本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及一種利用制備超高純度乳酸鏈球菌素的方法，尤其是可以利用此方法制備藥品級高純度乳酸鏈球菌素。
背景技術(shù)：
乳酸鏈球菌素(英文名稱nisin)亦稱乳酸鏈球菌肽，是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)，由34個氨基酸殘基組成，分子量約為3500da。由于nisin可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細菌，如肉毒梭菌、金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、利斯特氏菌，并對芽孢桿菌的芽孢有強烈的抑制作用，因此被作為食品防腐劑廣泛應用于食品行業(yè)。通常，產(chǎn)芽孢的細菌耐熱性很強，如鮮乳采用135℃、2秒超高溫瞬時滅菌，非芽孢細菌的死亡率為100％，芽孢細菌的死亡率90％，還有10％的芽孢細菌不能殺滅。若鮮乳中添加0.03-0.05g/kgnisin就可抑制芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌孢子的發(fā)芽和繁殖。根據(jù)研究結(jié)果表明，乳酸鏈球菌素的抗菌作用是通過干擾細胞v膜的正常功能，造成細胞膜的滲透，養(yǎng)分流失和膜電位下降，從而導致致病菌和腐敗菌細胞的死亡。
nisin作為新型的高效、無毒、安全的天然食品防腐劑，進入人體后被機體蛋白酶消化分解為氨基酸，被機體吸收利用，并且不影響腸道內(nèi)正常菌群的生命活動，是當今食品行業(yè)中保鮮防腐，延長貨架期的絕對良品。除此之外，nisin在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域也有很大的應用前景，高純度的nisin對治療牙周炎、乳腺炎和皮膚感染有很好的療效。也有研究表明nisin對口腔癌、頭頸部等癌細胞起到抑制作用。還有研究揭示了nisin對耐藥性革蘭氏陽性細菌(如mrsa)感染具有有效的治療作用。然而，目前市售的nisin純度較低(僅為2.5％～10％)，且含有較多的雜蛋白，進入機體后可能會引起某些不良反應，影響了其在醫(yī)療領(lǐng)域的應用和推廣。因此，如何獲取高純度的nisin是研究者關(guān)注的重點和熱點。
目前，工業(yè)上nisin主要是采用發(fā)酵法生產(chǎn)，然后從發(fā)酵液中提取nisin，提取方法主要有吸附法、鹽析法、膜過濾法、有機溶劑法、泡沫分離法和雙水相萃取法等。吸附法是在發(fā)酵液中加入固體吸附劑如大孔樹脂或者利用菌體細胞自身吸附乳酸鏈球菌素，解吸后將解吸液鹽析或噴霧干燥，制成粉末狀食品級nisin產(chǎn)品；膜過濾法首先用無機膜或管式膜從發(fā)酵液中除去菌體和固體等相對分子質(zhì)量比乳酸鏈球菌素大的物質(zhì)，再采用卷式膜超濾從發(fā)酵液中除去相對分子質(zhì)量比乳酸鏈球菌素小的物質(zhì)，得到發(fā)酵液濃縮物，最后加入固體食鹽，經(jīng)噴霧干燥制得食品級nisin，產(chǎn)品中食鹽含量為10％～50％；有機溶劑法主要采用正丙醇和丙酮，將一定量正丙醇加入nacl飽和的預處理后發(fā)酵液中，離心，上清液加入丙酮沉淀，冷凍干燥即得nisin粉末。
瓊脂糖凝膠是由β-d-半乳糖和3,6-脫水-l-半乳糖交替結(jié)合所形成的線性多聚糖。瓊脂糖凝膠層析，是使待分離物質(zhì)通過瓊脂糖凝膠層析柱，各個組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動。分子量大于允許進入凝膠網(wǎng)孔范圍的物質(zhì)完全被凝膠排阻，不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動，因此流程短，而先流出層析柱；分子量小的物質(zhì)可完全進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，阻滯作用大，流程延長，而最后從層析柱中流出。若被分離物的分子量介于完全排阻和完全進入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達到分離目的?；旌衔锏姆蛛x程度主要決定于凝膠顆粒內(nèi)部微孔的孔徑和混合物相對分子質(zhì)量的分布范圍。和凝膠孔徑有直接關(guān)系的是凝膠的交聯(lián)度。凝膠孔徑?jīng)Q定了被排阻物質(zhì)相對分子質(zhì)量的下限。移動緩慢的小分子物質(zhì)，在低交聯(lián)度的凝膠上不易分離，大分子物質(zhì)同小分子物質(zhì)的分離宜用高交聯(lián)度的凝膠。
目前應用最廣、分辨率最高的多肽分離純化方法是反相高效液相色譜法，常作為天然活性多肽或人工合成多肽的最終純化步驟，但反相色譜介質(zhì)對極性較強的多肽分子選擇性差，難以形成足夠的吸附保留，而且樣品載量有限，填料成本高，重復利用率低，限制了生產(chǎn)規(guī)模。
親水相互作用色譜能夠為多肽分離純化提供一種與反相色譜不同的選擇性，對極性較強的多肽分子能夠形成較強的吸附保留，而揮發(fā)性流動相便于從多肽產(chǎn)品中去除，也有利于與質(zhì)譜等檢測分析手段的兼容。親水相互作用色譜的介質(zhì)親水性較強，因此不易造成生物活性分子的變性，生物相容性好。但目前絕大多數(shù)親水相互作用色譜介質(zhì)以硅膠為基本框架結(jié)構(gòu)，對流動相和樣品的ph值范圍有限定，有些不能在偏堿或偏酸的環(huán)境下使用，有些不能分離堿性或酸性化合物。
瓊脂糖凝膠中性親水，非特異性吸附低，成膠性能好，容易形成具有開放纖維結(jié)構(gòu)的多孔球狀顆粒，表面豐富的輕基便于交聯(lián)和配基衍生，交聯(lián)后剛性增強，易于規(guī)模放大，且化學穩(wěn)定性提高，可采用強酸強堿進行原位清洗與再生。以往在中藥多酚類化合物分離純化的研究中發(fā)現(xiàn)，某些瓊脂糖凝膠介質(zhì)在親水相互作用色譜的流動相條件下，對極性小分子化合物能夠產(chǎn)生以氫鍵吸附為主的親水吸附，因此有望拓展其應用領(lǐng)域，使其成為親水相互作用色譜介質(zhì)，用于極性小分子肽類化合物的分離純化。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是為了解決目前生產(chǎn)上利用常規(guī)提取方法制備nisin純度不高，無法為制備醫(yī)藥級超高純度nisin提供有效純化工藝技術(shù)而提出的。
本發(fā)明的一種利用瓊脂糖凝膠親和層析色譜提取醫(yī)藥級超高純度乳酸鏈球菌素的方法，它是按照以下步驟進行：
以生物效價≥15000iu/mg的乳酸鏈球菌素粗制半成品為原料，再經(jīng)過瓊脂糖凝膠親和色譜層析柱進行乳酸鏈球菌素純化，最后經(jīng)過冷凍干燥制成超高純度乳酸鏈球菌素純品；
其中，生物效價≥15000iu/mg的乳酸鏈球菌素粗制半成品的制備方法如下：
一、利用陶瓷膜對乳酸鏈球菌素最終發(fā)酵活力≥8500iu/ml的發(fā)酵液進行固液分離，分離得到清液進行下一步處理；其中，分離前發(fā)酵液的ph預先調(diào)至2.5，并在70℃下恒速攪拌30min；
二、利用孔徑不同的兩級膜對上步驟得到的清液進行第一級和第二級的分離和濃縮，第一級分離后濃縮倍數(shù)為4～8倍，第二級分離后濃縮倍數(shù)為8～14倍，得到的濃縮液進行下一步處理；所述的兩級膜為卷式超濾膜，其中，第一級膜孔徑為10000～100000；第二級膜孔徑為1000～10000；
三、利用竹制或椰殼制顆粒狀活性炭對上述一次濃縮液進行脫色處理，得到脫色后濃縮液；
四、利用泡沫分離法對步驟三得到的脫色后濃縮液進行乳酸鏈球菌素的二次濃縮分離，在泡沫分離過程中以2～6個碳原子數(shù)的食品級分析純正烷醇對泡沫進行消泡處理，得到的消泡濃縮液加入0.5～1.5倍體積的相同的正烷醇，在轉(zhuǎn)速為10～50轉(zhuǎn)/min的條件下攪拌30～60min，靜置12～24h，待沉淀完全后進行下一步離心處理；
五、利用三項轉(zhuǎn)鼓離心分離機對上步得到的消泡濃縮液進行離心濃縮，離心轉(zhuǎn)速為8000～12000r/min，離心時間為5～10min，離心后收集固相物即為乳酸鏈球菌素粗制半成品原料，其生物效價≥15000iu/mg，水分含量為10％～30％；
所述的經(jīng)過瓊脂糖凝膠親和色譜層析柱進行乳酸鏈球菌素純化的操作步驟為：
一、用ph為2.50～3.50的平衡緩沖液，以0.001～0.100l/min的流速對瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行柱平衡，當流出液的ph與平衡緩沖液的ph相同時停止柱平衡；
二、取生物效價≧15000iu/mg的乳酸鏈球菌素粗制半成品，溶解于平衡緩沖液中，配制成濃度為1.0～50.0g/l的樣品走柱液，在經(jīng)過步驟一柱平衡后的瓊脂糖凝膠色譜柱上對樣品走柱液進行走柱處理以吸附乳酸鏈球菌素分子，當流出液中的乳酸鏈球菌素的生物效價≧50iu/ml，則瓊脂糖凝膠層析色譜吸附達到飽和；
三、乳酸鏈球菌素走樣吸附達到飽和后，再用平衡緩沖液頂柱，清除柱層空隙中沒有完全被吸附的樣品走柱液，當流出液的ph與平衡緩沖液的ph相同時，停止頂柱處理；
四、用ph在2.00～3.00之間的洗脫液對步驟三處理后的瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行分離產(chǎn)物洗脫，以0.001～0.100l/min的流速對色譜柱進行柱洗脫，在洗脫過程中分三段對洗脫液進行收集：第一段為光吸收130以下收集，第二段為光吸收130到峰值再降到80之間收集，第三段為光吸收80到20之間收集，當流出液的ph與洗脫液相同時停止洗脫；
其中，平衡緩沖液是酸與鈉鹽的混合溶液，平衡緩沖液中的酸的濃度為0.04～0.14mol/l，鈉鹽的濃度為0.04～0.14mol/l；
其中，洗脫液是酸與鈉鹽和氯鹽的混合溶液，洗脫液中酸的濃度為0.02～0.12mol/l，鈉鹽的濃度為0.02～0.12mol/l，氯鹽的濃度為0.1mol/l。
本發(fā)明包含以下有益效果：
常規(guī)提取方法包括陶瓷膜固液分離、泡沫分離或有機膜濃縮、鹽析、沉淀、ph2.5酸水稀釋、噴霧干燥等工藝，生產(chǎn)出來的nisin生物效價≧900iu/ml,本發(fā)明方案中的關(guān)鍵步驟是瓊脂糖凝膠親和層析色譜，對生物效價≧15000iu/毫克的nisin粗制半成品進行純化分離，經(jīng)過樣品溶液處理、樣品瓊脂糖凝膠色譜柱走樣吸附、洗脫、強酸沉淀、丙酮洗滌、冷凍干燥和膠體磨研磨，可以生產(chǎn)純度大于等于98％，生物效價大于等于39200iu/毫克的高純度乳酸鏈球菌素，在醫(yī)藥級生產(chǎn)條件下可以生產(chǎn)醫(yī)用級別的高純度nisin原料。本發(fā)明與傳統(tǒng)技術(shù)制備的普通食品級nisin相比，純度提高了約43.5倍。
本發(fā)明制得的乳酸鏈球菌素純度≧98％的，活力≧39000iu/mg的醫(yī)藥級高純度乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
具體實施方式
具體實施方式一：本實施方式的一種利用瓊脂糖凝膠親和層析色譜提取醫(yī)藥級超高純度乳酸鏈球菌素的方法，它是按照以下步驟進行：
以生物效價≥15000iu/mg的乳酸鏈球菌素粗制半成品為原料，再經(jīng)過瓊脂糖凝膠親和色譜層析柱進行乳酸鏈球菌素純化，最后經(jīng)過冷凍干燥制成超高純度乳酸鏈球菌素純品；
其中，生物效價≥15000iu/mg的乳酸鏈球菌素粗制半成品的制備方法如下：
一、利用陶瓷膜對乳酸鏈球菌素最終發(fā)酵活力≥8500iu/ml的發(fā)酵液進行固液分離，分離得到清液進行下一步處理；其中，分離前發(fā)酵液的ph預先調(diào)至2.5，并在70℃下恒速攪拌30min；
二、利用孔徑不同的兩級膜對上步驟得到的清液進行第一級和第二級的分離和濃縮，第一級分離后濃縮倍數(shù)為4～8倍，第二級分離后濃縮倍數(shù)為8～14倍，得到的濃縮液進行下一步處理；所述的兩級膜為卷式超濾膜，其中，第一級膜孔徑為10000～100000；第二級膜孔徑為1000～10000；
三、利用竹制或椰殼制顆粒狀活性炭對上述一次濃縮液進行脫色處理，得到脫色后濃縮液；
四、利用泡沫分離法對步驟三得到的脫色后濃縮液進行乳酸鏈球菌素的二次濃縮分離，在泡沫分離過程中以2～6個碳原子數(shù)的食品級分析純正烷醇對泡沫進行消泡處理，得到的消泡濃縮液加入0.5～1.5倍體積的相同的正烷醇，在轉(zhuǎn)速為10～50轉(zhuǎn)/min的條件下攪拌30～60min，靜置12～24h，待沉淀完全后進行下一步離心處理；
五、利用三項轉(zhuǎn)鼓離心分離機對上步得到的消泡濃縮液進行離心濃縮，離心轉(zhuǎn)速為8000～12000r/min，離心時間為5～10min，離心后收集固相物即為乳酸鏈球菌素粗制半成品原料，其生物效價≥15000iu/mg，水分含量為10％～30％；
所述的經(jīng)過瓊脂糖凝膠親和色譜層析柱進行乳酸鏈球菌素純化的操作步驟為：
一、用ph為2.50～3.50的平衡緩沖液，以0.001～0.100l/min的流速對瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行柱平衡，當流出液的ph與平衡緩沖液的ph相同時停止柱平衡；
二、取生物效價≧15000iu/mg的乳酸鏈球菌素粗制半成品，溶解于平衡緩沖液中，配制成濃度為1.0～50.0g/l的樣品走柱液，在經(jīng)過步驟一柱平衡后的瓊脂糖凝膠色譜柱上對樣品走柱液進行走柱處理以吸附乳酸鏈球菌素分子，當流出液中的乳酸鏈球菌素的生物效價≧50iu/ml，則瓊脂糖凝膠層析色譜吸附達到飽和；
三、乳酸鏈球菌素走樣吸附達到飽和后，再用平衡緩沖液頂柱，清除柱層空隙中沒有完全被吸附的樣品走柱液，當流出液的ph與平衡緩沖液的ph相同時，停止頂柱處理；
四、用ph在2.00～3.00之間的洗脫液對步驟三處理后的瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行分離產(chǎn)物洗脫，以0.001～0.100l/min的流速對色譜柱進行柱洗脫，在洗脫過程中分三段對洗脫液進行收集：第一段為光吸收130以下收集，第二段為光吸收130到峰值再降到80之間收集，第三段為光吸收80到20之間收集，當流出液的ph與洗脫液相同時停止洗脫；
其中，平衡緩沖液是酸與鈉鹽的混合溶液，平衡緩沖液中的酸的濃度為0.04～0.14mol/l，鈉鹽的濃度為0.04～0.14mol/l；
其中，洗脫液是酸與鈉鹽和氯鹽的混合溶液，洗脫液中酸的濃度為0.02～0.12mol/l，鈉鹽的濃度為0.02～0.12mol/l，氯鹽的濃度為0.1mol/l。
具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同點在于：所述的平衡緩沖液為檸檬酸與檸檬酸鈉的混合溶液、蘋果酸與蘋果酸鈉的混合溶液、磷酸與磷酸鈉的混合溶液、硫酸與硫酸鈉的混合溶液、乳酸與乳酸鈉的混合溶液或鹽酸與氯化鈉的混合溶液。其它與具體實施方式一相同。
具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一不同點在于：所述的洗脫液為檸檬酸與檸檬酸鈉的混合溶液、蘋果酸與蘋果酸鈉的混合溶液、磷酸與磷酸鈉的混合溶液、硫酸與硫酸鈉的混合溶液、乳酸與乳酸鈉的混合溶液或鹽酸與氯化鈉的混合溶液。其它與具體實施方式一相同。
具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一不同點在于：所述的氯鹽為licl、nacl或kcl。其它與具體實施方式一相同。
具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一不同點在于：走柱液在走柱之前需進行離心、過濾和抽氣處理。其它與具體實施方式一相同。
具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一不同點在于：在經(jīng)過冷凍干燥制成超高純度乳酸鏈球菌素純品之前，需將經(jīng)過瓊脂糖凝膠親和色譜層析柱純化后的乳酸鏈球菌素，進行酸沉淀后離心、洗滌處理。其它組成和連接方式與具體實施方式一相同。
具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一不同點在于：在進行酸沉淀后離心、洗滌處理后的乳酸鏈球菌素進行冷凍干燥制成超高純度乳酸鏈球菌素純品，具體操作如下：
一、將收集到的洗脫液，按照其體積的12％～20％添加配制好的強酸溶液，在轉(zhuǎn)速為10～50轉(zhuǎn)/min的條件下攪拌30～120min，靜止沉淀12～24h；
二、將上述沉淀后的液體在0～4℃溫度下離心10min，轉(zhuǎn)速為6000～12000rpm，離心后棄去上清液；
三、將上述離心得到的沉淀加入含有質(zhì)量體積百分含量為12％～20％三氯乙酸的丙酮，將沉淀完全打散，在0～4℃溫度下離心10～30min，轉(zhuǎn)速為6000～12000rpm，離心后棄去上清液，收集沉淀；
四、用1～2倍體積的丙酮清洗步驟三的沉淀2～3次；
五、將處理清洗后的沉淀放入冷凍干燥機中，在-40℃～-20℃條件下進行冷凍干燥，凍干10～20h；
六、將凍干后的沉淀用膠體磨研磨成粉，然后進行生物效價的檢測，放置在低溫冰箱中保存，即制得超高純度乳酸鏈球菌素純品；其中，所述的強酸溶液濃度為30％～60％。
其它與具體實施方式一相同。
具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一不同點在于：強酸為三氟乙酸、二氟乙酸、一氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸、三溴乙酸、二溴乙酸或一溴乙酸。其它與具體實施方式一相同。
本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實施方式的內(nèi)容，其中一個或幾個具體實施方式的組合同樣也可以實現(xiàn)發(fā)明的目的。
通過以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：
實施例一：
本實施例的一種利用瓊脂糖凝膠親和層析色譜提取超高純度乳酸鏈球菌素的方法，它是按照以下步驟進行：
1、取下罐時生物效價為9236iu/ml的nisin發(fā)酵液100.0l，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至2.5，70℃下恒速攪拌30min，用小型陶瓷膜對發(fā)酵菌體進行固液分離。固液分離后，收集得到陶瓷膜過濾清液體積為101.5l，經(jīng)測定此次過濾清液的nisin效價為9070iu/ml。此步的回收率為99.68％。
2、對上步獲得的陶瓷膜過濾清液進行兩級卷式超濾膜過濾提純和濃縮。第一級采用膜分子量為80000的卷式超濾膜，濃縮約5倍后得到一級濃縮液體積為20.2l，測定一級濃縮液的nisin效價為45235iu/ml。這一步的回收率為99.25％。
3、第二級采用膜分子量為5000的有機卷式超濾膜，將一級濃縮液繼續(xù)濃縮約2.1倍后得到二級濃縮液體積為9.59l(二級濃縮后與陶瓷膜過濾清液相比共濃縮了約10.6倍)，測定二級濃縮液的效價為92328iu/ml。這一步的回收率為96.90％。得到的二級濃縮液進行下一步處理。
4、利用竹制顆粒狀活性炭對上述二級濃縮液進行脫色處理，得到脫色后濃縮液9.55l，脫色后二級濃縮脫色液效價為85038iu/ml。這一步的回收率為91.72％；
5、利用泡沫分離法對上述步驟得到的二級濃縮脫色液進行nisin的二次濃縮分離，在泡沫分離過程中以食品級正丙醇對泡沫進行消泡處理，得到的消泡濃縮液的總體積為4.22l，消泡濃縮液的生物效價為168927iu/ml。這一步的回收率為87.78％。
6、向上步獲得的消泡濃縮液中加入75％體積的正丙醇，可以看到分離的到的多肽及少量雜質(zhì)蛋白會出現(xiàn)明顯的細絮狀沉淀。然后利用三項轉(zhuǎn)鼓離心分離機對上述得到的細絮狀沉淀連同濃縮液一齊進行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時間為10min，離心后收集固相物質(zhì)量41.74g(水分含量為19％)，即為nisin粗制半成品原料，其生物效價為18830iu/mg。至這一步總回收率為85.10％。
7、用ph＝2.80的平衡緩沖液(0.06mol/l的檸檬酸與0.06mol/l的檸檬酸鈉混合溶液)以0.06l/min的流速對瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行柱平衡，當流出液的ph＝2.80時停止進平衡液，柱平衡結(jié)束。
8、取步驟6中制得的效價為18830iu/mg的nisin粗制半成品，溶解于上述平衡液中，配制成3.7g/l的樣品走柱液溶液，該溶液在走柱之前經(jīng)過充分地離心、過濾和抽氣，然后以0.012l/min的流速經(jīng)過柱平衡后的瓊脂糖凝膠色譜柱上對樣品走柱液進行走柱處理以吸附nisin分子，利用hplc每隔2h測定一次nisin含量，當流出液中的nisin的含量達到90iu/ml時，便可以停止進樣吸附。
9、nisin走樣吸附達到飽和后，再用2倍柱層床體積的平衡液頂柱，清除柱層空隙中沒有完全被吸附的樣品走柱液。
10、用ph＝2.50的洗脫液以0.018l/min的流速對吸附nisin飽和了的瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行洗脫，在洗脫過程中分三段對洗脫液進行收集(利用上海嘉鵬科技有限公司生產(chǎn)的hd-a電腦層析采集儀與核酸蛋白檢測儀，并利用該儀器自帶的分析軟件在電腦上安裝并在電腦上直接查看吸光值)，一般情況下第一段為光吸收130以下，第二段為光吸收130到峰值再降到80，第三段為光吸收80到20，當流出液的ph＝2.50時來判斷是否可以停止；其中洗脫液可以是0.06mol/l的磷酸與其0.06mol/l的磷酸鈉混合溶液，再按體積加入0.1mol/l的licl。
11、收集到的洗脫液，按照體積的18％添加配制好的三氯乙酸溶液，30轉(zhuǎn)/min下攪拌40min，靜止沉淀15h。
12、將上述沉淀好的液體在4℃溫度下離心10min，轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心后棄去上清液。
13、將上述離心得到的沉淀加入含有18％三氯乙酸的丙酮，將沉淀完全打散，在4℃溫度下離心15min，轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心后棄去上清液。
14、用2倍體積的丙酮清洗上述沉淀2～3次。
15、將上述洗滌好的沉淀放入冷凍干燥機中，在-35℃條件下進行冷凍干燥，凍干14h。這步結(jié)束后，得到18.1068g淺灰褐色的干燥沉淀。
16、將凍干后的沉淀用低溫膠體磨研磨成粉，得到18.0004g淺灰褐色高純度nisin粉末，生物效價測定后結(jié)果為39968iu/mg，產(chǎn)品純度為99.92％，至此步結(jié)束總回收率為78.41％。
實施例二：
本實施例的一種利用瓊脂糖凝膠親和層析色譜提取超高純度乳酸鏈球菌素的方法，它是按照以下步驟進行：
1、取下罐時效價活力為9784iu/ml的nisin發(fā)酵液220.0l，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至2.5，70℃下恒速攪拌30min，用小型陶瓷膜對發(fā)酵菌體進行固液分離。固液分離后，收集得到陶瓷膜過濾清液體積為223.1l，經(jīng)測定此次過濾清液的nisin效價為9575iu/ml。此步的回收率為99.24％
2、對上步獲得的陶瓷膜過濾清液進行兩級卷式超濾膜過濾提純和濃縮。第一級采用膜孔徑為50000的有機卷式超濾膜，濃縮約4.5倍后得到一級濃縮液體積為49.50l，測定一級濃縮液的nisin效價為43119iu/ml。這一步的回收率為99.16％。
3、第二級采用膜孔徑為3000的有機卷式超濾膜，將一級濃縮液繼續(xù)濃縮約2.5倍后得到二級濃縮液體積為19.80l(二級濃縮后與陶瓷膜過濾清液相比共濃縮了約11.3倍)，測定二級濃縮液的效價為105667iu/ml。這一步的總回收率為97.20％。得到的二級濃縮液進行下一步處理。
4、利用竹制顆粒狀活性炭對上述二級濃縮液進行脫色處理，得到脫色后濃縮液19.75l，脫色后二級濃縮脫色液效價為100660iu/ml。這一步的回收率為92.36％；
5、利用泡沫分離法對上述步驟得到的二級濃縮脫色液進行nisin的二次濃縮分離，在泡沫分離過程中以食品級正丁醇對泡沫進行消泡處理，得到的消泡濃縮液的總體積為9.85l，消泡濃縮液的生物效價為194838iu/ml。這一步的回收率為89.16％。
6、向上步獲得的消泡濃縮液中加入1倍體積的正丁醇，可以看到分離得到的多肽及少量雜質(zhì)蛋白會出現(xiàn)明顯的細絮狀沉淀。然后利用三項轉(zhuǎn)鼓離心分離機對上述得到的細絮狀沉淀連同濃縮液一齊進行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時間為15min，離心后收集固相物質(zhì)量87.65g(水分含量為20％)，即為nisin粗制半成品原料，其生物效價為21186iu/mg。至這一步總回收率為86.27％。
7、用ph＝3.00的平衡緩沖液(0.05mol/l的乳酸與0.05mol/l的乳酸鈉混合溶液)以0.058l/min的流速對瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行柱平衡，當流出液的ph＝3.00時停止進平衡液，柱平衡結(jié)束。
8、取步驟6中制得的效價為21186iu/mg的nisin粗制半成品，溶解于上述平衡液中，配制成8.3g/l的樣品走柱液溶液，該溶液在走柱之前經(jīng)過充分地離心、過濾和抽氣，然后以0.006l/min的流速經(jīng)過柱平衡后的瓊脂糖凝膠色譜柱上對樣品走柱液進行走柱處理以吸附nisin分子，利用hplc每隔2h測定一次nisin含量，當流出液中的nisin的含量達到121iu/ml時，停止進樣吸附。
9、nisin走樣吸附達到飽和后，再用2倍柱層床體積的平衡液頂柱，清除柱層空隙中沒有完全被吸附的樣品走柱液。
10、用ph＝2.50的洗脫液以0.014l/min的流速對吸附nisin飽和了的瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行洗脫，在洗脫過程中分三段對洗脫液進行收集(利用上海嘉鵬科技有限公司生產(chǎn)的hd-a電腦層析采集儀與核酸蛋白檢測儀，并利用該儀器自帶的分析軟件在電腦上安裝并在電腦上直接查看吸光值)，一般情況下第一段為光吸收130以下，第二段為光吸收130到峰值再降到80，第三段為光吸收80到20，當流出液的ph＝2.50時來判斷是否可以停止；其中洗脫液可以是0.06mol/l的乙酸與其0.06mol/l的乙酸鈉混合溶液，再按體積加入0.1mol/l的kcl。
11、收集到的洗脫液，按照體積的15％添加配制好的三氯乙酸溶液，10轉(zhuǎn)/min下攪拌60min，靜止沉淀12h。
12、將上述沉淀好的液體在4℃溫度下離心10min，轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心后棄去上清液。
13、將上述離心得到的沉淀加入含有20％三氯乙酸的丙酮，將沉淀完全打散，在4℃溫度下離心15min，轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心后棄去上清液。
14、用2倍體積的丙酮清洗上述沉淀2次。
15、將上述洗滌好的沉淀放入冷凍干燥機中，在-40℃～-30℃條件下進行冷凍干燥，凍干12h。這步結(jié)束后，得到39.7825g淺灰褐色的干燥沉淀。
16、將凍干后的沉淀用低溫膠體磨打磨成粉，得到39.7825g淺灰褐色高純度nisin粉末，生物效價測定后結(jié)果為40128iu/mg，產(chǎn)品純度為100.32％，至此步結(jié)束總回收率為74.17％。
實施例三：
本實施例的一種利用瓊脂糖凝膠親和層析色譜提取超高純度乳酸鏈球菌素的方法，它是按照以下步驟進行：
1、取下罐時效價活力為12245iu/ml的nisin發(fā)酵液2300.0l，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至2.5，70℃下恒速攪拌30min，用陶瓷膜對發(fā)酵菌體進行固液分離。固液分離后，收集得到陶瓷膜過濾清液體積為2345.0l，經(jīng)測定此次過濾清液的nisin效價為11988iu/ml。此步的回收率為99.82％。
2、對上步獲得的陶瓷膜過濾清液進行兩級卷式超濾膜過濾提純和濃縮。第一級采用膜孔徑為50000的有機卷式超濾膜，濃縮約5.0倍后得到一級濃縮液體積為469.0l，測定一級濃縮液的nisin效價為59920iu/ml。這一步的回收率為99.78％。
3、第二級采用膜孔徑為3000的有機卷式超濾膜，將一級濃縮液繼續(xù)濃縮約2.0倍后得到二級濃縮液體積為234.0l(二級濃縮后與陶瓷膜過濾清液相比共濃縮了約10.1倍)，測定二級濃縮液的效價為118897iu/ml。這一步的總回收率為98.78％。得到的二級濃縮液進行下一步處理。
4、利用竹制顆粒狀活性炭對上述二級濃縮液進行脫色處理，得到脫色后濃縮液230.0l，脫色后二級濃縮脫色液效價為113567iu/ml。這一步的回收率為92.75％；
5、利用泡沫分離法對上述步驟得到的二級濃縮脫色液進行nisin的二次濃縮分離，在泡沫分離過程中以食品級正戊醇對泡沫進行消泡處理，得到的消泡濃縮液的總體積為121l，消泡濃縮液的生物效價為209838iu/ml。這一步的回收率為90.15％。
6、向上步獲得的消泡濃縮液中加入1倍體積的正丁醇，可以看到分離得到的多肽及少量雜質(zhì)蛋白會出現(xiàn)明顯的細絮狀沉淀。然后利用三項轉(zhuǎn)鼓離心分離機對上述得到的細絮狀沉淀連同濃縮液一齊進行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時間為17min，離心后收集固相物質(zhì)量1011.9g(水分含量為23％)，即為nisin粗制半成品原料，其生物效價為24039iu/mg。至這一步總回收率為86.37％。
7、用ph＝3.10的平衡緩沖液(0.05mol/l的乙酸與0.05mol/l的乙酸鈉混合溶液)以0.019l/min的流速對瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行柱平衡，當流出液的ph＝3.10時停止進平衡液，柱平衡結(jié)束。
8、取步驟6中制得的效價為24039iu/mg的nisin粗制半成品，溶解于上述平衡液中，配制成35.0g/l的樣品走柱液溶液，該溶液在走柱之前經(jīng)過充分地離心、過濾和抽氣，然后以0.006l/min的流速經(jīng)過柱平衡后的瓊脂糖凝膠色譜柱上對樣品走柱液進行走柱處理以吸附nisin分子，利用hplc每隔4h測定一次nisin含量，當流出液中的nisin的含量達到109iu/ml時，停止進樣吸附。
9、nisin走樣吸附達到飽和后，再用2.2倍柱層床體積的平衡液頂柱，清除柱層空隙中沒有完全被吸附的樣品走柱液。
10、用ph＝2.80的洗脫液以0.014l/min的流速對吸附nisin飽和了的瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行洗脫，在洗脫過程中分三段對洗脫液進行收集(利用上海嘉鵬科技有限公司生產(chǎn)的hd-a電腦層析采集儀與核酸蛋白檢測儀，并利用該儀器自帶的分析軟件在電腦上安裝并在電腦上直接查看吸光值)，一般情況下第一段為光吸收130以下，第二段為光吸收130到峰值再降到80，第三段為光吸收80到20，當流出液的ph＝2.50時來判斷是否可以停止；其中洗脫液可以是0.06mol/l的乙酸與其0.06mol/l的乙酸鈉混合溶液，再按體積加入0.1mol/l的nacl。
11、收集到的洗脫液，按照體積的20％添加配制好的三氯乙酸溶液，20轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速攪拌50min，靜止沉淀12h。
12、將上述沉淀好的液體在4℃溫度下離心10min，轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心后棄去上清液。
13、將上述離心得到的沉淀加入含有20％三氯乙酸的丙酮，將沉淀完全打散，在4℃溫度下離心15min，轉(zhuǎn)速為9000rpm，離心后棄去上清液。
14、用1.5倍體積的丙酮清洗上述沉淀2次。
15、將上述洗滌好的沉淀放入冷凍干燥機中，在-38℃條件下進行冷凍干燥，凍干12h。這步結(jié)束后，得到39.7825g淺灰褐色的干燥沉淀。
16、將凍干后的沉淀用膠體磨打磨成粉，得到549.765g淺灰褐色高純度nisin粉末，生物效價測定后結(jié)果為39999iu/mg，產(chǎn)品純度為99.9975％，至此步結(jié)束總回收率為78.08％。