本發(fā)明公開了一種多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一，其是由結(jié)腸上皮細(xì)胞中不斷積累的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變所導(dǎo)致的；每年大概有1235108人被確診為結(jié)直腸癌，每年死亡人數(shù)大概為609051人；世界衛(wèi)生組織估計(jì)到2030年，結(jié)直腸癌的確診病例將會(huì)新增77%，死亡病例將會(huì)新增80%，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，結(jié)直腸癌在中國(guó)的發(fā)病率和死亡人數(shù)正在逐年上升，結(jié)直腸癌的防治形勢(shì)非常嚴(yán)峻。

目前大多數(shù)結(jié)直腸癌是從腺瘤發(fā)展而來的，而且從腺瘤轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤的時(shí)間大約是10-15年，也就是說在轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤之前，我們有10-15年的時(shí)間來發(fā)現(xiàn)并切除腺瘤從而阻止其惡變。目前，最有效的降低結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率的方法就是結(jié)直腸癌的早期診斷；因?yàn)樵诮Y(jié)直腸癌早期，病人并沒有明顯的臨床癥狀，這就導(dǎo)致很多病人在被確診的時(shí)候，已經(jīng)處于結(jié)直腸癌的晚期了，但是在發(fā)病初期就對(duì)病人進(jìn)行治療才是最有效的；通過早期診斷可以在發(fā)生癌變前就發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸的病變或者在癌變的早期就發(fā)現(xiàn)病情，然后盡可能早的對(duì)病人進(jìn)行有效而系統(tǒng)的治療，從而有效的降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率；早期診斷主要針對(duì)的是大量的無癥狀人群，所以一個(gè)理想的早期診斷技術(shù)應(yīng)該是操作簡(jiǎn)單、成本較低、對(duì)病人無創(chuàng)傷以及特異性和敏感性都較高的檢測(cè)方法。當(dāng)前臨床上應(yīng)用的最準(zhǔn)確的結(jié)直腸癌早期診斷方法是結(jié)腸鏡檢查，其缺點(diǎn)是檢查費(fèi)用較高、操作程序較復(fù)雜以及病人比較排斥，并不適合在普通人群中大規(guī)模推廣應(yīng)用。另一個(gè)臨床上常用的方法是糞便隱血檢查，該方法雖然費(fèi)用較低，操作起來也比較簡(jiǎn)單，但是它最大的缺點(diǎn)就是敏感性和特異性不高。

表觀遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)所有的結(jié)直腸癌都有幾百到幾千個(gè)基因發(fā)生了異常的dna甲基化，其中一部分基因的異常甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)病是密切相關(guān)的；目前，基于血液的結(jié)直腸癌早期診斷方法最有效的就是以sept9基因啟動(dòng)子區(qū)的dna甲基化作為生物標(biāo)記，用該方法對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行早期診斷，可以得到90%的敏感度和88%的特異性，但是該方法對(duì)于腺瘤的敏感度和特異性都很低；另外用該方法對(duì)50歲以上的無臨床癥狀人群（7941人）進(jìn)行早期結(jié)直腸癌篩查的研究結(jié)果顯示，雖然特異性能夠達(dá)到91.5%，但是對(duì)于ⅰ-ⅳ結(jié)直腸癌的敏感度分別只有35%、63%、46%和77.4%。對(duì)于腺瘤的敏感度更是只有11.2%；基于糞便的結(jié)直腸癌早期診斷方法最成功的應(yīng)該是以4個(gè)基因（bmp3，ndrg4，vimentin和tfpi2）啟動(dòng)子區(qū)的dna甲基化作為生物標(biāo)記，并同時(shí)檢測(cè)糞便dna中kras基因的突變和糞便中血紅蛋白的含量，該方法在特異性為90%的前提下，對(duì)于結(jié)直腸癌的敏感度為85%，對(duì)大于1cm的腺瘤的敏感度為54%；無論是基于血液的方法還是基于糞便的方法，目前都還沒有一個(gè)特別理想的診斷技術(shù)適合在臨床上廣泛推廣應(yīng)用。

值得注意的是，此前的研究基本都是將特定基因啟動(dòng)子區(qū)的dna甲基化作為結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)記，很少有人將關(guān)注的目光放在啟動(dòng)子區(qū)以外的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域?；虻膯?dòng)子就像“開關(guān)”，決定基因的活動(dòng)，控制基因轉(zhuǎn)錄的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。但是啟動(dòng)子區(qū)以外的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域同樣也會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄，很多情況下也會(huì)決定基因轉(zhuǎn)錄的起始時(shí)間和表達(dá)的程度，基因啟動(dòng)子區(qū)以外的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域也應(yīng)該受到同樣的關(guān)注。

ctcf是一種廣泛存在于真核生物中的多功能轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)化上高度保守的多鋅指、dna結(jié)合核蛋白。ctcf通過其鋅指結(jié)構(gòu)的不同組合，可以選擇性識(shí)別多種dna序列，并形成不同的ctcf-dna復(fù)合體，發(fā)揮對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控作用，具有啟動(dòng)子抑制和激活、基因沉默、增強(qiáng)子阻斷、基因印跡調(diào)控、x染色體失活等多種生物學(xué)功能。ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)在人類基因組是中普遍存在的，大概有5-6萬個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)識(shí)別大約34個(gè)核苷酸；目前還未見將多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)作為結(jié)直腸腫瘤早期診斷的生物標(biāo)記的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的新用途，即多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13在制備用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷、篩查和患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，該結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒包括常規(guī)基因組dna提取試劑、甲基化dna的亞硫酸氫鹽處理試劑、進(jìn)行dna甲基化檢測(cè)所需的試劑以及引物對(duì)，該引物對(duì)能夠擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過的甲基化或未甲基化的seqidno:1所示序列并對(duì)所擴(kuò)增的序列用dna質(zhì)譜法進(jìn)行后續(xù)的dna甲基化檢測(cè)。該結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)，而在正常組織中處于低甲基化狀態(tài)。

所述引物對(duì)序列如seqidno:2和seqidno:3所示。

本申請(qǐng)首次將多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)作為結(jié)直腸腫瘤早期診斷的生物標(biāo)記。首先，通過分析已發(fā)表的ctcf在人類基因組中的dna結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)，并結(jié)合已發(fā)表的人類基因組dna甲基化數(shù)據(jù)，我們共篩選出了121個(gè)位點(diǎn)的ctcf結(jié)合模式與dna甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性，即這些位點(diǎn)dna甲基化程度的高低與ctcf結(jié)合的多少存在負(fù)相關(guān)。這121個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)就屬于在腫瘤細(xì)胞系中特異性的，并且其結(jié)合模式與dna甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性。第二步，通過高分辨率溶解曲線法（hrm）在33個(gè)結(jié)直腸腫瘤組織樣本及其對(duì)應(yīng)的正常樣本中檢測(cè)了這121個(gè)位點(diǎn)的dna甲基化水平，從中篩選出了23個(gè)甲基化模式具有腫瘤特異性的位點(diǎn)。由于hrm法在檢測(cè)dna甲基化應(yīng)用中不能進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，所以也就不能進(jìn)一步比較所篩選出的23個(gè)位點(diǎn)優(yōu)劣，所以后續(xù)的dna甲基化檢測(cè)都是用dna質(zhì)譜法完成的；第三步，通過dna質(zhì)譜法在20個(gè)結(jié)直腸腫瘤組織樣本及其對(duì)應(yīng)的正常樣本中檢測(cè)了23個(gè)位點(diǎn)的dna甲基化水平，根據(jù)這23個(gè)位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織上的表現(xiàn)，從中篩選出了10個(gè)表現(xiàn)最好的位點(diǎn)通過擴(kuò)大樣本作進(jìn)一步篩選。第四步，通過dna質(zhì)譜法在70個(gè)結(jié)直腸腫瘤組織樣本及20個(gè)正常樣本中檢測(cè)了10個(gè)位點(diǎn)的dna甲基化水平，根據(jù)這10個(gè)位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織上的表現(xiàn)，選擇了5個(gè)表現(xiàn)最好的位點(diǎn)在大樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。第五步，通過dna質(zhì)譜法在295個(gè)結(jié)直腸腫瘤組織樣本及84個(gè)正常樣本中檢測(cè)了5個(gè)位點(diǎn)的dna甲基化水平，最終篩選并鑒定出了本申請(qǐng)用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷分子標(biāo)記的ctcf結(jié)合位點(diǎn)。該位點(diǎn)在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)，而在正常組織中處于低甲基化狀態(tài)，提示ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的dna甲基化是結(jié)直腸腫瘤早期診斷的分子標(biāo)記。

該結(jié)合位點(diǎn)表現(xiàn)出了很高的準(zhǔn)確性。在特異性為95%的前提下，它在檢測(cè)腺瘤、ⅰ期結(jié)直腸癌、ⅱ期結(jié)直腸癌、ⅲ期結(jié)直腸癌和所有結(jié)直腸腫瘤中的敏感度分別為79.79%、96.84%、88.06%、87.66%和87.14%。也就是說，ctcf_13檢測(cè)ⅰ期結(jié)直腸腫瘤的準(zhǔn)確性最高（特異性為95%的前提下敏感度為96.84%）。而且，在特異性為95%的前提下，它在檢測(cè)ⅰ期結(jié)直腸癌、ⅱ期結(jié)直腸癌、ⅲ期結(jié)直腸癌和所有結(jié)直腸腫瘤中的敏感度都大于87%，雖然檢測(cè)腺瘤的敏感度最低，但是也達(dá)到了79.79%。說明這個(gè)位點(diǎn)對(duì)于所有結(jié)直腸腫瘤的早期診斷都具有很高的準(zhǔn)確性。

另外，當(dāng)本申請(qǐng)?zhí)峁┑亩喙δ苻D(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與另外4個(gè)ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)組成一組用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷的分子標(biāo)記，并以5個(gè)位點(diǎn)中任意2個(gè)或2個(gè)以上為陽(yáng)性作為腫瘤陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可以得到最優(yōu)的特異性和敏感度（分別為94.05%和93.54%），特別是對(duì)于腺瘤檢測(cè)的特異性和敏感度分別達(dá)到94.05%和91.67%。

即本發(fā)明另一目的是將多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與下述4個(gè)ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)中任意一個(gè)或幾個(gè)應(yīng)用在制備用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷試劑盒中；

（1）核苷酸序列如seqidno:4所示的ctcfdna結(jié)合位點(diǎn)；

（2）核苷酸序列如seqidno:5所示的ctcfdna結(jié)合位點(diǎn)；

（3）核苷酸序列如seqidno:6所示的ctcfdna結(jié)合位點(diǎn)；

（4）核苷酸序列如seqidno:7所示的ctcfdna結(jié)合位點(diǎn)。

雖然bmp3和ndrg4是已報(bào)道的結(jié)直腸腫瘤早期診斷的分子標(biāo)記中表現(xiàn)最好的，但是我們通過dna質(zhì)譜法在62個(gè)結(jié)直腸腫瘤組織樣本及58個(gè)正常樣本中檢測(cè)了bmp3和ndrg4以及ctcf_13的dna甲基化水平，結(jié)果顯示，在特異性為90%的前提下，ctcf_13的敏感度為81.64%，而bmp3和ndrg4的敏感度分別為48.56%和69.56%。也就是說，本申請(qǐng)?zhí)峁┑慕Y(jié)直腸腫瘤早期診斷的分子標(biāo)記ctcf_13的檢測(cè)準(zhǔn)確性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報(bào)道的分子標(biāo)記。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下:

本發(fā)明提供的ctcf結(jié)合位點(diǎn)無論是檢測(cè)結(jié)直腸腺瘤還是結(jié)直腸癌的準(zhǔn)確性都要顯著高于已報(bào)道的dna甲基化分子標(biāo)記；本申請(qǐng)不僅僅提供了一種更為有效的結(jié)直腸腫瘤早期診斷技術(shù)，對(duì)于建立其它腫瘤的早期診斷技術(shù)也具有借鑒意義，而且ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)還有可能成為腫瘤治療效果監(jiān)測(cè)和預(yù)后效果評(píng)估以及腫瘤分子分型（如cimp分型）的生物標(biāo)記。總之，本研究為尋找更為有效的腫瘤早期診斷、治療效果監(jiān)測(cè)、預(yù)后效果評(píng)估以及分子分型的分子標(biāo)記提供了新的思路，對(duì)腫瘤的預(yù)防和治療都具有重要意義。

附圖說明

圖1是23個(gè)具有腫瘤特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)在40個(gè)樣本中的dna質(zhì)譜結(jié)果分層聚類圖；圖中列代表的是樣本，行代表的是ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

下面通過附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中方法如無特殊說明均為常規(guī)方法，使用的試劑如無特殊說明均為常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。

實(shí)施例1：多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)的篩選

1、樣本收集

收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年4月至2016年8月結(jié)直腸癌患者的新鮮腫瘤組織187例及其對(duì)應(yīng)的正常組織（距離腫瘤邊緣6cm以上）84例；在腸鏡室收集了新鮮腺瘤組織108例。所有樣本共計(jì)379例，其中正常組織84例，腫瘤組織295例；上述樣本臨床資料情況如表1所示：

表1樣本信息表

。

2、基因組dna提取和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

基因組dna的提取使用的是qiagen公司的qiaampdnaminikit（貨號(hào)51304）試劑盒，所有操作都是根據(jù)試劑盒的說明書來完成的。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化使用的是qiagen公司的epitectfastdnabisulfitekit（貨號(hào)59826）試劑盒，所有操作都是根據(jù)試劑盒的說明書來完成的。

3、候選ctcf結(jié)合位點(diǎn)的篩選

wang等人通過分析19種人類細(xì)胞系（包括7種腫瘤細(xì)胞系和12種正常細(xì)胞系）中ctcf的chip-seq數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)了1236個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合模式是腫瘤細(xì)胞系特異的，這些特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)可以將7種腫瘤細(xì)胞系與12種正常細(xì)胞系區(qū)分開。結(jié)合已發(fā)表的13種細(xì)胞系（包括6種腫瘤細(xì)胞系和7種正常細(xì)胞系）中ctcf結(jié)合位點(diǎn)的dna甲基化數(shù)據(jù)，我們?cè)谶@1236個(gè)腫瘤細(xì)胞系特異的ctcf結(jié)合位點(diǎn)中共發(fā)現(xiàn)121個(gè)位點(diǎn)的ctcf結(jié)合模式與dna甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性，即這些位點(diǎn)的dna甲基化程度越高，ctcf的結(jié)合就越少。這121個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)就屬于在腫瘤細(xì)胞系中特異性的，并且其結(jié)合模式與dna甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)。我們根據(jù)這121個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)的基因組坐標(biāo)從ucsc數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了這121個(gè)位點(diǎn)的參考序列，然后設(shè)計(jì)用hrm法進(jìn)行dna甲基化檢測(cè)的pcr引物。

4、高分辨率溶解曲線法（hrm）進(jìn)行dna甲基化分析

本實(shí)施例首先用hrm法在66個(gè)樣本（33個(gè)腫瘤組織樣本及其對(duì)應(yīng)的正常組織樣本，其中33個(gè)腫瘤組織包括6個(gè)腺瘤，9個(gè)i期腫瘤，10個(gè)ii期腫瘤和8個(gè)iii期腫瘤）中對(duì)121個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)的dna甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，以期找出dna甲基化狀態(tài)在腫瘤組織中具有特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)，也就是那些dna甲基化狀態(tài)能夠?qū)⒄＝M織和腫瘤組織區(qū)分開的位點(diǎn)。首先，我們下載了所篩選出的121個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)的基因組序列（每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是135bp），同時(shí)根據(jù)在線的ctcf結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)ctcfbsdb2.0(http://insμlatordb.uthsc.edu/)預(yù)測(cè)每條序列上ctcf最可能的結(jié)合位置，然后根據(jù)預(yù)測(cè)出的ctcf結(jié)合位置設(shè)計(jì)出每個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)的hrm引物，hrm引物的擴(kuò)增區(qū)域必須包含ctcf的結(jié)合位置。pcr擴(kuò)增和hrm分析所使用的儀器是abisteponeplusreal-timepcr系統(tǒng)(appliedbiosystems,usa)。所使用的試劑是abi公司的meltdoctor?hrmmastermix(appliedbiosystems,usa)；所有操作都是根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明來完成；hrmpcr反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如表2和表3所示：

表2hrmpcr擴(kuò)增反應(yīng)體系

;

表3hrmpcr擴(kuò)增和分析程序

;

每次實(shí)驗(yàn)都會(huì)用已知甲基化比例的標(biāo)準(zhǔn)品（epitectcontroldna，qiagen公司）做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷腫瘤樣本和正常樣本的甲基化水平；所得到的hrm數(shù)據(jù)使用abi公司的high-resolutionmeltingsoftware(appliedbiosystems，usa)軟件進(jìn)行分析。

所檢測(cè)的121個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)中，共發(fā)現(xiàn)23個(gè)位點(diǎn)的dna甲基化狀態(tài)具有較好的腫瘤特異性（見表4，表中n代表不具有腫瘤特異性，空格代表具有腫瘤特異性），其中16個(gè)位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著高于正常組織（表4，t>n），7個(gè)位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著低于正常組織（表4，t<n），23個(gè)位點(diǎn)在33個(gè)腫瘤患者中的腫瘤特異性為64%-94%。

表4hrm篩選結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

5、dna質(zhì)譜進(jìn)行dna甲基化分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證由hrm法所篩選出來的23個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)在腫瘤組織中的特異性，并準(zhǔn)確定量每個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)中不同cpg位點(diǎn)的甲基化比例以及每個(gè)cpg位點(diǎn)在腫瘤組織和正常組織中dna甲基化水平的具體差異，從而找出最適合作為結(jié)直腸腫瘤早期診斷的ctcf結(jié)合位點(diǎn)，我們首先在40個(gè)樣本中（20個(gè)腫瘤組織樣本及其對(duì)應(yīng)的正常組織樣本，其中20個(gè)腫瘤組織包括7個(gè)腺瘤、6個(gè)ⅰ期腫瘤和7個(gè)ⅱ期腫瘤）用sequenommassarrayepityper平臺(tái)的dna質(zhì)譜方法檢測(cè)了由hrm方法所篩選出的23個(gè)在腫瘤組織中具有特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)的dna甲基化水平。所用的引物是用sequenom公司的在線引物設(shè)計(jì)軟件sequenomepidesigner所設(shè)計(jì)的，每條反向引物都包含t7rna聚合酶的啟動(dòng)子序列。質(zhì)譜dna甲基化檢測(cè)采用的是堿基特異的剪切和質(zhì)譜分析相結(jié)合來檢測(cè)包含一個(gè)或者多個(gè)cpg位點(diǎn)的dna片段的甲基化水平。

具體操作步驟簡(jiǎn)述如下：

步驟1、使用亞硫酸氫鹽，將樣本dna中沒有甲基化的c全部轉(zhuǎn)化為u（相當(dāng)于dna中的t）；

步驟2、使用特殊設(shè)計(jì)的一對(duì)引物擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過的dna樣本，得到帶有t7rna聚合酶啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；

步驟3、在體外轉(zhuǎn)錄體系中，利用t7rna聚合酶，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為rna片斷；

步驟4、在步驟3的體系中，利用rnasea能夠特異性識(shí)別并切割rna中u3’端的特性，將rna片斷切割成攜帶有cpg位點(diǎn)的小片斷（cpg單元）；

步驟5、使用sequenommassarrayepityper平臺(tái)的飛行質(zhì)譜分析系統(tǒng)檢測(cè)步驟4的產(chǎn)物；由于同一片斷中，只有cpg和cpa之間16da的分子量差別，即質(zhì)譜圖中兩者峰的差距；所得到的甲基化質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用sequenom公司的typer4.0軟件進(jìn)行分析，從而得到目標(biāo)dna片段中每個(gè)cpg單元的甲基化百分比。對(duì)于包含多個(gè)cpg單元的ctcf結(jié)合位點(diǎn)，我們將選擇統(tǒng)計(jì)分析中auc值最高的cpg單元的甲基化百分比作為該位點(diǎn)的甲基化百分比。

為了保證數(shù)據(jù)的可靠性，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過了嚴(yán)格的質(zhì)控選擇。簡(jiǎn)單地說，如果一個(gè)cpg分析單元有大于30%的樣本沒有被成功檢測(cè)，這個(gè)cpg分析單元的數(shù)據(jù)將會(huì)被排除。如果一個(gè)樣本的一個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)中有大于30%的cpg位點(diǎn)沒有被成功檢測(cè)，這個(gè)樣本的在該ctcf結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)據(jù)也將會(huì)被排除。

dna質(zhì)譜的檢測(cè)結(jié)果顯示，在23個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)中，其中16個(gè)位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著高于正常組織，7個(gè)位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著低于正常組織，這個(gè)結(jié)果與hrm檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了用hrm法檢測(cè)dna甲基化的可靠性。

為了判斷這23個(gè)腫瘤特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)能否將腫瘤組織和正常組織區(qū)分開，本研究用這23個(gè)位點(diǎn)在40個(gè)樣本中的甲基化百分比做了分層聚類分析（圖1）。從圖中可以看出，40個(gè)樣本通過分層聚類聚為了兩枝：n和t。n枝包含22個(gè)樣本，其中20個(gè)為正常組織（91%），2個(gè)為腫瘤組織（9%）；t枝包含18個(gè)樣本，全部都是腫瘤組織（100%）；也就是說根據(jù)這23個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)可以很好的將腫瘤組織和正常組織區(qū)分開。

為了區(qū)分這23個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織中的表現(xiàn)，進(jìn)一步篩選出最適合作為結(jié)直腸腫瘤早期診斷分子標(biāo)記的位點(diǎn)，我們分析了每個(gè)位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織上的貢獻(xiàn)（表5）。由下表可以看出，23個(gè)位點(diǎn)中，有19個(gè)位點(diǎn)的auc>0.8，說明這些位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織中的表現(xiàn)都很好。綜合考慮這23個(gè)位點(diǎn)的auc值，以及它們的甲基化百分比在腫瘤組織和正常組織之間的差異大小，我們從中選擇了10個(gè)位點(diǎn)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中作進(jìn)一步篩選（下表中用粗體標(biāo)出的位點(diǎn)）。

表523個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)準(zhǔn)確性比較

。

實(shí)施例2：擴(kuò)大樣本量對(duì)10個(gè)位點(diǎn)做進(jìn)一步篩選

為了提高所篩選出的分子標(biāo)記在檢測(cè)結(jié)直腸腺瘤上的特異性和敏感度，我們又增加了50個(gè)結(jié)直腸腺瘤樣本對(duì)實(shí)施例1所篩選出的10個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)做進(jìn)一步篩選；加上實(shí)施例1中40個(gè)樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，這一步篩選總共包含90個(gè)樣本，其中20個(gè)為正常對(duì)照、57個(gè)為腺瘤、6個(gè)為ⅰ期腫瘤和7個(gè)為ⅱ期腫瘤。表6顯示了這10個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織中的表現(xiàn)。從表6可以看出，這10個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)都具有很強(qiáng)的區(qū)分腫瘤組織和正常組織的能力（auc≥0.85）。在特異性為95%的前提下，它們的敏感度在44.64%-88.89%之間。我們的目標(biāo)是建立一種在保證檢測(cè)準(zhǔn)確性的前提下包含盡可能少的分子標(biāo)記的結(jié)直腸腫瘤早期診斷技術(shù)，因?yàn)橹挥羞@樣才能保證檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)性和準(zhǔn)確性。

因此，根據(jù)這10個(gè)位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織中的表現(xiàn)（表6中的auc值），我們選擇了5個(gè)區(qū)分能力最強(qiáng)的ctcf結(jié)合位點(diǎn)作為最優(yōu)的分子標(biāo)記（表6中粗體表示的位點(diǎn)），下一步我們將在大樣本中驗(yàn)證這5個(gè)分子標(biāo)記在對(duì)結(jié)直腸腫瘤進(jìn)行早期診斷中的準(zhǔn)確性。這5個(gè)位點(diǎn)中，有4個(gè)位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著高于正常組織。每個(gè)位點(diǎn)都具有很強(qiáng)的區(qū)分腫瘤組織和正常組織的能力（auc≥0.916），在特異性為95%的前提下，它們的敏感度在73.08%-88.89%之間。其中，ctcf_13是本申請(qǐng)要保護(hù)的結(jié)合位點(diǎn)，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

表610個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)準(zhǔn)確性比較

。

實(shí)施例3：在大樣本中驗(yàn)證本申請(qǐng)的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的檢測(cè)準(zhǔn)確性

為了驗(yàn)證本申請(qǐng)要保護(hù)的結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的檢測(cè)準(zhǔn)確性，我們選取了379例結(jié)直腸樣本（表1），其中正常樣本84例，腫瘤樣本295例（腺瘤108例，ⅰ期腫瘤39例，ⅱ期腫瘤101例和ⅲ期腫瘤47例），繼續(xù)用dna質(zhì)譜法檢測(cè)了該結(jié)合位點(diǎn)在379例結(jié)直腸樣本中的dna甲基化水平，檢測(cè)方法同實(shí)施例1中“dna質(zhì)譜進(jìn)行dna甲基化分析”內(nèi)容相同，采用如seqidno:2和seqidno:3所示的引物對(duì)。

根據(jù)dna質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，我們分別統(tǒng)計(jì)分析了ctcf_13在檢測(cè)腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤和所有腫瘤的auc值和特異性為95%時(shí)的敏感度。結(jié)果顯示，無論是檢測(cè)腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤還是所有腫瘤，ctcf_13都具有很強(qiáng)的區(qū)分腫瘤組織和正常組織的能力（auc值分別為0.93、1、0.97、0.98和0.95），而且所有分析都具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.0001）。在特異性為95%的前提下，ctcf_13檢測(cè)腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤和所有腫瘤的敏感度分別為79.79%、96.84%、88.06%、87.66%和87.14%。也就是說，ctcf_13檢測(cè)ⅰ期結(jié)直腸腫瘤的準(zhǔn)確性最高（特異性為95%的前提下敏感度為96.84%）。而且，在特異性為95%的前提下，它在檢測(cè)ⅰ期結(jié)直腸癌、ⅱ期結(jié)直腸癌、ⅲ期結(jié)直腸癌和所有結(jié)直腸腫瘤中的敏感度都大于87%，雖然檢測(cè)腺瘤的敏感度最低，但是也達(dá)到了79.79%。說明這個(gè)位點(diǎn)對(duì)于所有結(jié)直腸腫瘤的早期診斷都具有很高的準(zhǔn)確性。

實(shí)施例4：本申請(qǐng)的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與其他ctcf結(jié)合位點(diǎn)聯(lián)合使用的檢測(cè)準(zhǔn)確性

為了確定通過實(shí)施例1和實(shí)施例2所篩選出的5個(gè)最優(yōu)ctcf結(jié)合位點(diǎn)聯(lián)合使用是否能夠提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，我們同時(shí)在大樣本中用dna質(zhì)譜法檢測(cè)了ctcf_33、ctcf_55、ctcf_94和ctcf_113的dna甲基化水平。所用的樣本和檢測(cè)方法同實(shí)施例3。

我們分別將5個(gè)位點(diǎn)中任意1個(gè)或1個(gè)以上、任意2個(gè)或2個(gè)以上、任意3個(gè)或3個(gè)以上、任意4個(gè)或4個(gè)以上或者全部5個(gè)位點(diǎn)為陽(yáng)性作為腫瘤陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，并分別分析了它們檢測(cè)腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤和所有腫瘤的特異性和敏感度，最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)以5個(gè)位點(diǎn)中任意2個(gè)或2個(gè)以上為陽(yáng)性作為腫瘤陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可以顯著提高檢測(cè)準(zhǔn)確性（表7）。在特異性為94.05%時(shí)，檢測(cè)腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤和所有腫瘤的敏感度分別為91.67%、97.44%、94.06%、93.62%和93.54%。

表7ctcf_13與其他4個(gè)ctcf結(jié)合位點(diǎn)聯(lián)合使用的檢測(cè)準(zhǔn)確性

。

實(shí)施例5：本申請(qǐng)的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與已報(bào)道的分子標(biāo)記的檢測(cè)準(zhǔn)確性比較

為了比較本申請(qǐng)的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與已報(bào)道的最優(yōu)分子標(biāo)記bmp3和ndrg4的檢測(cè)準(zhǔn)確性，本實(shí)施例在120例樣本中檢測(cè)了ctcf_13以及bmp3和ndrg4的啟動(dòng)子區(qū)dna甲基化水平。這120例樣本包括58個(gè)正常組織、46個(gè)腺瘤、4個(gè)i期腫瘤、8個(gè)ii期腫瘤和4個(gè)iii期腫瘤。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，我們分別計(jì)算出ctcf_13、bmp3和ndrg4的auc以及特異性為90%時(shí)的敏感度（表8）。由表8可以看出，本申請(qǐng)的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13在特異性為90%時(shí)的敏感度為81.64%，而bmp3和ndrg4在特異性為90%時(shí)的敏感度分別為48.56%和69.56%。也就是說，本申請(qǐng)的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13在檢測(cè)中國(guó)人群結(jié)直腸腫瘤上的準(zhǔn)確性要顯著高于已報(bào)道的最優(yōu)分子標(biāo)記bmp3和ndrg4；

表8ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與已報(bào)道最優(yōu)分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性比較

。

序列表

<110>昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120>多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的應(yīng)用

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>180

<212>dna

<213>人

<400>1

gattgtccttgagatgggactgcaatagaaatccgggcagcccgaagaggcacccagcgc60

tccagccaccagctgggccgcccgggagtccctggctctagaccagccgcgaggaggcgc120

cgcgagagagctggtccctgcccgcggccggaggagggctagagcccctgggccagcccc180

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aggaagagaggattgtttttgagatgggattgtaa35

<210>3

<211>56

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cagtaatacgactcactatagggagaaggctaaaactaacccaaaaactctaaccc56

<210>4

<211>156

<212>dna

<213>人

<400>4

ttgaggccagggctcttacctagagcatttgtagttcccagcccggagaagggttctcag60

aagcgaaaattccactgaagacaggttaagtggaagaggcatctttgaacagctgtagga120

ctgggtgctgggctggtagaatgacagcagattcag156

<210>5

<211>232

<212>dna

<213>人

<400>5

ttgtctggctcctggccctgggcgtggcgcgcgtggcgctggcgagggtcccggcagggg60

gcgctactgctcggtcagtgagagcctcaggatgcgctccagctcctcctcctcctggcg120

cgcgcgccgccgcctctcctcctgctcctgcgccgacagttccatcgccagccgcagctg180

ctcgtcgtagctccggaacacgtggccgccggaacctggccctgagctgggc232

<210>6

<211>227

<212>dna

<213>人

<400>6

aactgacaaaggatgggagaatgcccgcgccccgggatgccggccgcacgcagcctggcg60

gccgcctgagctacttcaccctccgccggtaagtgactgcaaacatcattcattcaatca120

gcctcactgggagccccttctctccggctggtagtcctgggcggcttgtccctgatcccg180

agcggggcttggcacagcatcagccctggagggcaggcagcaggtgc227

<210>7

<211>296

<212>dna

<213>人

<400>7

gcccagaggagaaaggaacctctgcctcgaatttccccactgcgccgggcgctgcggaga60

gcggcgagggtgggcgcgaggcggagaacgcgatgaatgagttctcccctcgcctcggag120

ttgtctgagttggcggcgctgcgcccaggcttccggctctcagcgccccacgcgcgcgtg180

gctccccgggctgccacccacgcccgcggccggggccgagccagccacgcagggcagccg240

aggctccggagctcctgtcccggccccagtccgggtaaaaggagggttgtccccag296