本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種枯草芽孢桿菌bbd012及防治番茄病害中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

番茄灰霉病是番茄上危害較重且常見的病害，各菜區(qū)都發(fā)生。除危害番茄外，還可危害害茄子、辣椒、黃瓜、瓠瓜等20多種作物。低溫、連續(xù)陰雨天氣多的年份危害嚴(yán)重。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)造成莖葉枯死和大量的爛花、爛果，直接影響產(chǎn)量。番茄灰霉病已成為我國(guó)保護(hù)地番茄生產(chǎn)的主要病害，灰霉病是由半知菌亞門真菌灰葡萄孢(botrytiscinerea)侵染所致。

番茄葉霉病由番茄葉霉病菌（fulviafulva）侵染所致，在番茄的葉、莖、花、果實(shí)上，都會(huì)出現(xiàn)癥狀，但是常見癥狀是發(fā)生在葉片上，初期在葉片背面出現(xiàn)一些退綠斑，后期變?yōu)榛疑蚝谧仙牟灰?guī)則形霉層，葉片正面在相應(yīng)的部位退綠變黃，嚴(yán)重時(shí)，葉片常出現(xiàn)干枯卷縮。從發(fā)病的順序看，經(jīng)常從植株下部向上蔓延、溫度從9℃到34℃之間，病原都能生長(zhǎng)發(fā)育，發(fā)育的最適溫度是20～25℃。在最適溫度且濕度較大(相對(duì)濕度在80%以上)時(shí)，僅需10天到半月就可普遍發(fā)病。

目前番茄抗病育種還沒有突破性進(jìn)展，國(guó)內(nèi)防治番茄灰霉病和葉霉病主要依靠化學(xué)藥劑。然而，長(zhǎng)期、連續(xù)用藥使灰霉病菌和葉霉病產(chǎn)生了抗藥性，導(dǎo)致化學(xué)藥劑防治效果逐年下降，并且化學(xué)藥劑殘留嚴(yán)重污染農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境，危及人畜健康。生物防治已經(jīng)成為控制病害的重要手段，而植物內(nèi)生細(xì)菌作為植物病害生物防治的潛在資源菌具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并且已經(jīng)顯示出很好的利用前景。枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)是一種嗜溫性的好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子，其抑制植物病原菌的范圍很廣，包括根部病害、枝干病害、葉、花部病害和收獲后果品病害，是一種理想的生防微生物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一株枯草芽孢桿菌bbd012，分類命名為枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）bbd012，保藏編號(hào)為cctccno：m2017097。

本發(fā)明的另一目的是提供一種防治番茄灰霉病和/或葉霉病制劑。

所述枯草芽孢桿菌bbd012可用于抑制番茄灰霉病菌和番茄葉霉病菌。

所述防治番茄灰霉病和/或葉霉病制劑為枯草芽孢桿菌bbd012培養(yǎng)液。

所述枯草芽孢桿菌bbd012培養(yǎng)液中含有菌落4×10⁸cfu·ml^–1。

所述枯草芽孢桿菌bbd012培養(yǎng)液的制備方法為：接種枯草芽孢桿菌bbd012單菌落于lb液體培養(yǎng)基中，28℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中160r·min^-1培養(yǎng)24h，采用無菌水將培養(yǎng)后所得菌液的菌落稀釋至4×10⁸cfu·ml^–1。

所述制劑治療和預(yù)防番茄灰霉病和/或葉霉病的方法，采用枯草芽孢桿菌bbd012培養(yǎng)液對(duì)番茄植株進(jìn)行噴霧，即將枯草芽孢桿菌bbd012培養(yǎng)液噴在番茄葉片的正反面。

有益效果

本發(fā)明的枯草芽孢桿菌bbd012篩選自白扁豆植株，該菌株在與宿主植物協(xié)同進(jìn)化的過程中，形成了穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系，內(nèi)生細(xì)菌可以通過自身產(chǎn)生或誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一些抗菌的物質(zhì)，或通過與植物病原菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)植物病害起到防治作用?？莶菅挎邨U菌bbd012對(duì)番茄灰霉病菌和葉霉病菌具有良好拮抗效果，且該菌株對(duì)三種桂花病菌（刺球殼、葡萄座腔菌、炭疽病菌）也有一定的拮抗作用，通過試驗(yàn)證實(shí)枯草芽孢桿菌bbd012菌對(duì)番茄灰霉病和葉霉病的的防治效果分別達(dá)到64.9%和58.0%，具有很好的防病效果。

生物材料的保藏

一株枯草芽孢桿菌bbd012，分類命名為枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）bbd012，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位簡(jiǎn)稱為cctcc，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為cctccno：m2017097，保藏日期為2017年3月8日。

附圖說明

圖1是本發(fā)明枯草芽孢桿菌bbd012對(duì)番茄葉霉病菌的抑菌效果圖；

圖2是本發(fā)明枯草芽孢桿菌bbd012對(duì)番茄灰霉病菌抑菌效果的圖；

圖中：左為對(duì)照，右為抑菌效果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

采用預(yù)防番茄灰霉病的制劑進(jìn)行盆栽番茄防治：

步驟一、接種枯草芽孢桿菌bbd012單菌落于200mllb液體培養(yǎng)基中，28℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中160r.min^-1培養(yǎng)24h，將所培養(yǎng)的菌液稀釋至4×10⁸cfu.ml^–1，制備出預(yù)防番茄灰霉病的制劑；

步驟二、取長(zhǎng)至5-6葉，長(zhǎng)勢(shì)一致的盆栽番茄，用治療和預(yù)防番茄灰霉病制劑噴霧至番茄葉片正反面，以清水作為對(duì)照，24h后將番茄灰霉病菌的孢子懸浮液1×10⁷個(gè)孢子/ml（將少許無菌水注入已長(zhǎng)滿灰霉病菌的pda平板內(nèi)，將瓊脂表面的孢子刮下，倒入無菌容器內(nèi)，充分振蕩后用滅菌的紗布過濾，于血球計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)）噴霧接種其上。番茄植株培養(yǎng)于人工氣候箱（23℃，r≧90%）中。每個(gè)處理3盆，每盆3株，重復(fù)3次。接種后7d調(diào)查番茄的發(fā)病情況，病情分級(jí)采取5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。0級(jí)：無病斑，葉片無癥狀，植株健康；1級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的10%以下；2級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的10%-50%；3級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的50%以上；4級(jí)：植株死亡。

病情指數(shù)=100×[σ（各級(jí)病葉數(shù)×病害級(jí)別數(shù)）]/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×4）防治效果（%）=[（對(duì)照病情指數(shù)-拮抗菌株處理后病情指數(shù)）]/對(duì)照病情指數(shù)]×100

結(jié)果表明：噴霧治療和預(yù)防番茄灰霉病制劑的番茄植株比用清水處理的病情指數(shù)降低23.1，防治效果為64.9%（見表1）。

表1枯草芽孢桿菌bbd012對(duì)番茄灰霉病的防治效果

實(shí)施例2

采用預(yù)防番茄葉霉病的制劑進(jìn)行盆栽番茄防治：

步驟一、接種枯草芽孢桿菌bbd012單菌落于200mllb液體培養(yǎng)基中，28℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中160r.min^-1培養(yǎng)24h，將所培養(yǎng)的菌液稀釋至4×10⁸cfu.ml^–1，制備出預(yù)防番茄灰霉病的制劑；

步驟二、取長(zhǎng)至5-6葉，長(zhǎng)勢(shì)一致的盆栽番茄，用治療和預(yù)防番茄灰霉病制劑噴霧至番茄葉片正反面，以清水作為對(duì)照，24h后將番茄灰霉病菌的孢子懸浮液1×10⁷個(gè)孢子/ml（將少許無菌水注入已長(zhǎng)滿灰霉病菌的pda平板內(nèi)，將瓊脂表面的孢子刮下，倒入無菌容器內(nèi)，充分振蕩后用滅菌的紗布過濾，于血球計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)）噴霧接種其上。番茄植株培養(yǎng)于人工氣候箱（23℃，r≧90%）中。每個(gè)處理3盆，每盆3株，重復(fù)3次。接種后7d調(diào)查番茄的發(fā)病情況，病情分級(jí)采取5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。0級(jí)：無病斑，葉片無癥狀，植株健康；1級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的10%以下；2級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的10%-50%；3級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的50%以上；4級(jí)：植株死亡。

病情指數(shù)=100×[σ（各級(jí)病葉數(shù)×病害級(jí)別數(shù)）]/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×4）防治效果（%）=[（對(duì)照病情指數(shù)-拮抗菌株處理后病情指數(shù)）]/對(duì)照病情指數(shù)]×100

結(jié)果顯示：接種bbd012菌株后接種番茄葉霉病菌的番茄植株比用清水處理的病情指數(shù)降低17.7，防治效果為58.0%（見表2）。

表2：枯草芽孢桿菌bbd012對(duì)番茄葉霉病的防治效果

實(shí)施例3

枯草芽孢桿菌bbd012菌株的篩選、分離和純化:

步驟一、培養(yǎng)基的制備：

細(xì)菌平板培養(yǎng)用lb培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；氯化鈉10g/l；瓊脂粉18g/l），液體培養(yǎng)用lb液體培養(yǎng)基（不加瓊脂粉），真菌培養(yǎng)及平板對(duì)峙試驗(yàn)用pda培養(yǎng)基（馬鈴薯200g/l；葡萄糖20g/l；瓊脂粉18g/l）。

步驟二、采集健康白扁豆植株的葉片3g，在75%的酒精中浸泡30s，然后用1%的次氯酸鈉消毒3min，用無菌蒸餾水沖洗5次后，取最后一次的沖洗液200μl涂布于lb培養(yǎng)基平板上；消毒后的葉片于無菌的研缽中研磨，加入5ml無菌蒸餾水混勻，取研磨液200μl，涂布于lb培養(yǎng)基平板上。在28℃下培養(yǎng)，逐日觀察，如最后一次沖洗液涂布的培養(yǎng)基中無菌落，研磨液涂布的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌落是內(nèi)生菌，進(jìn)行純化培養(yǎng)后，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟三、拮抗活性測(cè)定

番茄灰霉病菌、番茄葉霉病菌、桂花葉斑病菌(刺球殼)、桂花炭疽病菌和桂花葉斑病菌（葡萄座腔菌）活化培養(yǎng)，制成8mm的菌餅放置于pda培養(yǎng)基中心，四周40mm處分別放置四片8mm大小含有內(nèi)生細(xì)菌的濾紙片，置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4~5天，測(cè)量抑菌圈半徑并計(jì)算抑菌率。

結(jié)果顯示從健康白扁豆的葉片中共分離出19株內(nèi)生細(xì)菌，其中分離得到的bbd012抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)番茄葉霉病菌抑菌率達(dá)65.32%，圖1；對(duì)番茄灰霉病菌抑菌率達(dá)79.52%，圖2；對(duì)其他三種病原菌也有一定程度的抑制作用，表3。

表3菌株bbd012發(fā)酵液對(duì)5種病原真菌的抑菌率

步驟四、強(qiáng)拮抗內(nèi)生菌株的鑒定

1、形態(tài)及生理生化鑒定

方法參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(buchanan＆gibbons，1984)和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠和蔡妙英，1999)。

1）形態(tài)特征

菌株bbd012細(xì)胞為桿狀、單生、鞭毛周生，革蘭氏染色陽性。菌落呈白色、不透明，邊緣不規(guī)則。

2）生理生化特征

菌株bbd012為好氧菌，不能運(yùn)動(dòng)，可以利用蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，但不能利用乳糖，可以水解淀粉和明膠，可分解牛奶產(chǎn)酸，檸檬酸鹽試驗(yàn)、v-p試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)和接觸酶試驗(yàn)呈陽性，苯丙氨酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)呈陰性，最適生長(zhǎng)ph7.0，最適生長(zhǎng)溫度30℃。

2、16srdna和gyra基因序列測(cè)定

以細(xì)菌基因組dna快速抽提試劑盒（上海生工生物工程公司refb518225-0050）提取的菌株bbd012基因組dna為模板。16srdnapcr擴(kuò)增采用引物16sl：5'-acggctaccttgttacgacct-3'（其序列如seqidno:1）和引物16sr：5'-agagtttgatcctggctcag-3'（其序列如seqidno:2）。gyra基因pcr擴(kuò)增采用引物gyra-f：cgatcaggaaatgcgtacgtcctt（其序列如seqidno:3）和引物gyra-r：caaggtaatgctccaggcattgct（（其序列如seqidno:4））。反應(yīng)體系(50μl)：10×buffer5.0μl、dntps(2.5mmol·l^-1)4.0μl、引物16sr(10pmol·l^-1)2.0μl、引物16sl(10pmol·l^-1)2.0μl、taq酶(5u·μl^-1)0.5μl、模板dna(50ng·μl^-1)2μl、ddh2o34.5μl。pcr反應(yīng)程序:94℃5min，94℃1min，50℃1min，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。將pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物工程公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用blast軟件從genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)出相關(guān)菌株的16srdna序列和gyra基因序列，分別用clustalwv1.82軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，之后用mega4.1軟件進(jìn)行序列分析，采用鄰接法(neighbor-joining，nj法)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和同源性比較。

結(jié)果顯示：菌株bbd012的16srdna（基因序列如seqidno：5所示）和gyra基因序列（如seqidno：6所示）與bacillussubtilis同源性均高達(dá)99%。結(jié)合其形態(tài)特征、生理生化特性、16srdna和gyra基因序列分析，將該菌株鑒定為b.subtilisbbd012。

sequencelisting

<110>河南科技大學(xué)

<120>一株枯草芽孢桿菌bbd012及防治番茄病害中的應(yīng)用

<130>1

<160>6

<170>patentinversion3.3

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<213>枯草芽孢桿菌

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<213>枯草芽孢桿菌

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