本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中山杉是江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所從落羽杉×墨杉雜交組合中選育出來(lái)的優(yōu)良無(wú)性系，具有速生，耐水淹，耐鹽堿，抗病蟲(chóng)害等優(yōu)點(diǎn)。由于其突出的耐水淹能力，近年來(lái)已在云南滇池、安徽巢湖和三峽庫(kù)區(qū)等地區(qū)的濕地生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)建中發(fā)揮著重要作用。重慶萬(wàn)州三峽庫(kù)區(qū)消落帶的試驗(yàn)表明：經(jīng)過(guò)最長(zhǎng)149d基部淹水，最長(zhǎng)122d沒(méi)頂淹水，最大沒(méi)頂深度達(dá)12m，中山杉仍能獲得90%的造林保存率，樹(shù)木年平均胸徑和樹(shù)高生長(zhǎng)量分別達(dá)1.3cm/a和0.60m/a，因而中山杉可以作為一種研究木本耐水淹特性的優(yōu)良材料。前期關(guān)于植物耐水淹機(jī)制研究主要集中在草本模式植物擬南芥以及糧食作物水稻中，中山杉的耐水淹特性研究也主要集中在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方面，無(wú)法深入揭示其耐淹機(jī)理。因而挖掘出中山杉響應(yīng)水淹脅迫的關(guān)鍵基因?qū)τ谔骄科淠退吞匦约敖沂灸颈局参锬脱蜋C(jī)制均具有重要意義。

植物在水淹脅迫下可誘導(dǎo)糖酵解發(fā)生進(jìn)而適應(yīng)缺氧環(huán)境，整個(gè)過(guò)程既可以為植物體提供能量又可以減少低氧對(duì)植物毒害。因而糖酵解途徑相關(guān)的基因被廣泛分離、鑒定，其中乙醇脫氫酶編碼基因adh備受關(guān)注。水稻中過(guò)量表達(dá)adh1雖沒(méi)有對(duì)植株水淹耐受力產(chǎn)生明顯影響，但是adh1一旦突變或缺失，植物的厭氧耐受力就大大降低。玉米和擬南芥adh無(wú)效突變體以及水稻rda（低活性的adh）突變體內(nèi)發(fā)酵能力顯著降低，根細(xì)胞胞質(zhì)ph值迅速下降，突變體明顯早于野生型死亡。將水稻的adh1基因轉(zhuǎn)入煙草中，煙草轉(zhuǎn)基因植株耐淹能力顯著增強(qiáng)，且adh1酶的活性也隨淹水時(shí)間增加而升高。中山杉水淹脅迫的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果也顯示，水淹程度越高，adh基因的rpkm值也會(huì)隨之升高。綜上可知：adh基因?qū)τ诓荼局参镯憫?yīng)低氧脅迫發(fā)揮著重要的作用，而木本植物中研究較少，在中山杉中尚未有相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)在技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

含有所述的調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的載體。

所述的調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述的調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因在植物育種中的應(yīng)用。

所述的調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因在植物抗?jié)持械膽?yīng)用。

本發(fā)明以中山杉406葉片為材料，通過(guò)race技術(shù)克隆了中山杉thadh4。同時(shí)，采用通路克隆技術(shù)構(gòu)建其過(guò)量表達(dá)載體ph35gs-thadh4，該基因位于啟動(dòng)子p35s之后，在啟動(dòng)子p35s的驅(qū)動(dòng)下，thadh4在楊樹(shù)中高效表達(dá)，并伴隨著表型出現(xiàn)變異，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)速率加快，節(jié)間明顯變長(zhǎng)。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)將thadh4基因轉(zhuǎn)入木本模式植物楊樹(shù)中，過(guò)量表達(dá)thadh4的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)，生長(zhǎng)速率加快，節(jié)間明顯變長(zhǎng)，且水淹脅迫下，基因的表達(dá)量呈幾百倍上升。說(shuō)明thadh4基因是植物響應(yīng)水淹脅迫的重要基因，在林木基因工程領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是植物過(guò)表達(dá)載體ph35gs示意圖；

圖2是過(guò)量表達(dá)thadh4轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)與未轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)整體表型對(duì)比圖，圖中左為未轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)，圖中右為轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)；

圖3是過(guò)表達(dá)thadh4轉(zhuǎn)基因植株在水淹脅迫下的基因表達(dá)變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。

以下實(shí)施例中，未詳細(xì)敘述的操作均為常規(guī)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，可參照分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及現(xiàn)有公開(kāi)的期刊文獻(xiàn)等進(jìn)行。

實(shí)施例1通過(guò)race技術(shù)克隆thadh4基因

1）rna的提取及cdna的反轉(zhuǎn)

以中山杉406葉片為材料，使用rneasyplantminikit（qiagen公司），中山杉總rna的提取，由于葉片內(nèi)含有較多的酚類(lèi)化合物，對(duì)操作步驟進(jìn)行了改良。在進(jìn)行提取rna操作前，所有的槍頭，離心管，研缽均應(yīng)用0.1%depc水浸泡過(guò)夜，高壓滅菌40min后烘干。所有溶液均應(yīng)采用0.1%depc水配制。用nanodrop1000進(jìn)行總rna濃度和純度的測(cè)定。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總rna的分離，一個(gè)完整性較好的rna應(yīng)當(dāng)可以觀測(cè)到三條清晰的條帶，其中5.8srna稍暗，而28srna的條帶亮度約為18srna的兩倍左右，表明rna沒(méi)有被降解，后采用clontech公司的smarter?pcrcdnasynthesiskit，advantage?2pcrkit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2）thadh4基因目的片段的獲得

根據(jù)中山杉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選thadh4的unigene序列，使用oligo6設(shè)計(jì)特異性的引物擴(kuò)增thadh4基因的目的片段，其中，thadh4目的片段的正向引物為：5’-gaagtgatgagaagagcaggtt-3’，5’-aggcctggtataatacgttggtat-3’。pcr反應(yīng)體系：takaralataq(5u/μl)0.5μl，10×lapcrbuffer(mg²⁺free)5.0μl，mgcl2（25mm）5.0μl，dntpmixture（2.5mmeach）8.0μl，forwardprimer(10μm)2.0μl，reverseprimer(10μm)2.0μl，cdnatemplate1.0μl，milli-qwater26.5μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，35cycles；72℃10min；4℃forever。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得的thadh4基因目的片段序列如seqidno.3所示。

依據(jù)上述thadh4基因目的片段分別設(shè)計(jì)3’race和5’race擴(kuò)增，pcr篩選后進(jìn)行克隆測(cè)序，最后將獲得3’race片段及5’race片段進(jìn)行拼接。

3）3’race

3’race反轉(zhuǎn)錄：以總rna為模板，反應(yīng)體系如下：totalrna1μg（xμl），5×m-mlvbuffer2μl，dntpmixture（10mmeach）1μl，3'raceadaptor（5′-ctgatctagaggtaccggatcc-3′）（5μm）1μl，reversetranscriptasem-mlv(rnaseh)(200u/μl)0.25μl，rnaseinhibitor（40u/μl）0.25μl，rnasefreeh2o5.5-xμl，總體積10μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃10min；4℃forever。獲得3’racecdna4℃儲(chǔ)存，進(jìn)入下一個(gè)步驟。

3’race巢氏pcr：3’race巢氏pcr分為3’raceouterpcr和3’raceinnerpcr兩輪，在獲得10μl3'race反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后，可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)话闶窍♂尩?0μl用于后續(xù)反應(yīng)。

3'raceouterpcr是反應(yīng)體系如下：稀釋過(guò)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl，3'raceouterprimer（10μm）2μl，genespecificouterprimer（10μm）2μl，10×extaqbufferii（mg²⁺free）5μl，mgcl2（25mm）4μl，dntpmixture（10mmeach）4μl，extaqpolymerase0.3μl，ddh2o30.7μl，總體積50μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃10min；4℃forever。反應(yīng)產(chǎn)物取5μl稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用于innerpcr反應(yīng)，其余的用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

引物序列如下：thadh43'raceouterprimer：5'-taccgtcgttccactagtgattt-3'；genespecificouterprimer：5'-cctcaaagataataggaataga-3'。

3'raceinnerpcr是反應(yīng)體系如下：稀釋過(guò)的3'raceinnerpcr產(chǎn)物2μl，3'raceinnerprimer（10μm）2μl，genespecificouterprimer（10μm）2μl，10×extaqbufferii（mg²⁺free）5μl，mgcl2（25mm）4μl，dntpmixture（10mmeach）4μl，extaqpolymerase0.3μl，ddh2o30.7μl，總體積50μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，32cycles；72℃10min；4℃forever。

引物序列如下：thadh43'raceinnerprimer：5'-cagcttcgaatgcattggaaatacca-3'，genespecificinnerprimer：5'-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3'。

pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切取目的片段，利用切膠試劑盒回收后，連接于takara公司的pmd19-tsimplevector，轉(zhuǎn)化takara公司的top10大腸桿菌感受態(tài)，通過(guò)含有amp的lb篩選培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，將篩選出的單克隆菌落pcr檢測(cè)后送至金斯瑞公司測(cè)序鑒定。

4）5’race

5’race反轉(zhuǎn)錄：去磷酸化反應(yīng)是5’race的第一步反應(yīng)，由alkalinephosphatase催化完成的。反應(yīng)體系如下：totalrna2-5μg（xμl），10×alkalinephosphatasebuffer（mgcl2free）5μl，alkalinephosphatase（calfintestine）（16u/μl）0.6μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，rnasefreedh2o43.4-xμl，總體積50μl。50℃反應(yīng)1h，向上述反應(yīng)液加入20μl的3mch3coona（ph5.2），130μl的rnasefreedh2o后充分混勻，加入200μl的酚：氯仿：異戊醇，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，加入200μl的氯仿，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，加入2μl的nacarrier后均勻混合，再加入200μl的異丙醇，充分混勻后，-40℃放置2h以上，4℃13000g離心20min，棄上清，加入500μl的75%的預(yù)冷乙醇漂洗，4℃，13000g離心5min，棄上清后干燥，加入7μl的depc水溶解沉淀，得到ciap-treatedrna。

5’race的第二步反應(yīng)是去帽子反應(yīng)，用tobaccoacidpyrophosphatase去掉mrna的5’帽子結(jié)構(gòu)，并保留一個(gè)磷酸基團(tuán)。反應(yīng)體系：ciap-treatedrna7μl，10×tapreactionbuffer1μl，tobaccoacidpyrophosphatase（0.5u/μl）1μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，totalvolume10μl。37℃反應(yīng)1h，取5μl用于5’raceadaptor連接反應(yīng)，剩余的5μl保存于-80℃。5’adaptor的連接反應(yīng)體系如下：ciap/tap-treatedrna5μl，5’raceadaptor（15μm）1μl，rnasefreedh2o4μl，65℃反應(yīng)5min后冰上放置2min，加入下列試劑：5×rnaligationbuffer8μl，40%peg600020μl，t4rnaligase1μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，總體積40μl，16℃反應(yīng)1h，4℃過(guò)夜。向上述反應(yīng)液中加入20μl的3mch3coona（ph5.2），140μl的rnasefreedh2o后，充分混勻，加入200μl的苯酚：氯仿：異戊醇，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，加入200μl的氯仿，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，加入2μl的nacarrier后充分混勻；再加入200μl的異丙醇，-40℃放置2h，加入500μl的75%的預(yù)冷乙醇漂洗，4℃，13000g離心5min，棄上清后再離心1min后徹底吸干溶液后干燥，加入7μl的rnasefreedh2o溶解沉淀，得到ligatedrna。

ligatedrna反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系：ligaterna6μl，5×m-mlvbuffer2μl，dntp（10μmeach）1μl，random9mers（50μm）0.5μl，reversetranscriptasem-mlv（rnaseh）（200u/μ）0.25μ，rnaseinhibitor（40u/μ）0.25μ，總體積10μl。反應(yīng)程序：30℃10min；42℃1h；70℃15min；4℃forever。獲得5’racecdna4℃儲(chǔ)存，進(jìn)入下一個(gè)步驟。

5’race巢氏pcr也分為5’raceouterpcr和5’raceinnerpcr兩輪，反應(yīng)體系，反應(yīng)條件與3’race巢氏pcr一致。

引物序列如下：thadh45’raceouterprimer：5'-acacaagcataatccacgactgtata-3'，genespecificouterprimer：5'-cgcggatccatggctacatgctgacagccta-3'。thadh45’raceinnerprimer：5'-tggtacaccggcttcccacccaaaga-3'，genespecificinnerprimer：5'-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3'。

pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切取目的片段，利用切膠試劑盒回收后，連接于takara公司的pmd19-tsimplevector，轉(zhuǎn)化takara公司的top10大腸桿菌感受態(tài)，通過(guò)含有amp的lb篩選培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，將篩選出的單克隆菌落pcr檢測(cè)后送至金斯瑞公司測(cè)序鑒定。

將測(cè)序獲得的3'race及5’race產(chǎn)物利用bioedit軟件進(jìn)行拼接，獲得含有1506bp堿基的目的基因，blast確認(rèn)目的基因和水稻/擬南芥adh4基因高度同源，命名為thadh4基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其包含一個(gè)1212bp的完整編碼閱讀框，其所編譯表達(dá)蛋白序列如seqidno.2所示。

實(shí)施例2thadh4基因植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用gateway定向克隆技術(shù)，將目的基因片段轉(zhuǎn)移到目的表達(dá)載體上，包含bp反應(yīng)和lr反應(yīng)兩部分。本實(shí)施例所用的載體圖如圖1所示。

1）bp反應(yīng)的目的是將基因片段轉(zhuǎn)移到入門(mén)載體上，反應(yīng)體系：vectorthadh4orf片段10-20ng，saltsolution1μl，pcrtm8/gw/topotmvector（入門(mén)載體）1μl，加nuclease-freewater至總體積6μl，輕輕混勻，22℃反應(yīng)60min后轉(zhuǎn)移至冰上；將前步6μl反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到top10感受態(tài)細(xì)胞中，涂于lb篩選培養(yǎng)平板，挑取單克隆進(jìn)行菌液pcr檢測(cè)，所用引物為基因特異性上游引物和載體上的t7引物，檢測(cè)后的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。

2）lr反應(yīng)的目的在于將已經(jīng)重組入門(mén)載體的目標(biāo)基因再克隆到目的載體中，反應(yīng)體系：入門(mén)載體純化后的質(zhì)粒100ng，目的載體（100ng/μl）1.5μl，lrclonaseiienzymemix2μl，加1×te（ph8.0）至總體積8μl，渦旋后短暫離心，25℃溫浴1h，加入1μlproteinaseksolution，混勻，37℃溫浴10min以終止反應(yīng)；取2μllr反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化top10感受態(tài)細(xì)胞，涂于lb篩選培養(yǎng)平板，挑取單克隆進(jìn)行菌液pcr檢測(cè)，所用引物為thadh4基因特異性上游引物和載體上的35s引物，檢測(cè)后的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證后，回收純化lr反應(yīng)后的重組載體，即得到目的基因的表達(dá)載體，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3thadh4基因的遺傳轉(zhuǎn)化

通過(guò)液氮凍融法將thadh4基因轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，后用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化雜種山新楊。操作步驟：在eha105感受態(tài)細(xì)胞中加入至少100ng回收純化的表達(dá)載體，輕輕混勻，冰浴30min，液氮速凍1min，37℃熱擊3min，迅速置于冰上1-2min，加入800μllb培養(yǎng)基，28℃，100rmp復(fù)蘇3h，4000rmp離心3min，吸掉800μllb培養(yǎng)基，混勻剩余菌液，涂抹于含有抗生素的lb平板，28℃倒置培養(yǎng)30-48h，pcr檢測(cè)陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆菌落擴(kuò)繁，接種于120ml含相應(yīng)抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃搖菌（220rmp）培養(yǎng)24h左右，至od600值約0.5，將菌液分裝于50ml的離心管中，1400rcf離心10min，收集菌體，用一定體積的ms（不加蔗糖）溶液重懸菌體至od600值0.5，乙酰丁香酮（as）至終濃度為20μm，25℃溫和振蕩（90rmp）菌液45min，將生長(zhǎng)勢(shì)基本一致，4-6周的山新楊組培苗，取頂芽下的2-3片舒展的葉片，延葉的邊緣剪出傷口，片剪成大小合適的不等邊形，轉(zhuǎn)入制備好的浸染液中25℃溫和振蕩30min（250ml的三角瓶，90rmp），取出葉盤(pán)，用濾紙吸干殘余菌液，轉(zhuǎn)入不含抗生素的ms1分化培養(yǎng)平板上暗培養(yǎng)48h，洗菌后轉(zhuǎn)入不含抗生素的ms1分化培養(yǎng)平板上光培養(yǎng)1w，再將葉盤(pán)轉(zhuǎn)入入含抗生素的ms1分化培養(yǎng)平板上，進(jìn)行篩選培養(yǎng)，當(dāng)葉盤(pán)邊緣長(zhǎng)出抗性不定芽時(shí)，將其轉(zhuǎn)入含抗生素的ms2莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，當(dāng)抗性不定芽在莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至1cm左右時(shí)，將其剪下轉(zhuǎn)入含有抗生素的ms培養(yǎng)平板上進(jìn)行抗性植株生根篩選，從而獲得完整植株，扦插抗性植株的苗干于ms培養(yǎng)基上，進(jìn)行插條的表型觀測(cè)。生長(zhǎng)4w后，從圖2可以看出，thadh4的過(guò)量表達(dá)對(duì)植株的表型產(chǎn)生了一定的影響，較對(duì)照植株，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)速度變快，節(jié)間發(fā)生變異，節(jié)間長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于對(duì)照植株。

實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植株水淹脅迫后的分子檢測(cè)

對(duì)篩選培養(yǎng)基上表型發(fā)生變異的轉(zhuǎn)thadh4基因楊樹(shù)及對(duì)照楊樹(shù)進(jìn)行沒(méi)頂淹水實(shí)驗(yàn)，1w后對(duì)照楊樹(shù)葉片呈現(xiàn)萎蔫、發(fā)黃，而轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)未有明顯變化，取樣進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分子檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量引物采用oligo6.6軟件設(shè)計(jì)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度156bp，引物tm值在60℃，引物序列：qadh4f:5'-cataatagagagcgtgg-3'qadh4r:5'-tgactgttctcatgatt-3'。實(shí)時(shí)定量pcr的內(nèi)參基因采用已篩選出的18s基因。實(shí)時(shí)定量在abi7500realtimepcrsystems上完成，每反轉(zhuǎn)錄樣品三次重復(fù)，數(shù)據(jù)提取分析采用7500systemsdssoftware。反應(yīng)體系如下：sybrpremixextaqtm（2×）10μl，pcrforwardprimer（10μm）0.4μl，pcrreverseprimer（10μm）0.4μl，roxreferencedyeⅱ（50×）0.4μl，dna模板2μl，dh2o6.8μl，總體積20μl。反應(yīng)程序：94℃30s；94℃5s，60℃34s，95℃15s，40cycles；60℃1min，95℃15s。實(shí)時(shí)定量結(jié)果如圖3所示：水淹脅迫1w后，對(duì)照植株葉片呈現(xiàn)萎蔫狀態(tài)，而轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)良好。thadh4基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因植株中較對(duì)照高出220倍-506倍，說(shuō)明中山杉thadh4基因和耐水淹特性密切相關(guān)，預(yù)測(cè)其在林木基因工程領(lǐng)域?qū)⒂兄匾膽?yīng)用價(jià)值。

sequencelisting

<110>江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所

<120>一種調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因及其應(yīng)用

<130>100

<160>15

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1506

<212>dna

<213>中山杉406

<400>1

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