本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株的篩選方法。

背景技術(shù)：

隨著近代生物學技術(shù)的不斷進步，相關(guān)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)擁有了更加廣闊的發(fā)展前景，同時快速發(fā)展的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對相應(yīng)的高產(chǎn)高效抗生素藥物的需求量也日益增加。

多氧霉素(polyoxin)是一種重要的核苷肽類抗生素，由于它的結(jié)構(gòu)與幾丁質(zhì)合成酶的天然底物udp-n-乙酰葡萄糖胺相似，因此它能夠競爭性地抑制幾丁質(zhì)的合成，從而抑制真菌的生長。多氧霉素是一種高效、低毒、無環(huán)境污染的安全農(nóng)藥，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，對稻瘟病、梨黑斑病、蘋果斑點落葉病和白粉病、煙草赤星病、蔬菜白粉病、菌核病等真菌性植物病害有良好防治作用。

在微生物菌種選育過程中，誘變育種是主要方法之一。它利用物理或化學誘變劑處理微生物細胞群，促進其在非自然條件下隨機突變頻率大幅度提高，然后用簡便、快速、高效的篩選方法，從中挑選符合育種要求的突變株(高產(chǎn)株或有效組分高產(chǎn)株)。

多氧霉素(polyoxin)是含有a～n14種不同同系物的混合物，各主要組份的作用又不相同，其中多氧霉素i組分(polyoxini)對煙草赤星菌具有抑制作用，但是polyoxini在多氧霉素中的含量較低，因此要提高多氧霉素對煙草赤星菌的抗菌作用，必須提高polyoxini的含量，目前還沒有相關(guān)技術(shù)公開。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有菌株多氧霉素i組分含量較低的技術(shù)問題，提供一種多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株的篩選方法，通過誘變育種篩選得到多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株。

為此，本發(fā)明提供一種多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株的篩選方法，其包括以下步驟：

步驟1、將多氧霉素出發(fā)菌株圈卷產(chǎn)色鏈霉菌野生型p0接種于斜面培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)，所述斜面培養(yǎng)基包括以下成份，單位為g/l：可溶性淀粉：15～25；kno3：0.8～1.2；k2hpo4：0.3～0.8；mgso4·7h2o：0.3～0.8；nacl：0.3～0.8；feso4·7h2o：0.008～0.012；瓊脂：15～25；

步驟2、挑選步驟1培養(yǎng)的孢子，并加入生理鹽水，制成孢子懸液；

步驟3、按步驟1所述培養(yǎng)基配制不同濃度的5-氟尿嘧啶的孢子培養(yǎng)基，5-氟尿嘧啶濃度，分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1，單位為g/l；

步驟4、將步驟1所述的野生型菌株p0作為出發(fā)菌株，分別涂布于步驟3所述的不同濃度的5-氟尿嘧啶孢子培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)；

步驟5、根據(jù)步驟4所述的孢子生長情況，選擇3種不同濃度的5-氟尿嘧啶孢子培養(yǎng)基，其濃度分別為0.1、0.3、1，單位為g/l；

步驟6、將步驟2所述的孢子懸液稀釋，取3～5ml稀釋后的孢子懸液置于無菌平板中，放置于紫外誘變箱中進行照射；

步驟7、將步驟6所述的無菌平板取出，將其上的孢子懸液稀釋，并分別涂布于步驟5所述的3種不同濃度的5-氟尿嘧啶孢子培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)；

步驟8、挑選步驟7培養(yǎng)的突變后的單菌落，接種于步驟1所述的斜面培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)；

步驟9、將步驟8培養(yǎng)的菌落接種到種子培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)，所述種子培養(yǎng)基包括以下成份，單位為g/l：酵母提取物：8～12；胰蛋白胨：12～18；kno3：0.8～1.2；k2hpo4：0.3～0.8；mgso4·7h2o：0.3～0.8；nacl：0.3～0.8；feso4·7h2o：0.008～0.012；

步驟10、將步驟9培養(yǎng)的菌落按菌落與發(fā)酵培養(yǎng)基體積百分比8～12％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，同時以步驟4所述的出發(fā)菌株做對照，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下成份，單位為g/l：淀粉：40～60；豆粕粉：20～28；酵母提取物：3～8；甘露醇：3～8；nacl：3～8；nh4so4：0.3～0.8；caco3：1～5；

步驟11、對步驟10的發(fā)酵產(chǎn)物中多氧霉素組分變化進行檢測，篩選與出發(fā)菌株p0次級代謝組分有差異的菌株；

步驟12、對步驟11篩選的菌株進行檢測，篩選出多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株。

優(yōu)選的，步驟1斜面培養(yǎng)基包括以下成份，單位為g/l：可溶性淀粉：20；kno3：1；k2hpo4：0.5；mgso4·7h2o：0.5；nacl：0.5；feso4·7h2o：0.01；瓊脂：20；所述斜面培養(yǎng)基的ph值為7.0。

優(yōu)選的，步驟9中，種子培養(yǎng)基包括以下成份，單位g/l：酵母提取物：10；胰蛋白胨：16；kno3：1；k2hpo4：0.5；mgso4·7h2o：0.5；nacl：0.5；feso4·7h2o：0.01；所述種子培養(yǎng)基的ph值為7.0。

優(yōu)選的，步驟10中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下成份，單位為g/l：淀粉：50；豆粕粉：25；酵母提取物：5；甘露醇：5；nacl：5；nh4so4：0.5；caco3：2；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為7.1。

優(yōu)選的，步驟6中紫外誘變，紫外光的波長為253.5nm，紫外燈的功率為15w，紫外誘變箱與無菌平板的垂直距離為30cm，紫外光照射時間為5～10s。

優(yōu)選的，步驟1的培養(yǎng)為在溫度29℃的條件下培養(yǎng)5～7天。

優(yōu)選的，步驟7的培養(yǎng)為溫度28℃暗處培養(yǎng)10～14天。

優(yōu)選的，步驟8的培養(yǎng)為溫度28℃培養(yǎng)7天；所述步驟9所述的培養(yǎng)為在29℃、轉(zhuǎn)速250rpm恒溫搖床培養(yǎng)20～36h。

優(yōu)選的，步驟10的培養(yǎng)為在29℃、轉(zhuǎn)速250rpm恒溫搖床培養(yǎng)3～7天。

本發(fā)明同時提供一種多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株的應(yīng)用，所述多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株發(fā)酵液對煙草赤星菌具有抑菌作用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明提供了一種多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株的篩選方法及其應(yīng)用，篩選得到多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株的發(fā)酵液主要成分為多氧霉素i組分，其發(fā)酵液對煙草赤星菌具有抑菌作用。本發(fā)明的篩選方法可以理性快速地篩選高產(chǎn)菌株，簡單易行，所涉及的培養(yǎng)基原料成本低、來源廣，具有十分重要的工農(nóng)業(yè)應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖1為出發(fā)菌株p0發(fā)酵液hplc分析圖譜。

圖2為多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株發(fā)酵液hplc分析圖譜。

圖3為出發(fā)菌株p0發(fā)酵液hplc-hrms分析圖譜。

圖4為多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株發(fā)酵液hplc-hrms分析圖譜。

圖5為多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株發(fā)酵液對煙草赤星菌的抗菌活性實驗。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所描述的本發(fā)明。

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。

實施例1：原始菌株p0孢子制備。

1、取多氧霉素出發(fā)菌株圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesansochromogenes)野生型p0(該菌種購自于中國科學院成都生物研究所)接種于斜面培養(yǎng)基。在溫度29℃的條件下培養(yǎng)7天，挑選斜面培養(yǎng)基上的孢子，加入生理鹽水，制成孢子懸液。斜面培養(yǎng)基(100ml)，按質(zhì)量體積比計，其成分為：可溶性淀粉：2g；kno3：0.1g；k2hpo4：0.05g；mgso4·7h2o：0.05g；nacl：0.05g；feso4·7h2o：0.001g；瓊脂：2g；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph值至7.0。

2、用野生型菌株p0作為出發(fā)菌株。首先，確定5氟尿嘧啶對p0菌株的最低抑菌濃度。配制含有不同濃度5-氟尿嘧啶的孢子培養(yǎng)基(5-氟尿嘧啶濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1mg/ml)，分別涂布p0孢子，培養(yǎng)7天。0.1mg/ml濃度基本可以抑制絕大部分孢子的生長，0.3mg/ml濃度的5-氟尿嘧啶基本可以完全抑制p0的生長，因此選用含有0.1mg/ml、0.3mg/ml和1mg/ml三個濃度的5-氟尿嘧啶孢子培養(yǎng)基。

實施例2：多氧菌素出發(fā)菌株p0紫外誘變。

將孢子懸液稀釋至10⁷/ml，取3ml混勻的單孢子懸液置于無菌平板中，放置于已預(yù)熱20min的紫外誘變箱中進行照射，時間為5s～10s。其中，紫外光的波長為253.5nm，紫外燈的功率為15w，紫外誘變箱與無菌平板的垂直距離為30cm。

紫外線誘變處理后，為防止可見光下恢復(fù)突變，用黑紙包裹平板，避光靜置2小時。

取出后在紅光下進行梯度稀釋(10^-1～10^-5)，再分別以從低濃度到高濃度的順序涂布于含有0.1mg/ml、0.3mg/ml和1mg/ml3個不同濃度5-氟尿嘧啶的孢子斜面培養(yǎng)基平板中，28℃暗處培養(yǎng)10-14天，待單菌落長出。

同時，未經(jīng)紫外處理的孢子要進行平行實驗，作為對照。

實施例3：誘變子發(fā)酵篩選及發(fā)酵液分析。

挑選100株突變后單菌落劃線于新的斜面培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)7天，待孢子長好。接種0.5cm²到種子培養(yǎng)基，250rpm，29℃，培養(yǎng)1天；然后按10％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，同時以出發(fā)菌株做對照，在29℃，轉(zhuǎn)速250rpm的搖床，培養(yǎng)5天，到衰亡期停止發(fā)酵。

種子培養(yǎng)基(100ml)，按質(zhì)量體積比計，其成分為：酵母提取物1.0g；胰蛋白胨：1.6g；kno3：0.1g；k2hpo4：0.05g；mgso4·7h2o：0.05g；nacl：0.05g；feso4·7h2o：0.001g；培養(yǎng)基的ph值為7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(100ml)，按質(zhì)量體積比計，其成分為：淀粉：5g；豆粕粉：2.5g；酵母提取物：0.5g；甘露醇：0.5g；nacl：0.5g；nh4so4：0.05g；caco3：0.2g；培養(yǎng)基的ph值為7.1。

用hplc(高效液相色譜)檢測發(fā)酵產(chǎn)物中多氧霉素組分變化，通過峰形的增減與相對峰面積變化篩選與出發(fā)菌株p0次級代謝組分有差異的菌株。

樣品處理：取1ml發(fā)酵液，10000rpm，離心5分鐘，取上清200μl，加入200μl超純水，稀釋1倍。加入80μl含0.5％三氟乙酸的甲醇，充分混勻后，最高轉(zhuǎn)速(14000rpm)離心10分鐘。取上清400μl于hplc進樣瓶中。

hplc條件：色譜柱采用thermo250mm，4.6μmc18色譜柱。hplc流動相為10％甲醇(含0.1％三氟乙酸)，檢測波長為260nm。進樣體積5ul。每個樣品采集時間15分鐘。

圖1為出發(fā)菌株p0發(fā)酵液hplc分析圖譜。圖2為篩選出的多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株發(fā)酵液hplc分析圖譜。圖2跟圖1比較，峰形的增減與相對峰面積都發(fā)生了比較大的變化，可見，篩選出的菌株次級代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化。

用hplc-hrms對篩選出的菌株進行檢測，對ms總離子流提取多氧霉素各個組分的分子離子峰，篩選出多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株。

樣品處理與hplc條件相同。

hplc-hrms條件：色譜柱采用waters150mm，2μmc18色譜柱。梯度洗脫：0～5min，10％甲醇(含0.1％甲酸)；5-20min，10％～100％甲醇(含0.1％甲酸)；20～30min，100％甲醇(含0.1％甲酸)。進樣體積2ul，采集正離子。每個樣品采集時間30分鐘。

圖3為出發(fā)菌株p0發(fā)酵液hplc-hrms分析圖譜。通過定量分析，原始菌株發(fā)酵液中主要組分為多氧霉素a、多氧霉素b、多氧霉素f、多氧霉素h四個組分，而多氧霉素i組分幾乎不產(chǎn)生。圖4為篩選出的多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株發(fā)酵液hplc-hrms分析圖譜。通過定量分析，多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株發(fā)酵液中多氧霉素i組分占主要成分，其它組分均降低到比較低的水平。

用hplc-hrms(高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用)對篩選出的菌株進行檢測，對hrms總離子流提取多氧霉素各個組分的分子離子峰，篩選出多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株。

通過hplc和hplc-hrms對多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株發(fā)酵液中多氧霉素組分進行相對定量分析，檢測結(jié)果為其主要成分為多氧霉素i組分，多氧霉素i組分組分效價為4.2g/l。

實施例4：利用牛津杯法，測定多氧霉素i組分高產(chǎn)菌株發(fā)酵液對煙草赤星菌的抑菌活性。

(1)煙草赤星菌菌懸液的制備：接種煙草赤星菌于pdb(土豆100g，葡萄糖10g，蒸餾水500ml，ph自然)中，30℃、200rpm、培養(yǎng)2天。收集培養(yǎng)液，用勻漿機將培養(yǎng)液中球狀煙草赤星菌菌絲體打碎，使整個培養(yǎng)液達到均一懸液狀態(tài)，即為煙草赤星菌菌懸液。

(2)雙層平板的制備：在無菌平板中倒入20ml80℃的pda瓊脂培養(yǎng)基(土豆100g，葡萄糖10g，瓊脂10g，蒸餾水500ml，ph自然)，平放于工作臺面上，待其完全冷卻，即為底層培養(yǎng)基。取5ml50℃水浴中保溫的pda培養(yǎng)基。按4％的接種量加入煙草赤星菌菌懸液，混合混勻后，倒入底層培養(yǎng)基上，晃動平板使培養(yǎng)基均勻鋪開。

(3)抑菌活性的檢測：在雙層平板中均勻放置4個牛津杯，其中1個牛津杯加入200μlpdb培養(yǎng)基作為對照，其它3個牛津杯加入200μl多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株發(fā)酵液離心上清液。將平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。圖5顯示，加入多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株發(fā)酵液離心上清液的牛津杯周圍有明顯的抑菌圈生成，說明多氧霉素i組分(polyoxini)高產(chǎn)菌株發(fā)酵液對煙草赤星菌具有抑制作用。