(dòng)物細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的有效暴露方法請參考我們之前申請的專利(申請?zhí)枺?01611078908.x)。本發(fā)明旨在上述體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(invitro)的基礎(chǔ)上，將經(jīng)過“原初態(tài)”納米材料(指生產(chǎn)出來后尚未釋放入環(huán)境中的原始狀態(tài)的納米材料)長期的、慢性的、低劑量的處理后發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(該細(xì)胞系自身存在酪氨酸磷酸酶shp-2基因的點(diǎn)突變，具有遺傳不穩(wěn)定性)注射入小鼠皮下，一定時(shí)間之后我們既能直接肉眼觀察“原初態(tài)”納米材料是否誘發(fā)腫瘤，又能通過病理切片、顯微觀察等技術(shù)手段鑒定該腫瘤是否會(huì)發(fā)生遷移轉(zhuǎn)化。該發(fā)明既能為納米材料的致癌性研究提供體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(invivo)數(shù)據(jù)，又能為納米材料安全性評估和腫瘤的高發(fā)提供新的線索，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

現(xiàn)有納米材料致癌性的研究結(jié)果基本都是陰性的，其中一個(gè)重要原因在于納米材料本身存在各種有別于常規(guī)材料的特性，目前的大量研究都是針對納米材料的短時(shí)間較高劑量急性暴露的遺傳效應(yīng)，而缺乏適用于納米材料的慢性低劑量長期暴露的穩(wěn)定方法?？傮w來說，當(dāng)前針對納米材料的安全性評估并不完善。已有的大量研究采用各類細(xì)菌(bacteria)為受試對象，但由于很大一部分納米材料(如納米銀、納米氧化鋅和納米氧化鈦等)均具有抗菌特性，再加上細(xì)菌本身缺乏將納米材料吞噬入體的能力，所以以細(xì)菌為受試對象的研究結(jié)果大多都是陰性的結(jié)果，即使有少部分研究暗示納米材料具有一定的遺傳毒性和致突能力，這部分研究也不能準(zhǔn)確反映納米材料的真實(shí)毒性，原因就在于細(xì)菌并不適用于納米材料的毒性研究。哺乳動(dòng)物細(xì)胞(mammaliancell)是來自哺乳動(dòng)物體的細(xì)胞，目前已建成許多來自鼠、猴和人等重要的細(xì)胞系，這些離體細(xì)胞的培養(yǎng)由于可用來大量生產(chǎn)疫苗、重組蛋白和其他醫(yī)療產(chǎn)品而倍受重視，也被廣泛用于各種毒理學(xué)研究。生物醫(yī)學(xué)中經(jīng)常用到哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等離體實(shí)驗(yàn)，例如，觀察某種新型藥物對腫瘤的影響，就不能直接作用于人體，而是要先在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞上，只有動(dòng)物模型通過了，才能到臨床試驗(yàn)階段！針對納米材料的毒理學(xué)和致癌性研究也應(yīng)先以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為受試對象進(jìn)行invitro水平的實(shí)驗(yàn)研究，在invitro研究結(jié)果的基礎(chǔ)上再開展動(dòng)物個(gè)體水平的invivo研究。目前采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞為受試對象的納米毒理學(xué)研究也已大量開展，但在動(dòng)物個(gè)體水平的研究還較匱乏，少量已有的研究結(jié)果也基本都是陰性的。綜上所述，以哺乳動(dòng)物為受試對象，建立和發(fā)展一種針對納米材料進(jìn)行個(gè)體水平(如小鼠)的致癌性研究的有效方法顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種原初態(tài)納米材料致哺乳動(dòng)物癌變的方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中納米材料致癌性研究的不足，以及對受試對象選擇的不合理，本發(fā)明選用了哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為受試對象，經(jīng)過長時(shí)間的、低劑量的慢性暴露并將惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)，檢測原初態(tài)納米材料對哺乳動(dòng)物癌變的影響，為納米材料安全性評估和腫瘤的高發(fā)提供新的線索，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義；本發(fā)明公開的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明公開了一種原初態(tài)納米材料致哺乳動(dòng)物癌變的方法，包括以下實(shí)驗(yàn)步驟：

步驟一、原初態(tài)納米材料母液的配置：將納米氧化鋅粉末直接分散于超純水中，配置成濃度為1mg/ml的儲(chǔ)備液，經(jīng)高溫、高壓滅菌后，室溫密閉、避光保存，備用；

步驟二、原初態(tài)納米材料致哺乳動(dòng)物細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，操作如下：

a.將正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(shp-2^+/+mef)和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(shp-2^d61g/+mef)用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

b.分別取一皿處于對數(shù)期的、滿度為80％的shp-2^+/+mef細(xì)胞和shp-2^d61g/+mef細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后分別種植于60mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，棄去原培養(yǎng)液；再向每個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入稀釋后的儲(chǔ)備液與含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基混合液，培養(yǎng)24小時(shí)后，去除混合液，每皿細(xì)胞用1.5ml磷酸鹽緩沖液漂洗3遍，漂洗后，每個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞中再加入4ml含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)3天；待長滿后，用胰蛋白酶酶解消化后開始第二輪納米材料的慢性處理；循環(huán)操作，連續(xù)暴露60代(即6個(gè)月)完成慢性暴露的過程；

步驟三、用原初態(tài)納米材料誘發(fā)裸鼠成瘤：購買4周齡的雌balb/c裸鼠，spf級環(huán)境中飼養(yǎng)一周后，提取步驟二中正處于對數(shù)生長期的、經(jīng)過原初態(tài)納米氧化鋅慢性刺激達(dá)6個(gè)月的并發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞組成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液在無菌培養(yǎng)室內(nèi)接種至裸鼠皮下，誘發(fā)成腫瘤；

步驟四、對小鼠進(jìn)行病理研究：待步驟三中的裸鼠有肉眼可見的瘤體后，每隔1天對所述瘤體的體積進(jìn)行測量；待瘤體長大后，取出稱重，提取裸鼠肝、脾、肺等器官細(xì)胞，用電子顯微儀器進(jìn)行細(xì)胞檢測，檢測腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。

進(jìn)一步的，為了更加有利于細(xì)胞的培養(yǎng)，步驟二的操作a中培養(yǎng)箱為二氧化碳培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)環(huán)境為恒溫37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)含5％體積濃度的二氧化碳、恒定的酸堿度(ph值：7.2-7.4)和較高的相對飽和濕度(95％)。

進(jìn)一步的，為了提供低劑量的(一般為亞細(xì)胞毒性的較低劑量)的毒性環(huán)境，步驟二的操作b中稀釋后的儲(chǔ)備液濃度為1.5μg/ml。

進(jìn)一步的，考慮到現(xiàn)實(shí)生活中應(yīng)用較多的納米材料的粒徑大小，步驟一中納米氧化鋅的粒徑為20nm。

進(jìn)一步的，步驟二的操作b中正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(shp-2^+/+mef)和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(shp-2^d61g/+mef)，經(jīng)胰蛋白酶消化后分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，種植的細(xì)胞數(shù)量均為1*10⁵個(gè)。

進(jìn)一步的，為了檢測連續(xù)慢性暴露細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，以及進(jìn)一步反映納米材料的致癌性，步驟二的操作b中連續(xù)暴露60代(即6個(gè)月)完成慢性暴露的過程中，期間每隔5代凍存部分細(xì)胞。

進(jìn)一步的，步驟三中細(xì)胞懸液中正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞濃度均為1*10⁷/100μl。

進(jìn)一步的，步驟三中細(xì)胞懸液在無菌培養(yǎng)室內(nèi)接種至裸鼠的腋下。

進(jìn)一步的，為了更好的研究腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長情況，以進(jìn)行更好的研究，步驟四中在對瘤體的體積進(jìn)行測量時(shí)，用游標(biāo)卡尺分別測量腫瘤垂直方向上的最長直徑a和最短直徑b，腫瘤體積v＝0.5*a*b²，并將測量數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了“原初態(tài)”納米材料在小鼠個(gè)體水平進(jìn)行致癌性研究的有效方法。利用酪氨酸磷酸酶突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞所具備的自身遺傳不穩(wěn)定性，加之納米材料長期的、低劑量的、慢性暴露之后所獲得的60代穩(wěn)定細(xì)胞系，可避免因急性短時(shí)間暴露不適用于研究致癌性這一缺點(diǎn)，獲得發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。然后利用這種已經(jīng)發(fā)生的惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞注射入小鼠(腋下)皮下，利用存在免疫缺陷的裸鼠模型進(jìn)行“原初態(tài)”納米材料的致癌性研究，可為納米材料的致癌性研究提供新的方法和思路。本發(fā)明提供的方法簡單，易于操作，成本低，結(jié)果可靠，可為納米材料安全性評估提供新的線索和依據(jù)，為納米材料致癌性研究提供新的思路和方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明原初態(tài)納米氧化鋅導(dǎo)致含shp-2基因突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力提高的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

實(shí)施例1公開了一種原初態(tài)納米材料致哺乳動(dòng)物癌變的方法，包括以下實(shí)驗(yàn)步驟：

步驟一、原初態(tài)納米材料母液的配置：將粒徑為20nm的納米氧化鋅分散于超純水中，配置成濃度為1mg/ml的儲(chǔ)備液，經(jīng)高溫、高壓滅菌后，室溫避光保存、備用；

步驟二、原初態(tài)納米材料致哺乳動(dòng)物細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，操作如下：

a.將正常的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(shp-2^+/+mef)和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(shp-2^d61g/+mef)用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)箱的培養(yǎng)環(huán)境為恒溫37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)含5％體積濃度的二氧化碳、恒定的酸堿度(ph值：7.2-7.4)和相對飽和濕度為95％；

b.分別取一皿處于對數(shù)期的、滿度為80％的shp-2^+/+mef細(xì)胞和shp-2^d61g/+mef細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，分別種植1*10⁵的細(xì)胞于60mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，棄去原培養(yǎng)液；再向每個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入稀釋后濃度為1.5μg/ml的上述儲(chǔ)備液與含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基混合液，培養(yǎng)24小時(shí)后，去除混合液，每皿細(xì)胞用1.5ml磷酸鹽緩沖液漂洗3遍，漂洗后，每個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞中再加入4ml含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)3天；待長滿后，用胰蛋白酶酶解消化后開始第二輪納米材料的慢性處理；循環(huán)操作，連續(xù)暴露60代完成慢性暴露的過程；如圖1所示，用“原初態(tài)”納米氧化鋅刺激的shp-2^+/+mef和shp-2^d61g/+mef分別在軟瓊脂上培養(yǎng)，結(jié)果說明，該“原初態(tài)”氧化鋅納米材料致哺乳動(dòng)物細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的暴露方法確實(shí)有效，為了檢測連續(xù)慢性暴露細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，以及反映納米材料的致癌性，步驟二的操作b中連續(xù)暴露60代(即6個(gè)月)完成慢性暴露的過程中，期間每隔5代凍存部分細(xì)胞；

步驟三、用原初態(tài)納米材料誘發(fā)裸鼠成瘤：購買4周齡的雌balb/c裸鼠，spf級環(huán)境中飼養(yǎng)一周后，提取步驟二中正處于對數(shù)生長期的、經(jīng)過原初態(tài)納米氧化鋅慢性刺激達(dá)6個(gè)月的并發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞組成細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液中正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞濃度均為1*10⁷/100μl；將細(xì)胞懸液在無菌培養(yǎng)室內(nèi)接種至裸鼠皮下，誘發(fā)成腫瘤；

步驟四、對小鼠進(jìn)行病理研究：待步驟三中的裸鼠有肉眼可見的瘤體后，每隔1天對所述瘤體的體積進(jìn)行測量；在對瘤體的體積進(jìn)行測量時(shí)，用游標(biāo)卡尺分別測量腫瘤垂直方向上的最長直徑a和最短直徑b，腫瘤體積v＝0.5*a*b²，并將測量數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄；待瘤體長大后，取出稱重，提取裸鼠肝、脾、肺等器官細(xì)胞，用電子顯微儀器進(jìn)行細(xì)胞檢測，檢測腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例2

實(shí)施例2公開了一種原初態(tài)納米材料致哺乳動(dòng)物癌變的方法，包括以下實(shí)驗(yàn)步驟：

①“原初態(tài)”納米材料母液的配置方法，其步驟是：將購自美國nanoamor公司的納米氧化鋅(粒徑20nm)，用超純水懸浮，配置成1mg/ml的儲(chǔ)備液，經(jīng)高溫高壓滅菌后，在室溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

②“原初態(tài)”納米材料致哺乳動(dòng)物細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的有效暴露方法，其步驟是：正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(shp-2^+/+mef)和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(shp-2^d61g/+mef)(來源于美國casewesternreserveuniversity的quck實(shí)驗(yàn)室)用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基在37℃，含5％co2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(詳見《細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)-基本技術(shù)指南(第四版)》)。分別取一皿處于對數(shù)期的滿度約80％的shp-2^+/+mef細(xì)胞和shp-2^d61g/+mef細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，種植1×10⁵的細(xì)胞于50mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，棄去原培養(yǎng)液，加入含有1.5μg/ml(一般為亞細(xì)胞毒性的較低劑量)上述“原初態(tài)”(fresh)納米材料懸濁液的新鮮培養(yǎng)液(納米材料+含10％胎牛血清的dmem)，培養(yǎng)24小時(shí)后，去除條件培養(yǎng)基，每皿細(xì)胞用1.5ml磷酸鹽緩沖液(pbs)漂洗細(xì)胞5遍。漂洗后，每皿細(xì)胞加入4ml新鮮的不含納米材料的培養(yǎng)液(含10％胎牛血清的dmem)連續(xù)培養(yǎng)3天，待長滿后，用胰蛋白酶酶解消化后開始第二輪納米材料的低劑量慢性處理(納米材料濃度同上)。如此循環(huán)，連續(xù)暴露60代完成慢性暴露的過程，期間可每隔5代凍存部分細(xì)胞，以用于檢測這些細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為(可在一定程度上有效反映納米材料的致癌性)。結(jié)果說明，該“原初態(tài)”氧化鋅納米材料致哺乳動(dòng)物細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的暴露方法確實(shí)有效。

③“原初態(tài)”納米材料誘發(fā)裸鼠成瘤的研究方法，其具體步驟是：

購買4周齡的雌balb/c裸鼠(裸鼠被越來越多的應(yīng)用在腫瘤的研究領(lǐng)域，裸鼠的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了在活體動(dòng)物的條件下觀察腫瘤生長情況的可能)，spf級環(huán)境中飼養(yǎng)一周后，取正處于對數(shù)生長期的已經(jīng)經(jīng)過“原初態(tài)”氧化鋅納米材料慢性刺激達(dá)6個(gè)月之久的、并已被證實(shí)發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化的野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)、突變型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(d⁺)(接種量為2x10⁷/100μl)懸液在無菌培養(yǎng)室內(nèi)接種至裸鼠腋下。注射后每隔3天觀察腫瘤生長狀況，并稱重。待觀察到有肉眼可見的瘤體后，每隔1天測量瘤體體積v(mm3)＝0.5×a×b²(用游標(biāo)卡尺測量腫瘤兩個(gè)垂直方向的直徑，最長徑a(mm)和最短經(jīng)b(mm))，分別記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。代瘤體長大合適大小后，取出瘤體，稱量瘤體的重量，同時(shí)提取肝、肺、脾等器官細(xì)胞進(jìn)行電子顯微檢測。