本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌以及利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)5-羥色氨酸的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：5-羥色氨酸(5-htp)是人體內(nèi)激素serotonin的前驅(qū)物質(zhì)，有鎮(zhèn)靜作用，可以幫助人體內(nèi)這種激素的生產(chǎn)，使自己體內(nèi)達(dá)到平衡。5-htp是色氨酸、5-羥色胺(復(fù)合胺)的反應(yīng)媒介，也就是說(shuō)，5-羥色氨酸是重要的抑制神經(jīng)傳遞素復(fù)合胺(5-ht)的前體。在腦部、血小板、腸胃、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有復(fù)合胺。在情緒變化時(shí)，會(huì)相應(yīng)分泌復(fù)合胺，它是腦部控制情緒、行為、胃口、睡眠、沖動(dòng)的重要化學(xué)物質(zhì)。5-羥色氨酸能有效幫助產(chǎn)生復(fù)合胺，因此可促進(jìn)情緒、神經(jīng)系統(tǒng)的健康。研究表明，5-羥色氨酸可抑制食欲，減少脂肪攝取，減少焦慮，控制情緒，促進(jìn)睡眠。目前國(guó)內(nèi)可穩(wěn)定生產(chǎn)的有優(yōu)速達(dá)生物，產(chǎn)品質(zhì)量已經(jīng)得到歐美等國(guó)家的認(rèn)可。5-htp作為食品成分是天然提取來(lái)自于griffoniasimplicifolia，一個(gè)西非藥物植物的種子中得到的。5-羥色氨酸是一個(gè)自然氨基的酸性物質(zhì)，在許多飲食所含的蛋白質(zhì)中可以找到。5-羥色氨酸是處方藥-百憂解(prozac)的天然替代品。正如百憂解一樣，5-羥色氨酸可增強(qiáng)5-羥色胺的活動(dòng)力。5-羥色胺是腦部分泌的一種激素，會(huì)影響我們的情緒、睡眠和食欲，造成腦中的血清素不平衡時(shí)需5-羥色氨酸來(lái)維持身體處于正常狀態(tài)。因此含量太低則容易憂郁、焦慮及睡眠失調(diào)。百憂解這類的藥物，可防腦細(xì)胞太快耗盡血清素，而導(dǎo)致5-羥色胺不足。而5-羥色氨酸的功效稍有不同：它可增加腦細(xì)胞的血清素制造量，進(jìn)而提升5-羥色胺的含量。5-羥色氨酸在人體中會(huì)制造出血清素，對(duì)于正常的神經(jīng)的重要物質(zhì)和腦的功能有幫助。血清素可以幫助睡眠，也可有效的控制疼痛。因此5-羥色氨酸也成功地被拿來(lái)治療睡眠失調(diào)。由于血清素是褪黑激素(一種調(diào)節(jié)睡眠和清醒周期的天然荷爾蒙)的前身，因此當(dāng)血清素的含量提高時(shí)，褪黑激素的含量也就增加。既然5-羥色氨酸和ssri的作用類似，何不服用后者就好。原因之一是抗憂郁處方藥貴；二是處方藥常會(huì)引起一些不良的副作用，包括口干、焦慮及喪失性欲。此外，使用5-htp能幫助抑制食欲，它能使人體所攝取的碳水化合物更少且更快感到飽足，每天攝取750毫克的5-htp可以減少碳水化合物的吸收，并且不使體重增加，進(jìn)而達(dá)到減輕體重的效果。5-羥色氨酸的臨床應(yīng)用：1、抗憂郁、鎮(zhèn)定劑：5-htp可增加腦細(xì)胞的血清素制造量，進(jìn)而提升5-羥色胺的含量。5-羥色氨酸在人體中會(huì)制造出血清素，對(duì)于正常的神經(jīng)的重要物質(zhì)和腦的功能有幫助。血清素可以幫助睡眠，也可有效的控制疼痛，可以治療憂郁癥；2、減緩壓力和改善睡眠方面：當(dāng)血清素的含量提高時(shí)，褪黑激素的含量也就增加，使得睡眠更為香甜；3、減肥：可以有效控制食欲，提高飽食中樞的敏感性，在減肥過(guò)程的飲食控制中，降低饑餓感，使減肥過(guò)程更輕松容易達(dá)成，是當(dāng)前流行的減肥食品輔助劑。對(duì)想減肥的人是一大福音；4、其他：除具有傳統(tǒng)的醫(yī)藥功能和抗憂郁癥外，還具有減肥、戒癮、改善睡眠、緩和經(jīng)前綜合癥，治療偏頭疼等功能；5-羥色氨酸現(xiàn)已被歐美各大保健品公司廣泛應(yīng)用。用于通過(guò)自然地提高血清素的水平，增加人體血液中復(fù)合胺的生成。目前，5-羥色氨酸的制備主要由植物來(lái)源，提取于非洲的植物加納種子。但產(chǎn)量受資源限制，并且提取成本高。顯然，微生物轉(zhuǎn)化和發(fā)酵法生產(chǎn)是一條良好的途徑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種芽孢桿菌以及利用該芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)5-羥色氨酸的方法。一種生產(chǎn)5-羥色氨酸的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)jsc-137，其已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為cgmccno：13534，保藏日期為2017年01月05日。所述枯草芽孢桿菌jsc-137的鑒定：(1)菌體的形態(tài)特征：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)菌0.7×2.5微米，著色均勻。無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性菌，需氧菌。芽孢0.9×1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色。菌落表面有褶皺，菌落較大，中央突起。在液體基質(zhì)中呈均勻混濁，不形成菌膜和菌環(huán)。(2)菌體的生理生化鑒定：將枯草芽孢桿菌jsc-137(bacillussubtilisjsc-137)進(jìn)行生理生化性狀檢測(cè)，結(jié)果：該菌株專性好氧?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能分解阿拉伯糖、甘露醇、酪素、明膠、淀粉。過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、v-p實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn)、卵黃卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)陰性。本發(fā)明進(jìn)一步提供應(yīng)用所述的枯草芽孢桿菌jsc-137生產(chǎn)5-羥色氨酸的方法，該方法具體包括如下步驟：步驟a，對(duì)枯草芽孢桿菌jsc-137進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；步驟b，用步驟a擴(kuò)大培養(yǎng)獲得到的枯草芽孢桿菌jsc-137轉(zhuǎn)化色氨酸；和步驟c，收集5-羥色氨酸。進(jìn)一步，步驟a所述擴(kuò)大培養(yǎng)包括斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)中的任意一種或幾種的組合。所述擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程所用培養(yǎng)基是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基還可包括適宜的鹽、礦物質(zhì)、金屬和其他營(yíng)養(yǎng)成分；所述碳源選自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖漿和糖蜜中的一種或多種；氮源選自氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀中的一種或多種。其中，所述搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)階段所用培養(yǎng)基是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基還可包括適宜的鹽、礦物質(zhì)、金屬和其他營(yíng)養(yǎng)成分；所述碳源選自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖漿和糖蜜中的一種或多種；氮源選自氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀中的一種或多種。優(yōu)選所述培養(yǎng)基組分包括胰蛋白胨、牛肉浸膏、氯化鈉；進(jìn)一步優(yōu)選所述種子培養(yǎng)基組成為：15.0g/l胰蛋白胨、4.0g/l牛肉浸膏、15.0g/l氯化鈉；初始ph7.0。所述發(fā)酵罐培養(yǎng)階段所用發(fā)酵培養(yǎng)基是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基還可包括適宜的鹽、礦物質(zhì)、金屬和其他營(yíng)養(yǎng)成分；所述碳源選自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖漿和糖蜜中的一種或多種；氮源選自氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀中的一種或多種。優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分包括葡萄糖、酵母膏、mgso4·7h2o，feso4·7h2o，kh2po4，k2hpo4，znso4；進(jìn)一步優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10g/l，酵母膏3.0g/l，mgso4·7h2o0.6g/l，feso4·7h2o0.01g/l，kh2po40.4g/l，k2hpo40.6g/l，znso40.001g/l，初始ph6.5～7.0。進(jìn)一步，步驟a所述擴(kuò)大培養(yǎng)條件為：溫度25-45℃，ph6.5-7.0，時(shí)間20-50小時(shí)。其中，所述搖瓶和種子罐培養(yǎng)階段培養(yǎng)條件為：溫度25-45℃，ph6.5-7.0，時(shí)間20-30小時(shí)。所述發(fā)酵罐培養(yǎng)階段培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度30-35℃，ph6.5-7.0，發(fā)酵時(shí)間30-50小時(shí)。優(yōu)選，發(fā)酵溫度31℃；ph6.8；發(fā)酵時(shí)間40h。進(jìn)一步，步驟b所述色氨酸濃度為0.2-10g/l；轉(zhuǎn)化條件為：25-45℃下轉(zhuǎn)化40-60小時(shí)，ph為6-8。進(jìn)一步，步驟c所述“收集5-羥色氨酸”包括如下方法：對(duì)步驟b得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行離心處理，取上清液部分即為產(chǎn)物5-羥色氨酸。進(jìn)一步，本發(fā)明方法還包括：步驟d，對(duì)產(chǎn)物5-羥色氨酸進(jìn)行純化。所述“純化”過(guò)程依次包括固液分離、陽(yáng)離子交換樹脂吸附分離、濃縮、乙醇溶解、蒸餾的步驟。本發(fā)明所述“擴(kuò)大培養(yǎng)”以菌種擴(kuò)增為目的，將處于休眠狀態(tài)的菌種活化后，再經(jīng)過(guò)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌種的過(guò)程。所述擴(kuò)大培養(yǎng)的一般過(guò)程為：斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐逐級(jí)培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)，在實(shí)際操作中，種子罐培養(yǎng)級(jí)數(shù)可按照發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量等因素而確定。本發(fā)明所述“底物”是指待轉(zhuǎn)化的反應(yīng)物，所述“轉(zhuǎn)化”是指利用微生物，在適宜的條件下，將待轉(zhuǎn)化的反應(yīng)物經(jīng)過(guò)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為人類所需要的產(chǎn)物的過(guò)程。本發(fā)明以“色氨酸”為底物，經(jīng)過(guò)特定菌種地衣芽孢桿菌jsc-137的轉(zhuǎn)化，得到終產(chǎn)物“5-羥色氨酸”。本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌jsc-137(bacillussubtilisjsc-137)，與一般的芽孢桿菌相比，具有更廣泛的發(fā)酵溫度(30℃～37℃)，可以利用復(fù)雜氮源，短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)達(dá)到較高的生物量，可生物轉(zhuǎn)化色氨酸生產(chǎn)5-羥色氨酸。通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，枯草芽孢桿菌jsc-137以色氨酸為底物生產(chǎn)5-羥色氨酸，轉(zhuǎn)化效率達(dá)85％～90％，可將轉(zhuǎn)化液經(jīng)進(jìn)一步純化及能得到高純度的5-羥色氨酸。具體實(shí)施方式實(shí)施例1菌株篩選平板篩選培養(yǎng)基：牛肉膏5g/l，大豆蛋白胨10g/l，nacl5g/l，15g/l瓊脂。篩選時(shí)所用液體培養(yǎng)基：蔗糖20g/l，豆粕20g/l，(nh4)2so43g/l，k2hpo4·3h2o5g/l，kh2po41g/l，牛肉膏2g/l，大豆蛋白胨4g/l，nacl5g/l，色氨酸8g/l；ph值7.0。從南京及周邊地區(qū)共采集100多份土樣或水樣，并制成適當(dāng)濃度的稀釋液，直接涂布于篩選培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)1天，分別挑取不同形態(tài)的單菌落接種于裝有液體培養(yǎng)基的試管，30℃、200rpm震蕩培養(yǎng)2天，離心取發(fā)酵上清液。測(cè)定上清中5-羥色氨酸含量。從500多個(gè)菌落中檢測(cè)到4株可以產(chǎn)生5-羥色氨酸。取初篩得到的菌株分別接種于裝有5ml種子培養(yǎng)基的試管中，30℃震蕩培養(yǎng)2天。然后轉(zhuǎn)接到裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，30℃、200rpm發(fā)酵2天。用hplc法精確測(cè)定發(fā)酵上清中5-羥色氨酸的含量。結(jié)果見表1。表1部分篩菌株的產(chǎn)5-羥色氨酸情況菌株編號(hào)5-羥色氨酸的含量(g/l)jsc-241.2jsc-697.7jsc-1376.8jsc-4030.4結(jié)果表明，菌株jsc-69和jsc-137發(fā)酵液中5-羥色氨酸含量明顯高于另外兩種菌株。實(shí)施例2菌株jsc-137的鑒定對(duì)jsc-137按《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(第二版，2004)進(jìn)行形態(tài)特征及生理生化特征的鑒定。在平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)1天，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色。菌落表面有褶皺，菌落較大，中央突起。在液體基質(zhì)中呈均勻混濁，不形成菌膜和菌環(huán)。單個(gè)細(xì)菌0.7×2.5微米，著色均勻。無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性菌，需氧菌。芽孢0.9×1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。將jsc-137進(jìn)行生理生化性狀檢測(cè)，結(jié)果：該菌株專性好氧?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能分解阿拉伯糖、甘露醇、酪素、明膠、淀粉。過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、v-p實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn)、卵黃卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)陰性。基于形態(tài)特征、生理生化特性分析，認(rèn)為jsc-137屬于bacillussubtilis新菌株，以命名為bacillussubtilisjsc-137。此菌株已于2017年01月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為cgmccno：13534。實(shí)施例3菌株jsc-137的發(fā)酵培養(yǎng)與目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化1、擴(kuò)大培養(yǎng)(1)一級(jí)種子培養(yǎng)：將一環(huán)生長(zhǎng)良好的所述枯草芽孢桿菌jsc-137斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，在30℃、225rpm條件下震蕩培養(yǎng)25小時(shí)。種子培養(yǎng)基組成為：15.0g/l胰蛋白胨、4.0g/l牛肉浸膏、15.0g/l氯化鈉。初始ph7.0。(2)二級(jí)種子培養(yǎng)：取6ml一級(jí)種子培養(yǎng)液，接種于含200ml的二級(jí)種子培養(yǎng)液的1000ml搖瓶中，30℃、225rpm培養(yǎng)約24小時(shí)。至od600值為8.0-9.0。二級(jí)種子培養(yǎng)液基成分：種子培養(yǎng)基組成為：15.0g/l胰蛋白胨、4.0g/l牛肉浸膏、15.0g/l氯化鈉。初始ph7.0。(3)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)1)發(fā)酵培養(yǎng)基成分：葡萄糖10g/l，酵母膏3.0g/l，mgso4·7h2o0.6g/l，feso4·7h2o0.01g/l，kh2po40.4g/l，k2hpo40.6g/l，znso40.001g/l。初始ph6.5～7.0。2)主要技術(shù)參數(shù)及優(yōu)化篩選基本技術(shù)參數(shù)：接種量1％；發(fā)酵溫度31℃；ph6.7；發(fā)酵時(shí)間40h。在此基本技術(shù)參數(shù)基礎(chǔ)上，進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，對(duì)接種量、發(fā)酵溫度、ph、發(fā)酵時(shí)間等因素分別進(jìn)行了優(yōu)化篩選。搖瓶試驗(yàn)方法：取菌株接種于裝有5ml種子培養(yǎng)基的試管中，30℃震蕩培養(yǎng)2天。然后轉(zhuǎn)接到裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入8g/l色氨酸底物。用hplc法精確測(cè)定發(fā)酵上清中5-羥色氨酸的含量。a)接種量的影響考察了不同接種量對(duì)5-羥色氨酸催化合成的影響。其它技術(shù)參數(shù)條件：發(fā)酵溫度31℃；ph6.7；發(fā)酵時(shí)間40h。結(jié)果見表2。表2不同接種量對(duì)5-羥色氨酸催化合成的影響接種量(％)5-羥色氨酸的含量(g/l)0.57.31.07.51.57.72.07.62.57.6從表2可以看出，接種量過(guò)低(0.5％)，或過(guò)高(2.5％)對(duì)色氨酸催化合成5-羥色氨酸均不利，以1.5％接種量為佳?？赡芙臃N量過(guò)低，不利于菌體生長(zhǎng)；接種量過(guò)高，菌體生長(zhǎng)過(guò)快容易衰老進(jìn)而催化效果。b)發(fā)酵溫度的影響考察了不同發(fā)酵溫度對(duì)5-羥色氨酸催化合成的影響。其它技術(shù)參數(shù)條件：接種量1.5％；ph6.7；發(fā)酵時(shí)間40h。結(jié)果見表3。表3不同發(fā)酵溫度對(duì)5-羥色氨酸催化合成的影響發(fā)酵溫度(℃)5-羥色氨酸的含量(g/l)307.5317.7327.6337.6347.5357.3從表3可以看出，發(fā)酵溫度對(duì)色氨酸催化合成5-羥色氨酸有一定的影響，31℃以下較31℃催化效果差，但31℃以上也較31℃催化效果差，而且隨溫度升高，效果越來(lái)越差。以31℃發(fā)酵最佳。c)ph的影響考察了不同ph對(duì)5-羥色氨酸催化合成的影響。其它技術(shù)參數(shù)條件：接種量1.0％；發(fā)酵溫度32℃；發(fā)酵時(shí)間40h。結(jié)果見表4。表4不同ph對(duì)5-羥色氨酸催化合成的影響ph5-羥色氨酸的含量(g/l)6.57.16.67.26.77.46.87.86.97.77.07.3從表4可以看出，ph對(duì)色氨酸催化合成5-羥色氨酸有一定的影響，ph6.8以下或ph6.8以上均較ph6.8催化效果差，以ph6.8發(fā)酵時(shí)催化效果最佳。d)發(fā)酵時(shí)間的影響考察了不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)5-羥色氨酸催化合成的影響。其它技術(shù)參數(shù)條件：接種量1.0％；發(fā)酵溫度32℃；ph6.8。結(jié)果見表5。表5不同ph對(duì)5-羥色氨酸催化合成的影響發(fā)酵時(shí)間(h)5-羥色氨酸的含量(g/l)306.5357.2407.8457.8507.8557.8從表5可以看出，不同發(fā)酵時(shí)間下色氨酸催化合成5-羥色氨酸有一定的差別，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，催化效果逐漸增加。但40h以后，催化效果已達(dá)到頂峰，之后不再增加。因此發(fā)酵時(shí)間以40h為佳。因此，經(jīng)優(yōu)化篩選，優(yōu)化后技術(shù)參數(shù)：接種量1.5％；發(fā)酵溫度31℃；ph6.8；發(fā)酵時(shí)間40h。3)工藝操作種子制備要求：菌種鑒定符合特性，無(wú)變異，無(wú)雜菌。培養(yǎng)基配置：按配方準(zhǔn)確稱量。蔗糖加適量水充分溶解；(nh4)2so4，k2hpo4·3h2o，kh2po4，加適量水充分溶解。消泡劑適量。發(fā)酵空罐滅菌：溫度121～130℃，保持流通蒸汽，罐壓0.09～0.15mpa，維持時(shí)間30分鐘。進(jìn)料加水：調(diào)整總體積。發(fā)酵實(shí)罐滅菌：溫度121℃，罐壓0.08～0.15mpa，通氣量0.8～1.0vvm，維持時(shí)間30分鐘，保持流通蒸汽；最后降溫至30℃。接種：溫度30℃，接種量1％。培養(yǎng)：溫度31℃，時(shí)間40小時(shí)，罐壓0.05～0.08mpa，ph6.8，do25％以上。芽孢形成率98％，培養(yǎng)終止，得到轉(zhuǎn)化用菌液，液體菌數(shù)≥2.0×109cfu/ml。降溫保壓。3、目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與生產(chǎn)(1)收集菌體細(xì)胞：取所述枯草芽孢桿菌jsc-137轉(zhuǎn)化用菌液在離心機(jī)上以4000r/min的轉(zhuǎn)速高心10min，收集菌體細(xì)胞沉淀。(2)轉(zhuǎn)化：將0.2m的磷酸鹽緩沖液(ph7.4)加到所述菌體細(xì)胞沉淀中，形成菌體濃度為3.0×107～8.0×107個(gè)/ml的菌懸液；然后加入濃度為8.0g/l的色氨酸，在31℃溫度下、通氣量為1.0l/min，以225r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行轉(zhuǎn)化，40h后，得到轉(zhuǎn)化液。所述0.2m的磷酸鹽緩沖液(ph7.4)的配制：將71.6gna2hpo4·12h2o溶于1000ml水，得到0.2mna2hpo4；然后將31.2gnah2po4·2h2o溶于1000ml水，得到0.2mnah2po4；最后，將19ml0.2m的nah2po4和81ml0.2m的na2hpo4混合均勻后即得。(3)固液分離：將所述轉(zhuǎn)化液在離心機(jī)上以4000r/min的轉(zhuǎn)速高心10min，得到含5-羥色氨酸上清液?？莶菅挎邨U菌jsc-137以色氨酸為底物的微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)5-羥色氨酸，24h轉(zhuǎn)化率達(dá)85％～90％。實(shí)施例4產(chǎn)物的純化與提取1、發(fā)酵液固液分離：采用離心或陶瓷膜分離法收集菌體。2、001×7陽(yáng)離子交換樹脂(732)吸附分離，氨水洗脫。經(jīng)篩選，001×7陽(yáng)離子交換樹脂吸附分離效果最佳，適合于99％規(guī)格5-羥色氨酸的規(guī)?；a(chǎn)。001×7樹脂吸附分離的條件為：在常溫下，上樣液5-羥色氨酸質(zhì)量濃度為10.8mg/ml，調(diào)ph為3.5，以4.0ml/min的上樣速度上樣，以3倍樹脂體積的7.0％氨水以3.0ml/min的洗脫速度進(jìn)行洗脫，洗脫液濃縮結(jié)晶后獲得的產(chǎn)品中5-羥色氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.0％，灰分小于1.0％。3、濃縮成固體將洗脫液進(jìn)行雙效或多效蒸發(fā)濃縮成固體。烘干去除水分。4、熱水溶解，高選擇性的樹脂吸附分離將濃縮固體用熱水溶解，進(jìn)一步用對(duì)5-羥色氨酸高度選擇性的樹脂吸附分離，去除雜質(zhì)。氨水洗脫后，濃縮，結(jié)晶。得高純度5-羥色氨酸。5、液相蒸餾，得固相為5-羥色氨酸。實(shí)施例5產(chǎn)物分析方法產(chǎn)物分析方法為hplc檢測(cè)方法。采用shimadzuc18反相柱，0.05％的三氯乙酸(tca)-甲醇(68.75∶31.25，v/v)為流動(dòng)相，對(duì)色氨酸和5-羥色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品進(jìn)行色譜測(cè)定。進(jìn)樣量：10μl，流動(dòng)相流速：1.5ml/min等梯度洗脫，紫外分光光度檢測(cè)器的波長(zhǎng)為275nm。所有溶液在使用前均用0.45μm濾膜過(guò)濾。用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)前第1頁(yè)12