本發(fā)明涉及生物醫(yī)療
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及kdm1a的用途。
背景技術(shù)：
：牙髓和牙本質(zhì)均起源于外胚間充質(zhì)(ectomesenchyme)，由牙乳頭發(fā)育而來。成人牙髓組織被堅硬的牙本質(zhì)包繞，一旦牙髓出現(xiàn)炎癥，易向壞死方向發(fā)展，實現(xiàn)功能性牙髓再生還存在一定的困難。目前，在干細胞介導(dǎo)的牙髓組織再生研究中，通過加入外源性干細胞及支架材料和生長因子后能夠在牙髓腔內(nèi)形成軟組織影像。但組織學(xué)水平研究發(fā)現(xiàn)，牙髓腔新生的軟組織類似于牙周組織，而非牙髓組織。如何精確控制干細胞的分化是目前尚未解決的難題。因此揭示調(diào)控干細胞的定向分化及組織再生效能的分子機制是組織工程研究中的重要問題。表觀遺傳修飾與間充質(zhì)干細胞的分化關(guān)系密切，絕大多數(shù)機體細胞的分化是通過表觀遺傳修飾調(diào)控的，極少數(shù)可能由于dna發(fā)生突變。表觀遺傳修飾包括：dna甲基化和組蛋白修飾兩方面作用，其中組蛋白修飾主要發(fā)生在組蛋白的-n末端，這些修飾作用繼而對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生影響，使這些位點上的基因可以單獨或以聯(lián)合的方式作用于下游基因。組蛋白可受到甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化、多聚adp、糖基化等多種修飾，這些修飾作用既能影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，也可以阻遏或促進基因的轉(zhuǎn)錄。其中的一種修飾方式-組蛋白甲基化通常發(fā)生在組蛋白n末端的賴氨酸殘基或精氨酸殘基上，最終體現(xiàn)為包括轉(zhuǎn)錄激活、抑制等在內(nèi)的多種效應(yīng)。通過查閱文獻我們發(fā)現(xiàn)，組蛋白能夠通過不同位點的甲基化和去甲基化來調(diào)控干細胞的增殖、分化、遷移等，從而達到促進組織再生的效能。組蛋白甲基化修飾的調(diào)控取決于作用的不同位點以及不同的甲基化狀態(tài)，甲基化位點包括h3k:4,9,27,36,79；h4k30和h4r3等，甲基化狀態(tài)則包括單甲基化，雙甲基化和三甲基化((mono-,di-,ortri-methylation—me1,me2orme3)。一般認為發(fā)生在h3k4、h3k36、h3k79位點的甲基化修飾與轉(zhuǎn)錄激活以及trxg(trithorax-groupproteins)蛋白家族有關(guān)，而發(fā)生在h3k9、h3k27、h4k20位點的甲基化則與基因沉默和pcg蛋白家族(polycomb-groupproteins)有關(guān)。組蛋白去甲基化酶1-kdm1a是位于細胞核上的一種黃素腺嘌呤二核苷酸(flavinadeninedinucleotide，fad)依賴性單胺氧化酶，是胺氧化酶家族中的一員。2004年shiy等第一次發(fā)現(xiàn)了組蛋白去甲基化酶1-(kdm1a)，打破了人們對于組蛋白甲基化不可逆的認知。研究表明，在fad的參與下，kdm1a可以特異性的催化組蛋白h3k4me1/2和h3k9me1/2去甲基化，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄，受體激活等作用，從而調(diào)控細胞的增殖、分化、遷移等作用。kdm1a缺失的小鼠胚胎發(fā)生早期死亡，胚胎干細胞中kdm1a的缺失將導(dǎo)致生長緩慢或胚胎死亡，因此kdm1a對早期發(fā)育也具有重要作用。隨著研究的深入，研究者們逐漸發(fā)現(xiàn)kdm1a能夠通過不同的信號途徑調(diào)控不同來源的成體干細胞如：胚胎干細胞，脂肪干細胞，神經(jīng)元干細胞以及造血干細胞等的增殖與分化。但是kdm1a在牙源性干細胞中的作用以及其作用機制尚不明確。而闡明間充質(zhì)干細胞的分化再生功能和作用機制將有助于促進牙齒組織再生的效率，為臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供依據(jù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供kdm1a的用途。本發(fā)明對kdm1a和plod2對根尖牙乳頭干細胞骨向/牙向分化過程中的作用進行驗證。本發(fā)明提供了kdm1a在制備調(diào)控根尖牙乳頭干細胞成牙和/或成骨相關(guān)基因表達的制劑中的應(yīng)用；所述成牙相關(guān)基因和/或成骨相關(guān)基因為bsp、ocn、dspp和/或dmp-1。所述調(diào)控具體為：抑制kdm1a基因后，bsp、ocn、dspp和/或dmp-1的表達得到促進。本發(fā)明提供了kdm1a在制備調(diào)控根尖牙乳頭干細胞成牙關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和/或成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達的制劑中的應(yīng)用；所述成牙和/或成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為osx、runx2和/或dlx2。所述調(diào)控具體為：抑制kdm1a基因后，轉(zhuǎn)錄因子osx、runx2和/或dlx2的表達被抑制。本發(fā)明提供了kdm1a在制備調(diào)控根尖牙乳頭干細胞成牙和/或成骨分化的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所述調(diào)控包括：調(diào)控堿性磷酸酶表達、調(diào)控根尖牙乳頭干細胞體外礦化能力、調(diào)控根尖牙乳頭干細胞鈣離子水平和/或調(diào)控scaps形成類骨質(zhì)的能力。所述調(diào)控具體為：抑制kdm1a基因?qū)е拢篴lp的表達被抑制，根尖牙乳頭干細胞體外礦化能力被抑制、根尖牙乳頭干細胞鈣離子水平下降、scaps形成類骨質(zhì)的能力降低。本發(fā)明所述kdm1a為kdm1a蛋白、kdm1a基因序列、能夠過表達根尖牙乳頭干細胞中kdm1a基因的物質(zhì)，或者能夠敲除或敲低根尖牙乳頭干細胞中kdm1a基因的物質(zhì)。所述能夠過表達根尖牙乳頭干細胞中kdm1a基因的物質(zhì)為包含kdm1a基因的表達載體；或者由包含kdm1a基因的表達載體轉(zhuǎn)染的逆轉(zhuǎn)錄病毒。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體為pqcxin。所述能夠敲除根尖牙乳頭干細胞中kdm1a基因的物質(zhì)為kdm1a的shrna，序列為aaataaaggtttgactcgtgg。或者為將kdm1a的shrna插入慢病毒的shrna載體上構(gòu)建而成kdm1a的shrna質(zhì)粒。本發(fā)明選取牙源性干細胞中自我更新和增殖能力均較強的根尖牙乳頭干細胞作為種子細胞。通過對敲減kdm1a的scaps的成骨誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)敲減kdm1a后scaps堿性磷酸酶活性和體外礦化能力降低。堿性磷酸酶作為成骨早期分化指標(biāo)，提示kdm1a可能作為調(diào)控scaps成骨分化的關(guān)鍵基因之一。本申請還在mrna水平檢測成骨關(guān)鍵基因bsp和ocn以及成牙關(guān)鍵基因dspp和dmp-1表達上調(diào)。bsp是骨基質(zhì)中重要的蛋白之一，bsp在成骨細胞分化早期分泌的細胞外基質(zhì)中表達較高，隨后成骨標(biāo)志基因ocn表達逐漸升高。dmp-1和dmp-1為成牙分化標(biāo)志基因，dspp是人類和小鼠牙本質(zhì)形成過程中的關(guān)鍵基因，并且有研究發(fā)現(xiàn)dspp是dmp-1能夠有效調(diào)控dspp的表達。這些發(fā)現(xiàn)揭示了kdm1a在調(diào)控scaps成骨/成牙分化的中晚期發(fā)揮重要作用。另外由于干細胞體外分化環(huán)境較為簡單，機體內(nèi)干細胞的增殖和分化功能還依賴于干細胞的微環(huán)境，包括與干細胞相鄰的支持細胞，黏附分子或細胞外基質(zhì)等。為了驗證kdm1a調(diào)控scaps成骨/成牙分化的功能，設(shè)計了敲減kdm1a組合對照組細胞的裸鼠體內(nèi)回植實驗?；刂?周后通過he染色發(fā)現(xiàn)kdm1ash和scramsh組均有類骨質(zhì)形成，kdm1ash組新形成的類骨質(zhì)明顯較scramsh組增多。本申請還發(fā)現(xiàn)敲減kdm1a后能夠激活轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵因子：osx、runx2以及dlx2的表達。runx2能夠激活osx從而促進成骨/成牙分化，而dlx家族的轉(zhuǎn)錄因子則能夠誘導(dǎo)runx2和osx的表達，因此我們猜測kmd1a可能是通過激活runx2、osx和dlx2的表達從而促進scaps成骨/成牙分化，提示kdm1a在誘導(dǎo)scaps成骨/成牙分化過程中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明提供了一種促進根尖牙乳頭干細胞成骨分化，或成牙分化的制劑，包括kdm1a表達抑制劑或能夠敲除、敲低kdm1a基因的物質(zhì)。本發(fā)明實施例中，促進根尖牙乳頭干細胞成骨分化的制劑包括能夠敲除或敲低kdm1a基因的物質(zhì)。能夠敲除kdm1a基因的物質(zhì)為kdm1a的shrna插入慢病毒的shrna載體上構(gòu)建而成kdm1a的shrna質(zhì)粒。具體的，慢病毒載體為plko.1。本發(fā)明提供了一種抑制根尖牙乳頭干細胞成骨分化，或成牙分化的制劑，包括kdm1a蛋白或能夠表達kdm1a基因的物質(zhì)。本發(fā)明實施例中，促進間充質(zhì)干細胞成牙分化的制劑包括能夠過表達kdm1a基因的物質(zhì)。具體的為：由包含kdm1a基因的表達載體轉(zhuǎn)染的逆轉(zhuǎn)錄病毒。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體為pqcxin。本發(fā)明提供了一種促進根尖牙乳頭干細胞成骨分化，或成牙分化的方法，敲除或敲低間充質(zhì)干細胞的kdm1a基因，或以含有kdm1a表達抑制劑的誘導(dǎo)液對間充質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo)。本發(fā)明提供了一種抑制根尖牙乳頭干細胞成骨分化，或成牙分化的方法，過表達間充質(zhì)干細胞的kdm1a基因，或以含有kdm1a的誘導(dǎo)液對間充質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo)。促進根尖牙乳頭干細胞成牙分化亦可稱為促進牙組織再生；促進根尖牙乳頭干細胞成骨分化可稱為促進骨組織再生。本發(fā)明提供了kdm1a在制備與plod2相互作用的物質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀的方法，發(fā)現(xiàn)了若干可能與kdm1a結(jié)合的蛋白，接著我們利用蛋白質(zhì)譜分析，根據(jù)結(jié)果中各個蛋白的肽段覆蓋率及分子量的大小篩選出plod2，接著再次采用蛋白質(zhì)免疫共沉淀的方法驗證了plod2確實能夠與kdm1a形成蛋白復(fù)合體。本發(fā)明提供了plod2在制備調(diào)控根尖牙乳頭干細胞成牙和/或成骨相關(guān)基因表達的制劑中的應(yīng)用；所述成牙相關(guān)基因和/或成骨相關(guān)基因為bsp、ocn、dspp和/或dmp-1。所述調(diào)控具體為：抑制plod2基因后，bsp、ocn、dspp和/或dmp-1的表達得到促進。本發(fā)明提供了plod2在制備調(diào)控根尖牙乳頭干細胞成牙關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和/或成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達的制劑中的應(yīng)用；所述成牙和/或成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為osx、runx2和/或dlx2。所述調(diào)控具體為：抑制plod2基因后，轉(zhuǎn)錄因子osx、runx2和/或dlx2的表達被抑制。本發(fā)明提供了plod2在制備調(diào)控根尖牙乳頭干細胞成牙和/或成骨分化的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所述調(diào)控包括：調(diào)控堿性磷酸酶表達、調(diào)控根尖牙乳頭干細胞體外礦化能力和/或調(diào)控根尖牙乳頭干細胞鈣離子水平。所述調(diào)控具體為：抑制plod2基因?qū)е拢篴lp的表達被抑制，根尖牙乳頭干細胞體外礦化能力被抑制、根尖牙乳頭干細胞鈣離子水平下降。本發(fā)明所述plod2為plod2蛋白、plod2基因序列、能夠過表達根尖牙乳頭干細胞中plod2基因的物質(zhì)，或者能夠敲除或敲低根尖牙乳頭干細胞中plod2基因的物質(zhì)。本發(fā)明實驗表明，敲減plod2后scaps的成骨/成牙誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)敲減plod2后scaps的alp活性降低，茜素紅染色較ocnsh組減弱，這揭示了敲減plod2抑制scaps早期成骨分化和體外礦化能力。接著realtimertpcr檢測了bsp、ocn、dspp和dmp1的表達水平，發(fā)現(xiàn)plod2能夠負向調(diào)控scaps中晚期體外成骨/成牙分化；并且對plod2sh中成骨/成牙關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子osx、runx2、dlx2的表達也較ocnsh組中明顯上調(diào)。以上這些實驗結(jié)果與敲減kdm1a后scaps成骨/成牙分化表型一致。這提示kdm1a能夠與plod2形成蛋白復(fù)合體共同調(diào)控根尖牙乳頭干細胞的骨向/牙向分化本發(fā)明提供了一種促進根尖牙乳頭干細胞成骨分化，或成牙分化的制劑，包括plod2表達抑制劑或能夠敲除、敲低plod2基因的物質(zhì)。所述能夠敲除根尖牙乳頭干細胞中plod2基因的物質(zhì)為plod2的shrna，序列為ggataatggctgcactctttg?；蛘邽閷lod2的shrna插入慢病毒的shrna載體上構(gòu)建而成plod2的shrna質(zhì)粒。本發(fā)明提供了一種抑制根尖牙乳頭干細胞成骨分化，或成牙分化的制劑，包括plod2蛋白或能夠表達plod2基因的物質(zhì)。所述能夠過表達根尖牙乳頭干細胞中plod2基因的物質(zhì)為包含plod2基因的表達載體；或者由包含plod2基因的表達載體轉(zhuǎn)染的逆轉(zhuǎn)錄病毒。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體為pqcxin。本發(fā)明提供了一種促進根尖牙乳頭干細胞成骨分化，或成牙分化的方法，敲除或敲低間充質(zhì)干細胞的plod2基因，或以含有plod2表達抑制劑的誘導(dǎo)液對間充質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo)。本發(fā)明提供了一種抑制根尖牙乳頭干細胞成骨分化，或成牙分化的方法，過表達間充質(zhì)干細胞的plod2基因，或以含有plod2的誘導(dǎo)液對間充質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo)。本發(fā)明研究表明：1、kdm1a在體外正向調(diào)控scaps早期成骨/成牙分化指標(biāo)-alp活性及體外礦化功能，負向調(diào)控scaps體外晚期成骨/成牙分化指標(biāo)及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達。敲減kdm1a促進scaps體內(nèi)成骨/成牙功能。2、plod2是kdm1a的共結(jié)合蛋白，在體外正向調(diào)控scaps早期成骨/成牙分化指標(biāo)-alp活性及體外礦化功能，負向調(diào)控scaps體外晚期成骨/成牙分化指標(biāo)及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達。3、kdm1a與plod2通過形成蛋白復(fù)合體共同調(diào)控scaps成骨/成牙分化與再生功能。綜上，本發(fā)明研究結(jié)果表明，kdm1a能夠通過調(diào)控成骨、成牙基因的表達，影響根尖牙乳頭干細胞向成骨、成牙的分化，從而影響根尖牙乳頭干細胞體外內(nèi)礦化能力。本發(fā)明為制備含有kdm1a基因的骨組織或牙組織再生藥物提供技術(shù)支持。附圖說明圖1裸鼠皮下回植示意圖；圖2示realtimert-pcr鑒定kdm1a敲減效率；圖3示westernblot鑒定kdm1a敲減效率；圖4示敲減kdm1a后，scap體外堿性磷酸酶活性降低；圖5示敲減kdm1a后，scaps體外礦化能力降低；其中，圖5-a示scaps成骨/成牙本質(zhì)向誘導(dǎo)第2周，kdm1ash茜素紅染色較scramsh組降低；圖5-b示scaps成骨/成牙本質(zhì)向誘導(dǎo)第2周，kdm1ash組鈣離子濃度顯著降低(p<0.05)；圖6示敲減kdm1a促進bsp、ocn、dspp、dmp1表達上調(diào)；圖6-a示在誘導(dǎo)1周時，kdm1ash組中bsp表達較對照組升高；圖6-b示2周時kdm1ash組ocn的表達才逐漸升高(p＜0.05)；圖6-c示kdm1ash組在誘導(dǎo)1w、2w時dspp表達明顯上調(diào)(p＜0.05，p＜0.01)；圖6-d示kdm1ash組在誘導(dǎo)1w、2w時dmp1表達明顯上調(diào)(p＜0.05，p＜0.01)；圖7示敲減kdm1a后促進osx、runx2、dlx2的表達上調(diào)；圖8示kdm1a敲減后scaps回植8周后標(biāo)本he染色及硬組織的定量分析；其中，圖8-a的放大倍數(shù)為100倍，標(biāo)尺長50μm；圖8-b的放大倍數(shù)為200倍，標(biāo)尺長100μm；圖8-c的放大倍數(shù)為100倍，標(biāo)尺長50μm；圖8-d的放大倍數(shù)為200倍，標(biāo)尺長100μm；圖中b示骨/牙樣組織；ha示羥基磷灰石；ct示結(jié)締組織；圖9示骨樣/牙樣硬組織定量分析；圖10示kdm1a過表達效果鑒定，β-actin為內(nèi)參；圖11示蛋白質(zhì)免疫共沉淀(co-ip)發(fā)現(xiàn)kdm1a共結(jié)合蛋白plod2；其中，圖11-a示考馬斯亮藍染色發(fā)現(xiàn)kdm1a共結(jié)合條帶；圖11-b示co-ip驗證共結(jié)合蛋白plod2；圖12示10×顯微鏡下觀察到慢病毒整合到scap內(nèi)，綠色熒光蛋白在細胞內(nèi)表達；圖13示westernblot在蛋白質(zhì)水平檢測顯示plod2有效敲除；圖14示敲減plod2后，scaps堿性磷酸酶活性及茜素紅染色減弱；圖14-a示成骨/成牙分化誘導(dǎo)第5天時檢測plod2sh和ocnsh組scaps堿性磷酸酶活性，結(jié)果顯示plod2sh組alp活性減弱；圖14-b示成骨/成牙分化誘導(dǎo)第14天時檢測scaps茜素紅染色，結(jié)果顯示plod2sh組染色較ocnsh組弱；圖15示敲減plod2促進scapsbsp、ocn、dspp、dmp-1相關(guān)成骨/成牙基因的表達上調(diào)；其中，圖15-a示敲減plod2的scaps中bsp的表達；圖15-b示敲減plod2的scaps中ocn的表達、圖15-c示敲減plod2的scaps中dspp的表達、圖15-d示敲減plod2的scaps中dmp-1的表達；圖16示敲減plod2后scaps成骨/成牙分化轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵因子osx、runx2、dlx2表達上調(diào)。具體實施方式本發(fā)明提供了kdm1a的用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1kdm1a對scaps骨向/牙向分化影響通過構(gòu)建敲減kdm1a的scaps，分別進行體外成骨誘導(dǎo)，及體內(nèi)裸鼠皮下移植的成骨研究。1材料和設(shè)備1.1實驗材料人根尖牙乳頭組織來自于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診拔除的第三磨牙，患者知情同意，年齡16～20歲，無全身系統(tǒng)性疾病，無齲病及牙周病。1.2主要試劑α-mem培養(yǎng)基：(gibco，美國)、胎牛血清：(gibco，美國)、l-谷氨酰胺：(invitrogen，美國)、l-抗壞血酸2-磷酸：(sigma，美國)、青霉素、鏈霉素：(invitrogen，美國)、dispase：(sigma，美國)、i型膠原酶：(sigma，美國)、0.25％胰蛋白酶：(invitrogen，美國)、pbs：(gibco，美國)、dmso：(北京天根生化科技公司)、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(gibco，美國)、地塞米松：購自美國sigma公司、維生素c：購自美國sigma公司、β-甘油磷酸鈉：購自美國sigma公司、質(zhì)粒小提試劑盒(promega公司)、單克隆抗體cd34，cd45，cd105(biolegend,圣地亞哥,美國)、異丙醇(國藥前景，中國)、乙醇(國藥前景，中國)、甲醛(國藥前景，中國)、丙酮(國藥前景，中國)、mgcl2(sigma-aldrich，美國)、cacl2(sigma-aldrich，美國)、np40(sigma-aldrich，美國)、alp緩沖液(sigma-aldrich，美國)、堿性磷酸酶試劑盒(sigma-aldrichcat#86c，美國)、茜素紅(sigma-aldrich，美國)、cpc(sigma-aldrich，美國)、引物(上海生工生物工程有限公司，中國)、quantitectsybrgreenpcr試劑盒：(qiagen，德國)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega，美國)、定量pcr試劑盒(abi，美國)、scrambleshrna(scramsh)(addgene，美國)、kdm1ashrna(kdm1ash)(addgene，美國)、慢病毒包裝試劑盒(addgene，美國)、polybrene(sigma-aldrich,圣路易斯，美國)、常規(guī)he染色試劑(北京益利精細化學(xué)品有限公司，中國)、ha-tcp(羥基磷灰石晶體)(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，中國)1.3主要設(shè)備二氧化碳細胞培養(yǎng)箱：上海healforce90型、倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)：日本olympus公司、電動移液器：德國eppendorf公司、臺式高速冷凍離心機:thermo公司mr23型、超凈工作臺：哈爾濱東聯(lián)公司fcl-3型、-20℃和4℃冰箱bcd-303w：北京雪花制冷設(shè)備公司、-80℃超低溫冰箱925：美國formascientificinc公司、液氮罐：四川樂山東亞機電工貿(mào)有限公司、電熱恒溫水浴箱：北京長風(fēng)儀器儀表公司、自動細胞計數(shù)儀(tc10tm,bio-radlaboratories,usa)、酶標(biāo)儀：美國moleculardevices公司、geneamppcrsystem9700：美國appliedbiosystems公司、mx3005preal-timepcr儀：美國stratagene公司、電子天平和分析天平：德國sartorius、75cm2細胞培養(yǎng)瓶：美國bd公司、細胞培養(yǎng)皿：美國costar公司、自動包埋機：美國leicatp1020、自動切片機：美國leicarm2255、展片機：美國leicahi1210、自動染片機：美國leicast5020、顯微鏡(olympus)及圖像采集系統(tǒng)(imagepro6.0)2實驗方法2.1scaps取材、培養(yǎng)、傳代麻醉下無菌拔除阻生第三磨牙，取出根尖牙乳頭組織，用pbs反復(fù)清洗，剪碎，置于含ⅰ型膠原酶(3g/l)和dispase(4g/l)的消化液、37℃消化1h，過70μm細胞篩收集細胞，1000rpm離心10min，用培養(yǎng)液重新懸浮成單細胞懸液。將細胞接種于直徑35mm細胞培養(yǎng)皿中，在間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基中37℃、5％co2培養(yǎng)，每2～3天換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。當(dāng)細胞生長至80％匯合狀態(tài)時，用0.25％胰蛋白酶按1：2消化傳代。2.2scaps的凍存及復(fù)蘇細胞的凍存：觀察細胞生長狀態(tài)，細胞融合至80％左右加入胰蛋白酶消化。1100rpm離心5min，棄上清液。向離心管中加入凍存液，將細胞吹打混勻；向每個凍存管中加入1ml細胞懸液，擰緊蓋子。將凍存管依次放入4℃冰箱1h，-20℃冰箱2h，-80℃冰箱過夜；放入液氮罐中保存。細胞的復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存管置于37℃水浴中快速振蕩融化，將凍存管中的液體，輕輕吹打混勻，吸出置于離心管中，1100rpm離心5min，棄上清液，加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基吹打混勻，移入100mm培養(yǎng)皿中，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液。2.3根尖牙乳頭干細胞敲減kdm1a(1)質(zhì)粒構(gòu)建與病毒包裝收集將帶有目的基因kdm1a互補序列的shrna克隆到plko.1慢病毒質(zhì)粒中。病毒包裝按照廠家說明書(addgene)進行，病毒質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒在293t細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后，收集上清，進行病毒滴度鑒定，分裝后保存于-80℃冰箱。購買商品化的scrambleshrna(scramsh)作為kdm1ash的對照。kdm1ashrnas的目的序列為：5’-aaataaaggtttgactcgtgg-3’(seqidno:1)(2)病毒轉(zhuǎn)染根尖牙乳頭干細胞鋪板過夜，慢病毒在6μg/mlpolybrene(聚凝胺)作用下轉(zhuǎn)染根尖牙乳頭干細胞12h；轉(zhuǎn)染后48h，用1ug/ml的嘌呤霉素篩選7天后，得到kdm1ash穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的根尖牙乳頭干細胞，用real-timepcr在mrna水平檢測kdm1ash敲減效率；轉(zhuǎn)染空載體的scramsh的scaps作為對照組。2.4real-timert-pcr檢測基因表達2.4.1引物設(shè)計(1)引物設(shè)計，primer3及oligo6等生物軟件。(2)rt-pcr引物序列:(表1)2.4.2細胞總rna的提取按試劑說明書進行操作，具體操作如下：(1)取出培養(yǎng)的6孔板細胞，用pbs漂洗細胞兩遍，吸干后每孔加入500μltrizol，反復(fù)吹打混勻，液體由粘稠狀變?yōu)槌吻搴筠D(zhuǎn)移至depc處理的1.5mlep管中，室溫靜置5分鐘；(2)加入1/5體積的氯仿(100μl)，劇烈混勻15秒，室溫靜置10分鐘待其分層；(3)4℃，12000g離心15分鐘；(4)小心吸取上層水相(一般為300μl)，轉(zhuǎn)移至另一depc處理的1.5mlep管中；(5)加入等體積異丙醇，輕柔顛倒混勻后靜置，室溫孵育10分鐘；(6)4℃，12000g離心10分鐘；(7)棄上清，加入預(yù)冷的75％乙醇(depc水配制)，顛倒混勻，4℃，7500g離心5分鐘，棄上清，瞬時離心；(8)吸凈殘留液體，室溫干燥5-10分鐘，depc水(加入50或100ul，根據(jù)rna量多少加入)溶解rna，-70℃保存收獲的rna待用；(9)紫外分光光度計測定總rna濃度及純度：在紫外分光光度儀下分別測定260nm和280nm吸光度值，計算a260：a280比值，比值在1.8～2.0之間，說明所提取的rna樣品純度較高；(10)總rna電泳鑒定：電泳的目的在于檢測28s和18s條帶的完整性和比值?？梢?8s和18s條帶明亮、清晰、銳利，并且28s的亮度約為18s條帶的兩倍以上，表明抽提的rna純度高且無降解。表1rt-pcr引物序列2.5.3反轉(zhuǎn)錄cdna(1)、microtube管中配制下列模板rna/引物混合液，全量<15μl(表2)；表2rna/引物混合液配制模板rna3μloligo(dt)12-18primer(50μm)0.5μl(2)、70℃保溫5分鐘后迅速在冰上冷凍2分鐘以上；(3)、離心數(shù)秒使模板rna/引物的變性溶液聚集于microtube管底部；(4)、在上述microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，于42℃保溫2小時；(表3)；(5)、95℃保溫15分鐘后冰上冷卻，得到cdna溶液。2.4.4real-timepcr配置real-timepcr反應(yīng)體系如下(表4～5)：表3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配制試劑名稱使用量上述模板rna/引物變性溶液3.5μl5×m-mlvbuffer5μldntpmixture(各10mm)1.25μlrnaseinhibitor(40u/μl)25um-mlv(200u/μl)200urnasefreedh2oupto25μl表4real-timepcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系成分體積(μl)5×sybrmix5pcrprimer(5pmol)0.5ddh2o5cdna10.5total21表5real-timepcr反應(yīng)步驟2.5蛋白質(zhì)印跡法(weston-blot，wb)2.5.1細胞總蛋白的提取(1)用4℃預(yù)冷的pbs漂洗細胞兩次，吸凈pbs后，加入2mlpbs用細胞刮將細胞完全刮于培養(yǎng)皿一側(cè)，吸入15ml離心管，2mlpbs沖洗培養(yǎng)皿兩次，沖洗液均吸入離心管。4℃，1100rpm離心3min，棄上清。(2)1mlpbs重懸細胞吸于1.5mlep管中，4℃，7200rpm離心2min，棄上清。(3)滴入蛋白裂解(ripa:pmsf＝100:1)100μl吹打混勻，冰上反應(yīng)15min，期間每3min震蕩混勻。4℃，14000rpm離心20min。(4)取上清液，轉(zhuǎn)入另一ep管中，-80℃保存，用于測定蛋白濃度和sds-page電泳。2.5.2bca法測定蛋白濃度(1)根據(jù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，按每孔加200ulbcasolution，4ul4％cupricsulfate(50：1)配制適量bca工作液，充分混勻；(2)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按說明依次用雙蒸水稀釋，使終濃度分別為1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；(3)取適量樣品加入96孔板中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到25μl。每孔加入200μlbca工作液，37℃恒溫箱孵育30min；(4)測定562nm波長的吸光度；(5)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度；(6)根據(jù)蛋白濃度計算上樣體積，每組蛋白的上樣量為25μg(組別間上樣體積差別較大時可用裂解液補齊)。2.5.3聚丙烯酰胺凝膠電泳準(zhǔn)備玻璃板夾板，用無水乙醇將玻璃擦凈，干燥；根據(jù)下表(表6)配置分離膠(其中temed在最后加入)，注入玻璃板中(不要有氣泡，離薄玻璃板上緣1cm左右)，加異丙醇覆蓋膠面；表6分離膠組方1.5mol/ltris-cl(ph8.8)的配制方法：27.23gtrisbase，80ml去離子水，6nhcl調(diào)ph值至8.8，加水至150ml，4℃保存。0.5mol/ltris-cl(ph6.8)的配制方法：6gtrisbase，60ml去離子水，6nhcl調(diào)ph值至6.8，加水至100ml，4℃保存。(1)待分離膠凝固后，吸出異丙醇(將架子斜置，用吸水紙吸干)；(2)按上表配置濃縮膠注入玻璃板中，加滿，避免產(chǎn)生氣泡，放置樣品梳；(3)待濃縮膠凝固后，拔去樣品梳，將玻璃夾板固定在電泳槽上，輕輕沖洗點樣孔，去除未聚合的凝膠；(4)立即插入冰中待融化。將待測樣本與5×sds上樣緩沖液按照4：1混合，95℃加熱5min；(5)以每孔20μg蛋白量上樣；(6)以60v電壓電泳至溴酚藍電泳至分離膠，將電壓調(diào)到100v，直至溴酚藍到達分離膠底部，終止電泳。2.5.4轉(zhuǎn)膜剪取pvdf膜，使其與待電泳凝膠大小一致，在甲醇中浸泡5秒，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中；取一托盤，倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，將凝膠、pvdf膜、纖維墊及濾紙置于其中，浸泡大約15min；安裝“三明治”轉(zhuǎn)移裝置(負極面、纖維墊、濾紙—凝膠—pvdf膜—濾紙、纖維墊、正極面)。將裝置至于冰盆中，按照100v/250ma的設(shè)置電轉(zhuǎn)移；取出pvdf膜，tbs漂洗5min。2.5.5westernblot濾膜雜交將轉(zhuǎn)印后的pvdf膜用5％脫脂奶粉(tbst配制)室溫搖床封閉1h；將濾膜取出，放入5％bsa稀釋的一抗稀釋液中，4℃搖床過夜，tbst洗膜，5min×3次；將濾膜放入封閉液稀釋的hrp標(biāo)記的二抗中，37℃孵育1h，tbst洗5min×3次。2.5.6顯色將pvdf膜膠面朝上放在保鮮膜上，加1:1混合的顯影液，使其均勻覆蓋膜，bio-rad化學(xué)發(fā)生成像系統(tǒng)中成像并用配套quantityone軟件分析結(jié)果。2.6成骨誘導(dǎo)分化2.6.1成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配置:10mmβ-甘油磷酸鈉，10nm地塞米松，50mg/l維生素c；取第3-4代細胞以2×103/cm2的濃度接種于6孔板中，待細胞生長至80％融合后，換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，分別在0w、1w、2w時用trizol裂解細胞提取總rna進行real-timepcr檢測成骨/成牙分化標(biāo)志基因的表達。2.6.2堿性磷酸酶活性測定準(zhǔn)備試劑，如下表：表7試劑配方操作步驟1)用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)去培養(yǎng)基，pbs洗2次；3)加300μl裂解液，37℃搖床，15min；4)將細胞輕輕刮下，移至1.5mlep管(置于冰上)，14000rpm，4℃離心10min；5)取上清，移至另一ep管；6)取膠囊，加入5ml純水溶解(stocksubstratesol.)；7)取50μlalp緩沖液加入50μlstocksubstratesol.，充分混勻；8)置于96孔板中，加入100μl7)液，10μl上清液，37℃孵育15min；9)加入110μl0.5nnaoh終止反應(yīng)；10)酶標(biāo)儀上讀取405nm波長吸光度值(od值)；11)本實驗所用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算公式：y＝18.904x-0.2817y：堿性磷酸酶alpsigmaunit/min/mgproteinx:od吸光度值要求od>0.015(x:od值；y:sigmaunit)2.6.3茜素紅染色棄掉培養(yǎng)基，pbs洗2次；70％乙醇固定，4℃，1h；雙蒸水洗2次；40mm茜素紅溶液(ph4.2)室溫染色1-10min，肉眼觀察著色情況；雙蒸水洗5次，輕輕吹打；pbs搖動洗15分鐘,較少非特異性染色；掃描儀透射模式采集圖像。2.6.4ca2+濃度檢測茜素紅染色后，加入1ml10％w/vcpc(pbs溶解)，室溫放置30min(ar-s被溶解至cpc中)；以1:10稀釋溶液，取20μl溶液加入180ul純水，在酶標(biāo)儀中以562nm波長測定其吸光度值(od)；以ar-s標(biāo)準(zhǔn)曲線計算ca2+的相對濃度，通過標(biāo)準(zhǔn)鈣離子濃度曲線計算樣本的鈣離子濃度，總蛋白質(zhì)濃度作為內(nèi)參；本實驗ca2+相對濃度的計算公式：y＝0.685x+0.0503(y：ca2+相對濃度，x：od值)2.7kdm1a敲減后scaps關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達分別提取kdm1ash和scramsh組細胞rna，進行realtimert-pcr檢測關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子：osx、runx2、dlx2的表達水平。2.8kmd1a敲減scaps裸鼠皮下回植(1)分別取生長狀態(tài)良好的第4代上述不同分組細胞，以1×105個/瓶的密度接種75cm2的培養(yǎng)瓶，待細胞長至80％匯合度時棄培養(yǎng)基，pbs漂洗(為保證細胞狀態(tài)，細胞匯合度不宜過大)。(2)每組細胞加2.5mlⅱ型膠原酶(含100ug/mltlc)37℃孵育5min，將細胞從培養(yǎng)皿上洗脫，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中。(3)1000rpm，4℃離心5min。(4)用上述含20％fbs和l-谷氨酰胺的α-mem培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)，取1ml細胞懸液至含有20mg羥基磷灰石(ha)的2ml圓底ep管中(要保證每組細胞量一致，約2-3×106個細胞/組)。(6)37℃，5％co2條件下孵育1.5h。為保證細胞與ha-tcp充分結(jié)合，應(yīng)在搖動的情況下孵育。(7)短時離心，使ha-tcp沉于管底，吸上清，細胞與ha-tcp混合物置于冰上待用。(8)裸鼠稱重，1％水合氯醛腹腔注射麻醉。75％酒精消毒后背部皮膚，在后背部中線處剪一2-3cm的切口。(9)鈍性分離皮下結(jié)締組織，按圖1所示位置將細胞與ha混合物植入裸鼠皮下，每只裸鼠背部后方植入2個部位，縫合皮膚。2.9標(biāo)本處理2.9.1標(biāo)本脫鈣體內(nèi)移植8周后處死(脫頸)裸鼠，取移植物經(jīng)10％中性福爾馬林固定后，轉(zhuǎn)至ph值等于8.0的10％edta內(nèi)，每天換液，直到針刺變軟。2.9.2組織切片制備完全脫鈣后流水沖洗24小時(除酸)進行脫水包埋。(1)脫水：梯度乙醇脫水(70％，80％，90％，100％，100％各2小時)(2)透明：二甲苯(2次各30分鐘)；(3)包埋：將脫過水的組織轉(zhuǎn)至處理好的石蠟(石蠟熔化，于60℃放置過夜)中，浸蠟(1小時×2次)，然后包埋取出標(biāo)本；(4)切片：在自動切片機上進行連續(xù)切片。切片厚度為4-6μm，60℃烤片4小時，4℃保存。2.9.3石蠟切片he染色步驟二甲苯?。?0min；二甲苯ⅱ：10min；無水乙醇ⅰ：3min；無水乙醇ⅱ：3min；95％乙醇?。?min；95％乙醇ⅱ：3min；85％乙醇：3min；75％乙醇：3min；流水沖洗：3min；蒸餾水洗：1min；蘇木精液染色：2min；流水洗去蘇木精液：30s；1％鹽酸-乙醇：3s；流水沖洗返藍：10min；蒸餾水洗：1min；0.5％伊紅液染色：1min；蒸餾水稍洗：2s；80％乙醇：10s；95％乙醇?。?0s；95％乙醇ⅱ：10s；無水乙醇ⅰ：10s；無水乙醇ⅱ：10s；二甲苯?。?min；二甲苯ⅱ：2min；中性樹膠封固；imagepro軟件計算平均成骨面積。3統(tǒng)計分析采用spss22.2統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組計量資料比較采用t檢驗，p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。3實驗結(jié)果1、檢測scaps中kdm1a敲減效率體外分別利用慢病毒對scaps進行轉(zhuǎn)染，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的敲減kdm1a的根尖牙乳頭干細胞。realtimert-pcr和westernblot在mrna水平及蛋白質(zhì)水平檢測敲減效率，發(fā)現(xiàn)可以有效的敲減kdm1a，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)(圖2～3)；圖2通過realtimert-pcr鑒定，kdm1a敲減效率超過60％(p≤0.05)，gapdh為內(nèi)參；圖3westernblot結(jié)果顯示kdm1a有效敲減，gapdh為內(nèi)參。以上為三次獨立實驗重復(fù)結(jié)果。2、敲減kdm1a對scaps體外成骨/成牙分化能力的影響對敲減kdm1a的scaps進行成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)第5天時檢測kdm1ash和scramsh組堿性磷酸酶活性發(fā)現(xiàn)kdm1ash組明顯低于對照scramsh組(圖4)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。成骨誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色顯示對照組片狀紅色著色，kdm1ash組著色較淺(圖5-a)，鈣離子濃度檢測發(fā)現(xiàn)kdm1ash組較scramsh組鈣離子濃度明顯降低(圖5-b)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；以上為三次獨立實驗重復(fù)結(jié)果。成骨誘導(dǎo)第0天，7天，14天時提取kdm1ash組和scramsh組細胞rna，realtimepcr檢測成骨/成牙相關(guān)基因：bsp(圖6-a)、ocn(圖6-b)、dspp(圖6-c)、dmp-1(圖6-c)的表達。結(jié)果顯示，實驗組(kdm1ash)與對照組(scramsh)相比，bsp在成骨誘導(dǎo)1w時表達明顯上調(diào)，而ocn則是在2周時表達上調(diào)，dspp和dmp-1的表達明顯增強(圖6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。gapdh為內(nèi)參。以上為三次獨立實驗重復(fù)結(jié)果。進而我們又檢測了成骨/成牙關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子osx、runx2dlx2的表達。realtimert-pcr結(jié)果顯示osx、runx2、dlx2的表達在kdm1ash組顯著高于scramsh組(圖7)，gapdh為內(nèi)參。以上為三次實驗獨立重復(fù)結(jié)果。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。3、敲減kdm1a對scaps體內(nèi)成骨/成牙能力的影響(1)大體觀察8周后，裸鼠全部存活，體內(nèi)移植后，裸鼠生存良好，術(shù)區(qū)無感染，移植物無炎癥反應(yīng)，切口愈合良好；裸鼠體內(nèi)移植物he染色結(jié)果8周后取材，脫鈣，制取石蠟切片。(2)組織病理學(xué)觀察he染色顯示kdm1a基因敲減組及對照組均有類骨質(zhì)組織形成，kdm1a基因敲減組形成的類骨質(zhì)組織明顯多于對照組(圖8)。(3)定量分析結(jié)果。應(yīng)用ipp6.0軟件對體內(nèi)移植的各組樣本(n＝7)的形成的類骨質(zhì)面積與纖維組織面積的比值進行計算，結(jié)果顯示(圖9)kdm1ash組形成的類骨質(zhì)面積顯著多于scramsh組,(p<0.01)。以上研究結(jié)果表明基因敲減kdm1a可以明顯促進根尖牙乳頭干細胞在體內(nèi)形成硬組織。實施例2kdm1a調(diào)控scaps成骨/成牙向分化的作用機制1、實驗材料應(yīng)用第一部分實驗中培養(yǎng)的根尖牙乳頭干細胞及經(jīng)過病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定過表達kdm1a基因的根尖牙乳頭干細胞及對照組細胞。1.1主要試劑α-mem培養(yǎng)基：(gibco，美國)胎牛血清：(gibco，美國)l-抗壞血酸2-磷酸：(sigma，美國)l-谷氨酰胺：(invitrogen，美國)青霉素、鏈霉素：(invitrogen，美國)0.25％胰蛋白酶：(invitrogen，美國)pbs：(gibco，美國)dmso：(北京天根生化科技公司，美國)質(zhì)粒小提試劑盒(promega公司，美國)plko.1慢病毒載體(addgene,cambridge,ma,美國)ha-kdm1a質(zhì)粒(中美太和公司，中國)polybrene(sigma-aldrich,st.louis,mo,美國)pierceha-tagip/co-ipkit(thermopierce,美國)抗kdm1a單克隆抗體(cellsignalingtechnology，美國)抗ha單克隆抗體(cellsignalingtechnology,美國)抗plod2多克隆抗體(abnova，taibei，taiwan)抗β-actin單克隆抗體(abcam,美國)辣根過氧化物酶：羊抗鼠；羊抗兔(abcam,美國)lysisbuffer：(sigma，美國)pmsf：(sigma，美國)pic：(sigma，美國)wb顯影液：(普利來公司，中國)wb定影液：(普利來公司，中國)wb發(fā)光液：(pierce公司，美國)胰蛋白酶(測序級)：(promega公司，美國)lc-18spe：(waters公司，美國)1.2實驗設(shè)備二氧化碳細胞培養(yǎng)箱：上海healforce90型倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)：日本olympus公司臺式高速冷凍離心機:thermo公司mr23型電動移液器：德國eppendorf公司超凈工作臺：哈爾濱東聯(lián)公司fcl-3型液氮罐：四川樂山東亞機電工貿(mào)有限公司-20℃和4℃冰箱bcd-303w：北京雪花制冷設(shè)備公司-80℃超低溫冰箱925：美國formascientificinc公司電熱恒溫水浴箱：北京長風(fēng)儀器儀表公司酶標(biāo)儀：美國moleculardevices公司電子天平和分析天平：德國sartorius細胞培養(yǎng)皿：美國costar公司70μm細胞篩、24孔和96孔細胞培養(yǎng)板：美國falocn公司蛋白質(zhì)譜儀q-exactive：美國thermo22實驗方法2.1根尖牙乳頭干細胞過表達kdm1a(1)質(zhì)粒的構(gòu)建與病毒包裝收集通過ncbi數(shù)據(jù)庫查詢kdm1a的基因全場編碼序列，找到kdm1a的編碼區(qū)，在kdm1a的起始密碼子編碼區(qū)之前加上kozak序列和表面標(biāo)簽hatag，將其連接到pqcxin逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體上，測序鑒定，最終構(gòu)建成kdm1a的質(zhì)粒，pqcxin空載體作為對照。質(zhì)粒構(gòu)建由北京中美太和有限公司提供服務(wù)。提取質(zhì)粒后酶切、測序鑒定。逆轉(zhuǎn)錄病毒對照空質(zhì)pqcxin，pqcxin-ha-kdm1a及相應(yīng)的包裝質(zhì)粒(vsvg和gpz)在293t細胞進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染72小時，收集上清，進行病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰箱。(2)病毒轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒及過表達kdm1a的慢轉(zhuǎn)錄病毒在6μg/mlpolybrene作用下轉(zhuǎn)染根尖牙乳頭干細胞12h，轉(zhuǎn)染后48h，抗菌素600ug/mlneromycin篩選10天得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，用westernblot在蛋白水平檢測kdm1a的表達，得到kdm1a過表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。2.2蛋白質(zhì)免疫共沉淀(co-ip)(1)過表達kdm1a以及對照組細胞總蛋白的提取1)棄培養(yǎng)基，用4℃預(yù)冷的5mlpbs漂洗細胞兩次，加入5mlpbs后，用細胞刮下培養(yǎng)皿中的細胞，收于15ml離心管，1100rpm離心6min；棄上清，加入1mlpbs重懸細胞，收于ep管，7200rpm離心2min；2)棄上清，以1:5(細胞：裂解液)體積比加裂解液(100ulco-ip+1ulpmsf+1ulpic)，冰上15min，每2-3min混懸一次；3)4℃，14000rpm離心15min，收集上清液于新ep管中，-80℃保存；(2)bradford法測定蛋白濃度1)bsa蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按說明依次用雙蒸水稀釋，使終濃度分別為1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；2)根據(jù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，按每孔加200ul1x考馬斯亮藍液，取1ul樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板中，室溫孵育5min，設(shè)副孔和空白孔；3)測定595nm波長的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度；4)根據(jù)蛋白濃度計算上樣體積，input組蛋白的上樣量為25μg，(pbs：pmsf：pic＝100：1:1)補齊體積至20ul；5)input組加入5ul4×loadingbuffer，95℃-99℃加熱變性10min，置于冰上10min，-20℃待用。(3)co-ip組蛋白處理：1)解液加入離心柱內(nèi)(蛋白量需達到400-600ug)。2)將anti-ha的瓊脂糖珠子混勻后取20ul加入離心柱內(nèi)，4℃翻轉(zhuǎn)搖床過夜。3)配置清洗液：0.05％的tbs-t(tbs+0.05％tween)；將翻轉(zhuǎn)過夜的離心柱松開上部蓋子，取下底部塞子，置于收集管內(nèi)，離心10s，棄收集管內(nèi)廢液。4)將離心柱重新置于收集管中，加入上述清洗液0.5ml，輕柔混勻，離心10s，棄收集管內(nèi)廢液，重復(fù)2-3次。5)將離心柱置于新的收集管中，加入25ul2xnon-reducingsamplebuffer，輕柔混勻，95℃-100℃加熱5分鐘，離心10s，松開底部塞子將液體收集到新的收集管內(nèi)，加入2ul巰基乙醇，-20℃保存待用。(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳1)準(zhǔn)備預(yù)成膠；2)上樣，以80v電壓電泳至溴酚藍電泳至分離膠，將電壓調(diào)到120v，直至溴酚藍到達分離膠底部，終止電泳；(5)染色1)取出整塊膠，放入1×考馬斯亮藍染色中，常溫染色1小時。2)冰醋酸脫色1小時3)掃描儀觀察共結(jié)合條帶。2.3蛋白質(zhì)譜分析(1)sds-page分離：膠上酶解：膠粒用50μl脫色液(50％乙腈，25mmol/l碳酸氫銨)，室溫放置30分鐘，吸去脫色液，重復(fù)以上步驟脫色至膠塊無色透明。抽真空離心干燥30分鐘左右至白色顆粒狀，加入2μl(濃度為10ng/μl)溶于20mm碳酸氫銨的胰蛋白酶4℃吸脹1小時，吸去多余的酶液，將管子倒置，37℃空氣浴過夜。每塊膠加入8μl5％三氟乙酸，40℃1小時，與前一次的提取液合并，抽真空離心干燥。(2)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜納流液相為thermoscientificeasy-nlc1000，流動相a為0.1％甲酸水溶液；溶液b為0.1％甲酸乙腈溶液。液相梯度設(shè)置為：4分鐘，8％b相；45分鐘，30％b相；55分鐘，90％b相；60分鐘，90％b相。質(zhì)譜儀為q-exactive，碰撞能量為27％hcd，分辨率設(shè)置為一級70000m/z200，二級17500m/z200，母離子掃描范圍為m/z300-1800，子離子掃描范圍起始位m/z100，數(shù)據(jù)依賴模式ms/ms，隔離窗口為1.6da，動態(tài)排除為60s；噴霧電壓為2.0kv，毛細管溫度為275℃，s-lens：55％。(3)使用proteomediscoverer1.4數(shù)據(jù)分析軟件對質(zhì)譜結(jié)果進行序列分析，磷酸化位點識別，數(shù)據(jù)庫為uniprot蛋白庫下載的p02662和p02663(alpha-s1-casein)和p37840(alpha-synuclein)的氨基酸序列構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫，使用sequest搜庫引擎，搜庫參數(shù)設(shè)置為：酶解位點為精氨酸(r)，賴氨酸(k)，允許有兩個漏切位點，允許一側(cè)非特異性酶解，固定修飾：半胱氨酸的carbamidomethylation。可變修飾：oxidation/+15.995da(m)，deamidated/+0.984da(n，q)，phospho/+79.966da(s，t，y)。2.4蛋白組分析驗證(1)蛋白質(zhì)免疫共沉淀：同實施例1至聚丙烯酰胺凝膠電泳完畢(2)轉(zhuǎn)膜：1)準(zhǔn)備預(yù)成膜；2)將電泳膠轉(zhuǎn)移至預(yù)成膜中，使用biorad半干轉(zhuǎn)進行轉(zhuǎn)膜；3)取出pvdf(polyvinylidenedifluoride,pvdf,聚偏二氟乙烯膜)膜，tbst漂洗5min；(3)westernblot濾膜雜交1)將轉(zhuǎn)印后的pvdf膜用5％脫脂奶粉封閉1小時；2)tbst漂洗10min×3次；3)取出濾膜，置于5％脫脂奶粉稀釋的一抗中，4℃搖床過夜；4)tbst洗膜，10min×3次；5)將濾膜置于5％脫脂奶粉稀釋的二抗中，室溫搖床孵育1小時；6)tbst洗膜，10min×3次；(4)顯色將pvdf膜放在保鮮膜上，加入顯影液，bio-rad化學(xué)發(fā)生成像系統(tǒng)中成像。2.5根尖牙乳頭干細胞plod2敲減質(zhì)粒構(gòu)建與病毒轉(zhuǎn)染(1)plod2敲減質(zhì)粒構(gòu)建由蘇州吉瑪公司服務(wù)構(gòu)建質(zhì)粒以及病毒包裝，滴度測定，-80℃分裝保存待用。lv3shrna(ocnsh)作為對照，plod2shrnas的目的序列為：5’-ggataatggctgcactctttg-3’(seqidno:20)(2)plod2慢病毒轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒及敲減plod2的慢轉(zhuǎn)錄病毒在6μg/mlpolybrene作用下轉(zhuǎn)染根尖牙乳頭干細胞12h，轉(zhuǎn)染后48h，綠色熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，抗菌素1ug/mlpuromycin篩選3天得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，用蛋白質(zhì)免疫印跡在蛋白水平檢測plod2的表達，得到敲減plod2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。2.6成骨/成牙誘導(dǎo)分化、alp活性、茜素紅染色、real-timepcr檢測成骨/成牙分化指標(biāo)方法同實施例13.統(tǒng)計分析采用spss22.2統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組計量資料比較采用t檢驗，p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。4、實驗結(jié)果1、scaps中kmd1a過表達效率體外利用逆轉(zhuǎn)錄病毒對scaps進行轉(zhuǎn)染，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過表達kdm1a的根尖牙乳頭干細胞。westernblot在蛋白質(zhì)水平檢測效率，發(fā)現(xiàn)可以有效的過表達kdm1a(圖10)。以上為三次獨立實驗重復(fù)結(jié)果2、免疫共沉淀及蛋白組質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)kdm1a共結(jié)合蛋白(1)考馬斯亮藍染色后可見kdm1a共結(jié)合蛋白條帶(圖11-a)，蛋白組質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)可能的共結(jié)合蛋白為plod2，分子量為80.609kda；scoremascot為337.4312987。(2)利用pierceha-tagip/co-ip試劑盒提取過表達kdm1a的scaps蛋白，免疫印跡驗證plod2能夠與kdm1a形成蛋白復(fù)合體(圖11-b)3、scaps中plod2的敲減效率體外利用慢病毒對scaps進行轉(zhuǎn)染，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的敲減plod2的根尖牙乳頭干細胞，對照組空載體ocnsh組。綠色熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染情況(圖12)，westernblot在蛋白質(zhì)水平檢測效率,發(fā)現(xiàn)可以將plod2有效的敲減(圖13)。4、敲減plod2對scaps成骨/成牙分化能力的影響對敲減plod2的scaps進行成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)第5天時檢測plod2sh和ocnsh組堿性磷酸酶活性發(fā)現(xiàn)plod2sh組明顯低于對照lv3組(圖14-a)。成骨誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色顯示plod2sh組片狀紅色著色，較對照組弱(圖14-b)；接著分別在成骨誘導(dǎo)第0天，7天，14天時提取plod2sh組和ocnsh組細胞rna，realtimepcr檢測成骨/成牙相關(guān)基因：bsp(圖15-a)、ocn(圖15-b)、dspp(圖15-c)、dmp-1(圖15-d)的表達，發(fā)現(xiàn)：在誘導(dǎo)1w時plod2組中bsp、ocn、dmp-1、dspp的表達均較ocnsh組增強，而在成骨/成牙誘導(dǎo)2w時bsp的表達在plod2sh和ocnsh組中無明顯差異，plod2sh組中ocn、dspp、dmp1的表達仍較ocnsh組明顯上調(diào)(圖15)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。gapdh為內(nèi)參。以上為三次獨立實驗重復(fù)結(jié)果。繼而檢測成骨/成牙關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子osx、runx2和dlx2的表達，realtimert-pcr結(jié)果顯示osx、runx2、dlx2在plod2sh組表達較ocnsh組升高(圖16)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。gapdh為內(nèi)參基因。以上為三次獨立實驗重復(fù)結(jié)果。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。sequencelisting<110>首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院<120>kdm1a的用途<130>mp1709585<160>20<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1aaataaaggtttgactcgtgg21<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2cggaccaatacgaccaaatccg22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3agccacatcgctcagacacc20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ggcactagtggcaggagaag20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gccaacaatcacatcgtcac20<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6caggccacgatattatctttaca23<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7ctcctcttcttcctcctcctc21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agcaaaggtgcagcctttgt20<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9gcgcctgggtctcttcact19<210>10<211>26<212>dna<213>人工序列<400>10cgacataggtcacaatgaggatgtcg26<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11ttgcttccagctacttgaggtc22<210>12<211>28<212>dna<213>人工序列<400>12cgtggacaaagaagatagcaactccacg28<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<400>13ttccggctctctatctcaatgttt24<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14cctcctcagctcaccttctc20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15gttgggagcccaaatagaaa20<210>16<211>23<212>dna<213>人工序列<400>16tcttagaacaaattctgcccttt23<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列<400>17tgctttggtcttgaaatcaca21<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18cctgagaaggaggaccttga20<210>19<211>19<212>dna<213>人工序列<400>19ttccggactttctttggct19<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列<400>20ggataatggctgcactctttg21當(dāng)前第1頁12