本發(fā)明涉及殼聚糖制備領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌功能化殼聚糖衍生物的制備方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖(β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-d-葡萄糖)是一種具有良好的生物相容性和生物可降解性的天然堿性多糖，由地球上儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素的天然有機(jī)化合物甲殼素脫乙酰后得到。殼聚糖因其特殊的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性而具有降低血糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制微生物生長(zhǎng)、吸濕保濕等諸多優(yōu)良功能，被稱為第六生命要素，在醫(yī)藥、食品、化工及環(huán)保等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。尤其是作為抗菌大分子，由于其生物相容性好、毒性低、可降解等特點(diǎn)成為近年來(lái)綠色天然抗菌劑開(kāi)發(fā)的研究熱點(diǎn)之一。但由于抗菌活性基團(tuán)氨基的活性較低，并且由于殼聚糖分子間存在較強(qiáng)的氫鍵作用導(dǎo)致的難溶和抗菌活性低等問(wèn)題，極大地限制了殼聚糖作為抗菌材料的推廣和應(yīng)用。
殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中含有的羥基、氨基等官能團(tuán)是引入其它功能基團(tuán)得到功能化殼聚糖衍生物的關(guān)鍵活性位點(diǎn)。通過(guò)控制與羥基或氨基的反應(yīng)條件，可對(duì)殼聚糖進(jìn)行如?；?、羧基化、醚化、烷基化、酯化、水解等功能化反應(yīng)[j.adv.drug.deliv.rev.,2001,50,591.]，從而改變其物理化學(xué)性能，賦予殼聚糖更多的特定功能，以適應(yīng)更多領(lǐng)域的需要，進(jìn)一步拓寬殼聚糖的應(yīng)用范圍。
胍基是目前自然界發(fā)現(xiàn)的正電性最強(qiáng)的生物活性有機(jī)堿，其在生理ph介質(zhì)中能夠質(zhì)子化，在中性、酸性和堿性條件下均能形成帶正電的基團(tuán)。胍基基團(tuán)具有抗炎癥、降壓降血脂、抗病毒、抗腫瘤等生物活性，同時(shí)具有強(qiáng)堿性、強(qiáng)穩(wěn)定性、較好的生物活性和抗菌性能。胍基化合物在天然產(chǎn)物中產(chǎn)量豐富，正電性、堿性以及溶解性均較強(qiáng)，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、建筑、服裝、化工等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。殼聚糖上的氨基具有較高的反應(yīng)活性，因此通過(guò)氨基對(duì)殼聚糖進(jìn)行胍基化改性賦予其與胍類化合物類似的性能，進(jìn)而提高殼聚糖的抑菌抗菌性能，在這方面的研究國(guó)內(nèi)外已有諸多報(bào)道(huy.,et.al.,carbohyd.polym.,2007,67,66；bioresourtechnol，2010，101，5693；zhaix.,et.al.,j.appl.polym.sci.,2011,121,3569.)。xiao等人在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)存在的條件下，使精氨酸與殼聚糖在2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)緩沖液中常溫反應(yīng)，得到了精氨酸改性的胍基功能化殼聚糖衍生物(xiaob.,et.al.,carbohyd.polym.,2011,83,144.)。然而，由于精氨酸中α氨基的存在，同樣可以和羧基活化后的氨基酸發(fā)生反應(yīng)，使得精氨酸自聚嚴(yán)重從而導(dǎo)致精氨酸改性所得的胍基功能化殼聚糖衍生物側(cè)鏈取代度低，并沒(méi)有充分改善殼聚糖的水溶性以及抑菌性能，這在很大程度上影響了其作為綠色天然抑菌劑的應(yīng)用。而作為肌酸前體物的胍基乙酸，是甘氨酸的胍基衍生物，常被用作飼料添加劑、有機(jī)合成中間體，因?yàn)槠浞肿又胁缓钚园被?，所含羧基具有一定的化學(xué)活性，在保證與殼聚糖分子上的氨基反應(yīng)的同時(shí)，又不會(huì)產(chǎn)生自聚，適合用于殼聚糖的抗菌功能化改性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種抗菌功能化殼聚糖衍生物的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
一種抗菌功能化殼聚糖衍生物的制備方法，殼聚糖與胍基乙酸進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，得到抗菌功能化的殼聚糖衍生物。
優(yōu)選地，包括以下步驟：
1)將殼聚糖溶解在稀酸溶液中，得到殼聚糖稀酸水溶液；
2)胍基乙酸進(jìn)行羧基活化；
3)將活化后的胍基乙酸混合液與殼聚糖稀酸水溶液混合，攪拌反應(yīng)；
4)向反應(yīng)液中加入鹽酸羥胺終止反應(yīng)；
5)反應(yīng)液過(guò)濾后在去離子水中透析，透析完成后進(jìn)行冷凍干燥處理，即得抗菌功能化殼聚糖衍生物。
優(yōu)選地，步驟1)中所述的殼聚糖數(shù)均分子量為102-107，脫乙酰度為50-99％。
優(yōu)選地，步驟1)中所述的稀酸為鹽酸或乙酸，酸的濃度為0.1-0.5m，殼聚糖溶液質(zhì)量百分比為0.1％-50％。
優(yōu)選地，步驟2)中胍基乙酸進(jìn)行羧基活化的具體條件為：
胍基乙酸在n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)存在的條件下，在2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)緩沖液中進(jìn)行活化；
優(yōu)選地，所述mes緩沖液的濃度為10-100mm，ph為4.5-7.5；
優(yōu)選地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)與胍基乙酸的物質(zhì)的量之比為0.5-5:1；
n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的物質(zhì)的量之比為1:1。
優(yōu)選地，步驟2)胍基乙酸進(jìn)行羧基活化的溫度為0-35℃，活化時(shí)間為0.5-3小時(shí)。
優(yōu)選地，步驟3)中胍基乙酸與殼聚糖的物質(zhì)的量之比為0.1-10:1。
優(yōu)選地，步驟3)中的反應(yīng)溫度應(yīng)為0-35℃，反應(yīng)時(shí)間為12-72小時(shí)。
優(yōu)選地，步驟4)中所述鹽酸羥胺與胍基乙酸的物質(zhì)的量之比為1:1。
優(yōu)選地，步驟5)中透析條件為每5-10小時(shí)換水一次，換水6-8次后，即完成透析。
本發(fā)明所述的一種優(yōu)選地方案如式1所示：
本發(fā)明的有益效果如下：
本發(fā)明所述的抗菌功能化殼聚糖衍生物的制備方法，使用胍基乙酸直接與殼聚糖進(jìn)行酰胺化，避免了傳統(tǒng)使用精氨酸進(jìn)行胍基功能化過(guò)程中氨基酸自聚的問(wèn)題。并且操作簡(jiǎn)單、條件溫和，所用主要原料殼聚糖與胍基乙酸來(lái)源廣泛，價(jià)格相對(duì)較低，無(wú)毒無(wú)害，生產(chǎn)過(guò)程中不會(huì)造成環(huán)境污染；反應(yīng)流程簡(jiǎn)單，并且由于后處理采用冷凍干燥技術(shù)，所得抗菌功能化的殼聚糖衍生物具有三維大孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于溶解過(guò)程中溶劑分子的快速滲入，提高了溶解性。利用該方法制備得到的抗菌功能化殼聚糖衍生物，在保證了產(chǎn)物較高生物安全性的同時(shí)提高了抗菌性和溶解性，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)以上發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
實(shí)施例1：
稱取0.1克殼聚糖加入到100毫升0.1m的稀鹽酸中，室溫下機(jī)械攪拌使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為0.1％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在冰水浴中活化3小時(shí)的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為10mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝4.5)20ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為10:1:5:5，于35℃下持續(xù)攪拌反應(yīng)12小時(shí)后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過(guò)濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔5小時(shí)換水一次，換水6次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率56％。
實(shí)施例2：
稱取1.0克殼聚糖加入到100毫升0.2m的稀鹽酸中，室溫下機(jī)械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為1.0％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在15℃下活化2小時(shí)的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為25mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝5.0)35ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為2:2:5:5，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時(shí)后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過(guò)濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔7小時(shí)換水一次，換水7次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率59％。
實(shí)施例3：
稱取10.0克殼聚糖加入到100毫升0.3m的稀鹽酸中，室溫下機(jī)械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為9.1％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在室溫下活化1小時(shí)的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為50mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝6.5)20ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為1:5:5:5，于15℃下持續(xù)攪拌反應(yīng)48小時(shí)后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過(guò)濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔8小時(shí)換水一次，換水6次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率63％。
實(shí)施例4：
稱取100克殼聚糖加入到100毫升0.5m的稀鹽酸中，50℃水浴下機(jī)械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為50％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在35℃下活化0.5小時(shí)的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為100mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝7.5)20ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為1:10:5:5，于冰水浴下持續(xù)攪拌反應(yīng)72小時(shí)后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過(guò)濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔10小時(shí)換水一次，換水8次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率45％。
實(shí)施例5：
稱取0.1克殼聚糖加入到100毫升0.1m的稀乙酸中，60℃水浴下機(jī)械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為0.1％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在冰水浴下活化3小時(shí)的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為10mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝4.5)30ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為10:1:5:5，于35℃下持續(xù)攪拌反應(yīng)72小時(shí)后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過(guò)濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔5小時(shí)換水一次，換水7次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率48％。
實(shí)施例6：
稱取1.0克殼聚糖加入到100毫升0.2m的稀乙酸中，60℃水浴下機(jī)械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為1.0％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在15℃下活化2小時(shí)的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為25mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝5.0)40ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為2:2:5:5，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)48小時(shí)后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過(guò)濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔7小時(shí)換水一次，換水6次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率58％。
實(shí)施例7：
稱取10.0克殼聚糖加入到100毫升0.3m的稀乙酸中，60℃油浴下機(jī)械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為9.1％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在室溫下活化1小時(shí)的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為50mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝6.5)50ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為1:5:5:5，于15℃下持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時(shí)后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過(guò)濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔8小時(shí)換水一次，換水7次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率55％。
實(shí)施例8：
稱取20.0克殼聚糖加入到100毫升0.5m的稀乙酸中，60℃油浴下機(jī)械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為16.7％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在35℃下中活化0.5小時(shí)的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為100mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝7.5)50ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為1:10:5:5，于冰水浴中持續(xù)攪拌反應(yīng)12小時(shí)后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過(guò)濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔10小時(shí)換水一次，換水8次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時(shí)后，放入凍干機(jī)直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率55％。