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      一種含有二氫吡啶結(jié)構(gòu)的β-欖香烯衍生物及其制備方法和用途與流程

      文檔序號:11191481閱讀:510來源:國知局
      本發(fā)明涉及新藥研發(fā)及醫(yī)藥
      技術(shù)領(lǐng)域
      ,具體涉及一類新型的含有二氫吡啶結(jié)構(gòu)的β-欖香烯衍生物,特別涉及通過腦靶向機(jī)制設(shè)計的含有二氫吡啶結(jié)構(gòu)的β-欖香烯衍生物,這些β-欖香烯衍生物能較好地透過血腦屏障并在腦腫瘤部位釋放出原藥。本發(fā)明還公開了這些具有腦靶向功能的β-欖香烯衍生物的制備方法和這些新型衍生物用于治療膠質(zhì)瘤的用途。技術(shù)背景神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤,也稱為膠質(zhì)細(xì)胞瘤,是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半,廣義是指所有神經(jīng)上皮來源的腫瘤,狹義是指源于各類膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤。膠質(zhì)瘤大多發(fā)病緩慢,自出現(xiàn)癥狀至就診時間一般為數(shù)周至數(shù)月,少數(shù)可達(dá)數(shù)年。近30年來,原發(fā)性惡性腦腫瘤發(fā)生率逐年遞增,年增長率約為1.2%,中老年人群尤為明顯。據(jù)文獻(xiàn)報道,中國腦膠質(zhì)瘤年發(fā)病率為3-6人/10萬人,年死亡人數(shù)達(dá)3萬人。膠質(zhì)瘤系浸潤性生長物,它和正常腦組織之間沒有明顯界限,難以完全切除,對放療化療不甚敏感,非常容易復(fù)發(fā),生長在大腦等重要部位的良、惡性腫瘤,手術(shù)難以切除或根本不能手術(shù)?;瘜W(xué)藥物和一般抗腫瘤的中藥,因血腦屏障等因素的影響,療效也不理想,因此腦膠質(zhì)瘤至今仍是全身腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一。因此,開發(fā)易于透過血腦屏障的抗腫瘤藥物,使其能集中在腦部選擇性殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有重要的意義。溫莪術(shù),又名溫郁金、黑郁金,是一種具有抗腫瘤活性的多年生姜科植物。其根部含有非常豐富的揮發(fā)油,其中以倍半萜類烯烴及其衍生物為主。欖香烯(elemene),就是從溫莪術(shù)揮發(fā)油中分離得到的一種倍半萜類化合物。目前,共分離鑒定出5種構(gòu)型類型的欖香烯,包括α-欖香烯、β-欖香烯、δ-欖香烯和γ-欖香烯等成分,其中β-欖香烯(β-elemene)含量較多,也是最主要的抗腫瘤活性成分。欖香烯作為我國自行研制的二類抗腫瘤新藥,目前己用于臨床多年,并取得了較好的治療效果,其主要劑型包括脂質(zhì)體口服液以及脂質(zhì)體注射液。臨床應(yīng)用的欖香烯實為一種混合物,其中β-欖香烯為主要成分,在幾種主要成分中抗腫瘤活性最強(qiáng),發(fā)揮最主要的抗腫瘤作用。臨床上單獨使用欖香烯主要用于治療癌性胸腹水及不能手術(shù)、不能耐受放化療的中晚期肺癌、肝癌、食道癌、鼻咽癌、腦瘤、婦科腫瘤、骨轉(zhuǎn)移癌、胃癌、白血病等癌癥,可延長患者生存期、提高生活質(zhì)量。近年來,越來越多的研究表明欖香烯對膠質(zhì)瘤具有較好的治療效果,羅其中等人研究發(fā)現(xiàn)欖香烯對c6、u251和shg-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞均具有明顯的抑制增殖作用。相比之下,在相同藥物濃度鼠源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞c6較人源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞u251及shg-44敏感。欖香烯對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)呈劑量依賴性,隨著藥物濃度和藥物作用時間的增加,抑制效應(yīng)增強(qiáng)。欖香烯能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞集落形成,當(dāng)濃度達(dá)到20mg/l~40mg/l以上時,幾乎完全抑制了腫瘤細(xì)胞克隆集落的形成。馮海濱等人研究發(fā)現(xiàn)欖香烯及臨床膠質(zhì)瘤治療藥物替莫唑胺均具有抗膠質(zhì)瘤增殖的作用,欖香烯對u87gslc的生長抑制作用強(qiáng)于u87,提示相比于普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞,欖香烯可能對gslc具有更高的敏感性,而替莫唑胺在體外細(xì)胞實驗中表現(xiàn)為對u87敏感性高于u87gslc,兩者聯(lián)合應(yīng)用可提高替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖效果,作用效果表現(xiàn)為協(xié)同作用。綜合前人研究發(fā)現(xiàn),開發(fā)β-欖香烯為抗膠質(zhì)瘤藥物具有較好的前景。但β-欖香烯的結(jié)構(gòu)中只含有碳、氫兩種元素,屬揮發(fā)油類,脂溶性強(qiáng),在水中幾乎不溶。這些理化性質(zhì)特點,導(dǎo)致欖香烯在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出一定的副作用。由于欖香烯親脂性過強(qiáng),親水性過弱,也使其不易被人體吸收,導(dǎo)致生物利用度很低。而過強(qiáng)的親脂性導(dǎo)致其不能很好地透過血腦屏障,也無法在腦部位聚集發(fā)揮應(yīng)有的藥效。為了克服以上不足,使β-欖香烯能更好地透過血腦屏障,并使其能在腦中長時間駐留,發(fā)揮藥效。本項目擬采用腦靶向設(shè)計策略,在β-欖香烯結(jié)構(gòu)中引入二氫吡啶結(jié)構(gòu),從而達(dá)到靶向治療膠質(zhì)瘤的目的。二氫吡啶載體介導(dǎo)的腦靶向前藥化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于煙酰胺腺嘌呤氫化二核苷,能被nadh-nad+氧化還原輔酶所識別并快速氧化成相應(yīng)的吡啶季胺鹽,由于該輔酶催化氧化還原系統(tǒng)在全身分布不一致,其中腦組織較外周循環(huán)系統(tǒng)少,故腦中的生成時間較血漿組織中緩慢。吡啶季胺鹽的強(qiáng)親水性特點使其在外周組織中被迅速清除,而腦中緩慢生成的吡啶鎓鹽則難以通過血腦屏障,被“封鎖”于腦內(nèi),在水解酶的作用下緩慢水解釋放出原藥,同時裂解的小分子載體沒有神經(jīng)毒性,也可從腦內(nèi)被清除。這種相對穩(wěn)定的腦靶向遞藥系統(tǒng)可使原藥緩慢釋放并云集于腦內(nèi),從而發(fā)揮應(yīng)有的藥效。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的旨在尋找活性好,易于透過血腦屏障,靶向膠質(zhì)瘤的β-欖香烯新藥候選化合物,并進(jìn)一步提供一種治療膠質(zhì)瘤的藥物組合物。本發(fā)明立足天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造,依據(jù)藥物化學(xué)中的腦靶向設(shè)計原理,連接具有腦靶向性的二氫吡啶結(jié)構(gòu)用以提高β-欖香烯對膠質(zhì)瘤的靶向性,設(shè)計獲得新型含有二氫吡啶結(jié)構(gòu)的β-欖香烯衍生物,為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:具有如下結(jié)構(gòu)的β-欖香烯化合物:如上所述的腦靶向藥物含有二氫吡啶結(jié)構(gòu),在到達(dá)腦腫瘤部位后能能被nadh-nad+氧化還原輔酶所識別并快速氧化成相應(yīng)的吡啶季胺鹽,而被駐留在腦內(nèi),進(jìn)而在水解酶的作用下緩慢水解釋放出原藥欖香烯,發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用。上述具有腦靶向功能的β-欖香烯衍生物可用以上合成路線得到,其合成具體步驟概述如下:首先以β-欖香烯為原料,將其與次氯酸鈉發(fā)生氯代反應(yīng),生成13-氯-β-欖香烯、14-氯-β-欖香烯以及13,14-二氯-β-欖香烯混合物。將混合物用石油醚洗脫,通過硅膠柱層析,得到單氯代混合產(chǎn)物a。將單氯代混合物a接著與無水醋酸鈉反應(yīng)生成13位和14位乙酯化產(chǎn)物混合物b。將b進(jìn)一步在koh條件下水解,即可制得13-β-欖香醇和14-β-欖香醇混合物c(比例為6∶1)。將混合物c通過hplc制備分離的方法,得到單一的13-β-欖香醇d。最后將d與二氫吡啶片段進(jìn)行連接得到目標(biāo)產(chǎn)物e。藥理試驗證明,本發(fā)明的13-β-欖香烯吡啶衍生物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較好的選擇性,相比于欖香烯有著更好的抗腫瘤作用,可以用于進(jìn)一步制備抗膠質(zhì)瘤藥物。下面是本發(fā)明部分化合物的體外抗人類多種腫瘤增殖活性的藥理實驗結(jié)果:實驗設(shè)備與試劑儀器超凈工作臺(蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公司)恒溫co2培養(yǎng)箱(日本sanyo)酶聯(lián)免疫檢測儀(美國bio-rad)倒置生物顯微鏡(日本olympus)試劑青、鏈霉素混合液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)胰蛋白酶消化液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)pbs(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)mtt(biosharp)dmso(sigma)細(xì)胞株人膠質(zhì)瘤細(xì)胞u251、u87、shg44、人乳腺癌細(xì)胞mcf-7。實驗方法1.細(xì)胞消化、計數(shù)、制成濃度為5×104個/ml的細(xì)胞懸液,96孔板中每孔加入100μl細(xì)胞懸液(每孔5×103個細(xì)胞);2.96孔板置于37℃,5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時;3.用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度,每孔加入100μl相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基;4.96孔板置于37℃,5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時;5.mtt法:1)將96孔板進(jìn)行mtt染色,λ=490nm,測定od值。2)每孔加入20μlmtt(5mg/ml),在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時;3)棄去培養(yǎng)基,每孔加入150μldmso溶解,搖床10分鐘輕輕混勻;λ=490nm,酶標(biāo)儀讀出每孔的od值。6.計算抑制率。實驗結(jié)果表1化合物對3種人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞株及人乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞的抗增殖活性ic50值(μm)樣品u251u87shg44mcf-7β-欖香烯198.6186.4143.2163.8化合物123.317.868.290.5化合物212.215.465.5110.5化合物323.636.711.2122.7化合物437.343.657.8120.6化合物536.324.765.2120.6化合物610.417.837.3126.5化合物724.128.963.2114.2化合物815.418.432.976.3下面是本發(fā)明部分化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性的藥理實驗結(jié)果:實驗方法由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供,周齡為4周,體重14-17g的雌性balb/c裸鼠80只,spf實驗室培養(yǎng)。胰酶消化單層培養(yǎng)的u251細(xì)胞并計數(shù),以不含牛血清的dmem培養(yǎng)基清洗2次,采用瘤細(xì)胞懸液接種方法制作動物模型,裸鼠予乙醚麻醉后,選擇裸鼠頭部頂枕區(qū),用無菌注射針頭鉆孔,將吸有5μl細(xì)胞懸液的微量進(jìn)樣器垂直硬腦膜表面插入,旋轉(zhuǎn)緩慢進(jìn)針2mm,回抽有阻力,無腦脊液吸出,10min內(nèi)緩慢注入,待細(xì)胞沉積后,緩慢拔針。80只荷瘤鼠隨機(jī)分為10組,每組8只,于接種后8天給藥。衍生物溶于dmso,再滴入poloxamer母液,最后加生理鹽水至所需劑量。dmso終濃度為1%,poloxamer終濃度為2%。各組裸鼠給藥,模型組注射等量溶媒,每天注射1次,靜脈注射,持續(xù)28天,每組注射10mg/kg的衍生物。給藥28天結(jié)束后處死裸鼠,開顱取腦,測量移植瘤的最長徑(l)和與之垂直的最寬徑(w),根據(jù)公式v=l*w2/2計算腫瘤體積。計算腫瘤生長抑制率(%),用spss17.0對結(jié)果進(jìn)行分析,組間用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理,公式為:實驗結(jié)果表2化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性具體實施方式以下通過實施例形式展示具體的實施方式,對本
      發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明,但不應(yīng)當(dāng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例,凡是基于本發(fā)明上述內(nèi)容在本領(lǐng)域內(nèi)所能實現(xiàn)的技術(shù)均應(yīng)屬于本發(fā)明的內(nèi)容。實施例113-β-欖香醇的制備將β-欖香烯(2.04g,10.0mmol)溶于乙酸(2ml)和二氯甲烷(8ml)的混合溶液中,冰浴條件下緩慢滴入naclo溶液(1.6m,11.3ml,18.0mmol),冰浴條件下反應(yīng)6h。分液,水層以二氯甲烷萃取(3×20ml),合并二氯甲烷層,分別以飽和nahco3溶液、h2o和飽和nacl溶液洗滌,無水na2so4干燥。濃縮后以石油醚柱層析,分離得到β-欖香烯、13-氯-β-欖香烯、14-氯-β-欖香烯混合物,以及13,14-二氯-β-欖香烯,產(chǎn)物為無色液體。將β-欖香烯、13-氯-β-欖香烯、14-氯-β-欖香烯混合物(3.00g,約含13-氯-β-欖香烯、14-氯-β-欖香烯共10.0mmol)溶于無水dmf(15ml)中,加入無水naoac(2.22g,30.0mmol),120℃條件下反應(yīng)7h。反應(yīng)完畢后,硅藻土過濾,濾餅以石油醚洗滌,濾液中加入h2o(15ml),以石油醚萃取(3×20ml),合并有機(jī)層,無水na2so4干燥。濃縮后,以石油醚∶乙酸乙酯=30∶1(v∶v)硅膠柱層析,得到13-β-欖香醇乙酸酯和14-β-欖香醇乙酸酯混合物,淡黃色液體,產(chǎn)率82%。將13-β-欖香醇乙酸酯和14-β-欖香醇乙酸酯混合物(2.62g,10.0mmol)溶于氯仿(8ml)和甲醇(8ml)的混合溶液中,加入koh(1.68g,30.0mmol),回流反應(yīng)2h。過濾,濾餅以甲醇洗滌,濾液濃縮,以石油醚∶乙酸乙酯=10∶1(v∶v)硅膠柱層析,得13-β-欖香醇和14-β-欖香醇混合物,無色液體,產(chǎn)率90%。采用hplc制備方法分離13-β-欖香醇和14-β-欖香醇混合物,手性柱型號為chiralpakad-h,流動相為正己烷∶乙醇=98∶2(v∶v),流速為1ml/min,檢測波長為uv214nm,室溫條件下分離混合物,得到13-β-欖香醇。無色液體,產(chǎn)率62%.1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:1.01(s,3h),1.41-1.67(m,6h),1.71(s,3h),1.97-2.05(m,2h),4.13(s,2h),4.59(s,1h),4.82(t,j=1.7hz,1h),4.88(s,1h),4.91-4.94(m,2h),5.05(d,j=1.3hz,1h),5.81(dd,j1=17.8hz,j2=10.5hz,1h).13cnmr(cdcl3,300mhz)δ:153.7,150.0,147.4,112.1,109.9,107.9,65.1,52.7,41.4,39.8,39.7,33.2,27.2,24.7,16.5.實施例2化合物1的制備將13-β-欖香醇與二氫吡啶甲酸溶于二氯甲烷中,加入edci與dmap,室溫攪拌過夜,以石油醚∶乙酸乙酯=3∶1(v∶v)硅膠柱層析,得目標(biāo)化合物1,無色液體,產(chǎn)率79%。1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:1.04(s,3h),1.40-1.62(m,6h),1.73(s,3h),1.88(d,j=5.4hz,3h),1.93-2.01(m,2h),2.84(m,2h),3.42(s,3h),4.66(s,2h),4.81(s,1h),4.89(s,1h),4.91(d,j=4.3hz,1h),5.01(s,1h),5.09(s,1h),5.23(m,1h),5.54(s,1h),5.87(m,1h).實施例3化合物2的制備參考實施例2的操作步驟,得目標(biāo)化合物2,無色液體,產(chǎn)率64%。1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:1.01(s,3h),1.40-1.61(m,6h),1.70(s,3h),1.82(d,j=5.1hz,3h),1.98-2.01(m,2h),2.83(m,2h),3.40(s,3h),4.69(s,2h),4.80(s,1h),4.94(s,1h),4.98(d,j=4.3hz,1h),5.03(s,1h),5.09(s,1h),5.53(m,1h),5.64(s,1h),5.92(m,1h).實施例4化合物3的制備參考實施例2的操作步驟,得目標(biāo)化合物3,無色液體,產(chǎn)率72%。1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:0.93(s,3h),1.46-1.69(m,6h),1.79(s,3h),1.72(d,j=5.4hz,3h),1.99-2.03(m,2h),2.79(m,2h),3.52(s,3h),4.72(s,2h),4.86(s,1h),4.92(s,1h),4.98(d,j=4.2hz,1h),5.05(s,1h),5.13(s,1h),5.58(s,1h),5.82(m,1h).實施例5化合物4的制備參考實施例2的操作步驟,得目標(biāo)化合物4,無色液體,產(chǎn)率61%。1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:1.08(s,3h),1.42-1.55(m,6h),1.83(s,3h),1.89(d,j=5.4hz,3h),1.98-2.01(m,2h),2.62(s,3h),2.94(m,2h),3.59(s,3h),4.52(s,2h),4.84(s,1h),4.92(s,1h),4.95(d,j=4.3hz,1h),5.06(s,1h),5.09(s,1h),5.58(m,1h),5.72(s,1h),5.91(m,1h).實施例6化合物5的制備參考實施例2的操作步驟,得目標(biāo)化合物5,無色液體,產(chǎn)率74%。1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:0.89(s,3h),1.44-1.62(m,6h),1.78(s,3h),1.78(d,j=5.4hz,3h),1.98-2.01(m,2h),2.40(m,3h),2.83(m,2h),3.80(m,2h),4.78(s,2h),4.70(s,1h),4.91(s,1h),4.98(d,j=4.2hz,1h),5.12(s,1h),5.18(s,1h),5.64(m,1h),5.79(s,1h),5.93(m,1h).實施例7化合物6的制備參考實施例2的操作步驟,得目標(biāo)化合物6,無色液體,產(chǎn)率82%。1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:1.08(s,3h),1.42-1.60(m,6h),1.77(s,3h),1.89(d,j=5.4hz,3h),1.99-2.07(m,2h),2.88(m,2h),4.05(s,2h),4.69(s,2h),4.78(s,1h),4.89(s,1h),4.92(d,j=4.2hz,1h),5.76(s,1h),5.08(s,1h),5.43(m,1h),5.59(s,1h),5.82(m,1h),7.45-7.63(m,5h).實施例8化合物7的制備參考實施例2的操作步驟,得目標(biāo)化合物7,無色液體,產(chǎn)率49%。1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:1.07(s,3h),1.40-1.59(m,6h),1.74(s,3h),1.89(d,j=5.4hz,3h),1.93-2.01(m,2h),2.84(m,2h),3.04(m,4h),3.58(s,3h),4.66(s,2h),4.83(s,1h),4.89(s,1h),4.91(d,j=4.3hz,1h),5.01(s,1h),5.17(s,1h),5.13(m,1h),5.53(s,1h),5.89(m,1h).實施例9化合物8的制備參考實施例2的操作步驟,得目標(biāo)化合物9,無色液體,產(chǎn)率52%。1hnmr(cdcl3,300mhz)δ:1.07(s,3h),1.40-1.58(m,6h),1.71(s,3h),1.87(d,j=5.4hz,3h),1.93-2.01(m,2h),2.84(m,2h),3.58(s,3h),3.65(m,4h),4.66(s,2h),4.83(s,1h),4.89(s,1h),4.91(d,j=4.2hz,1h),5.01(s,1h),5.35(s,1h),5.32(m,1h),5.65(s,1h),5.84(m,1h).實施例10取上述配方,用常規(guī)方法制備成片劑。當(dāng)前第1頁12
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