本發(fā)明涉及血液循環(huán)dna測定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于ddpcr定量檢測ctdna的方法。

背景技術(shù)：

血液循環(huán)dna(circulatingdna，ctdna)，又稱游離dna或無細胞dna(cell-freedna)，主要來源于細胞的凋亡和死亡。是腫瘤細胞體細胞dna經(jīng)脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，可以被定性、定量和追蹤。對于這類ctdna的成功捕獲，攜帶信息的準確解讀為癌癥早期基因信息的獲取，癌癥的早期診斷、預后檢測、耐藥評估提供了一條準確的途徑。

但是，這類技術(shù)目前仍未得到有效解決和廣泛應(yīng)用。原因之一在于：ctdna在外周血中的含量非常低，尤其是與正常dna(normaldna，ndna)相比，其相對含量極低，每10ml全血平均只能提取到50ng左右的游離dna，目前的檢測技術(shù)還難以達到直接檢測外周血中ctdna的水平。而且，目前的檢測方法均需要先從血清或血漿中提取dna，然后擴增基因組中某個基因的方式，計算ctdna的濃度或基因組拷貝數(shù)。由于個體間、不同病理狀態(tài)間ctdna含量及片段完整程度存在較大差異，即便不考慮操作者的因素，所用提取方法和試劑的不同就會造成提取效率存在巨大差別。在此基礎(chǔ)上的ctdna測定結(jié)果誤差會更大。但直接用血漿或血清擴增，血清或血漿中含有的蛋白質(zhì)等會嚴重干擾pcr，使標本間的擴增效率不一致。

1999年vogelstein首次提出了“數(shù)字pcr”的概念，“數(shù)字pcr”以其極高的敏感性、絕對計算能力和無需定標等特性疾病診斷工作中得到了廣泛應(yīng)用。數(shù)字pcr是通過對樣本進行微小單元化處理，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目，且數(shù)字pcr不依靠任何校準物或外標便可直接計數(shù)目標分子數(shù)，為絕對定量pcr技術(shù)。因此數(shù)字pcr(digitalpcr)特別適用于依靠ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究(如等位基因不平衡表達)、二代測序結(jié)果驗證、mirna表達分析、單細胞基因表達分析等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種基于數(shù)字pcr檢測ctdna的方法，大大提高了檢測的精確性和靈敏度。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種基于數(shù)字pcr檢測ctdna的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)使用循環(huán)游離dna提取試劑盒提取血漿循環(huán)游離dna；

(2)循環(huán)游離dna的富集：將水相和油相混合、振蕩配成pcr反應(yīng)體系并進行乳液pcr擴增，分離水相和油相，得到水相的pcr擴增產(chǎn)物，使用特異性結(jié)合循環(huán)腫瘤dna的探針序列捕獲所述水相的pcr擴增產(chǎn)物中的循環(huán)腫瘤dna；

(3)配置pcr數(shù)字pcr反應(yīng)體系

配制pcr水相，pcr水相包括上游引物、下游引物、pcr模板、pcrmix以及雙蒸水，上述配合的比例關(guān)系為0.5-0.7:0.5-0.7:0.5-0.7：0.1-0.2:13-16:41-45，所述pcr模板為步驟(2)中pcr擴增產(chǎn)物；

配制pcr油相，將65％-68％的甘油、5％-10.5％的tritionx-100、5％-10.5％的司盤60、5％-8％的壬基苯基醚igelco520依次均勻混合，獲得的溶液作為反應(yīng)油相備用；

取1體積水相加到3體積的油相中，渦旋攪拌并反應(yīng)后，得到油包水微滴pcr反應(yīng)體系；

(4)pcr擴增反應(yīng)：將上述充分乳化的油水體系分裝，手動轉(zhuǎn)移到96孔pcr板上，孔板用錫箱熱封后設(shè)定pcr反應(yīng)條件進行pcr擴增，擴增后將96孔pcr板置于qx100a微滴分析儀中，有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性。

進一步地，所述步驟(2)中的水相中含有循環(huán)游離dna模板、正反向引物、dntps、pcr緩沖液和dna聚合酶。

進一步地，所述dna聚合酶為高保真dna聚合酶，所述高保真dna聚合酶為高保真的klenowfragment、kapahifi家族高保真dna聚合酶、phusion家族高保真dna聚合酶、q5家族高保真dna聚合酶中的任一種。

進一步地，所述水相dna模板總量1-10ng、正反向引物終濃度為0.1-1μm、dntps終濃度為0.5-2mm、pcr緩沖液終濃度為1倍、dna聚合酶終濃度為0.1-1u。

進一步地，所述步驟(2)中所述探針序列與所述循環(huán)腫瘤dna特異性結(jié)合以后，通過鏈霉親和素磁珠特異性結(jié)合生物素而捕獲所述循環(huán)腫瘤dna。

進一步地，所述步驟(3)中還包括illumina測序儀中使用的測序接頭序列，所述測序接頭序列對應(yīng)的正反向引物序列分別為：

5’-tccctacacgacgctcttccgatct-3’和

5’-tgaacctgaaccgctcttccgatct-3’。

進一步地，所述的步驟(3)中得到的油包水微滴的粒徑為100nm～1μm。

本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明公開的一種基于數(shù)字pcr檢測ctdna的方法，針對ctdna在外周血中的含量非常低的特點，采用pcr方法對ctdna進行富集以及有效的捕獲，以捕獲的ctdna為模板進行數(shù)字pcr檢測，大大提高了檢測的靈敏度，從而提高了診斷的準確性，在癌癥檢測方面，為早期診斷提供了依據(jù)。(2)本發(fā)明公開的基于數(shù)字pcr定量檢測病毒的方法，操作簡單，大大降低了檢測成本。

具體實施方式

展示一下實例來具體說明本發(fā)明的某些實施例，且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。對本發(fā)明公開的內(nèi)容可以同時從材料、方法和反應(yīng)條件進行改進，所有這些改進，均應(yīng)落入本發(fā)明的的精神和范圍之內(nèi)。

實施例1：血漿游離循環(huán)腫瘤dna提取流程(dna提取試劑盒，qiaampcirculatingnucleicacidkit)

1、用edta抗凝采血管收集患者血液，3000rpm，離心10分鐘后，分離上清，將上清再離心，20000×g，離心10分鐘后，將上清分離備用。

2、吸取100ulproteinasek至50ml離心管中。

3、吸取1ml血漿加至50ml離心管中。

4、吸取0.8mlbufferacl(含有1.0ugcarrierrna)至50ml離心管后，將離心管帽扣緊，脈沖渦旋30秒。

5、60度孵育30分鐘

6、打開離心管帽，加入1.8mlbufferacb，再將離心管帽扣緊，脈沖渦旋15-30秒。

7、將裝有混合液體的50ml離心管冰浴5分鐘。

8、將qiaampminicolumn安置于qiavac24plus的vacconnector上，在qiaampminicolumn上再安置一個20ml的拓展管。

9、將50ml離心管內(nèi)的混合液體加入至帶有拓展管的qiaampminicolumn內(nèi)，利用真空泵將混合液體過濾，然后棄掉拓展管。

10、向qiaampminicolumn內(nèi)加入600ulbufferacw1，利用真空泵將液體過濾。

11、向qiaampminicolumn內(nèi)加入750ulbufferacw2，利用真空本將液體過濾。

12、向qiaampminicolumn內(nèi)加入750ul的無水乙醇，利用真空泵將液體過濾。

13、將qiaampminicolumn的帽扣緊后，置于一個干凈的2ml收集管內(nèi)，高速離心(20000×g)3分鐘。

14、將qiaampminicolumn置于另一新的收集管中，打開帽，56度孵育10分鐘。

15、將qiaampminicolumn置于新的1.5ml離心管中，向qiaampminicolumn的膜上加入30ulbufferave，扣緊帽后，室溫孵育3分鐘。

16、將帶有qiaampminicolumn的1.5ml離心管高速離心(20000×g)1分鐘，洗脫血漿游離循環(huán)腫瘤dna(ctdna)。

實施例2：ctdna富集、分離

1、pcr擴增富集ctdna

利用油包水乳液體系中的微液滴作為反應(yīng)器進行pcr擴增，從而富集ctdna，pcr體系包括油相和水相的反應(yīng)體系。油相作為載體，本發(fā)明中使用的油相可以不作限定；水相中反應(yīng)體系中包括：ctdna模板總量1-10ng、dntps(包括datp、dttp、dctp、dgtp)終濃度為0.5-2mm、pcr緩沖液、dna聚合酶終濃度為0.1-1u和雙蒸水(ddh2o)。其中，dna模板為血漿游離循環(huán)腫瘤dna。在進行pcr之前，dna雙鏈進行兩步修飾，第一步，對雙鏈dna末端進行修復；第二步將“a”加入到dna片段的3’末端；設(shè)計pcr引物，包括兩部分：基因互補配對部分和接頭(adapter)部分，其中pcr引物無需末端修飾，基因互補配對部分位于3’端，pcr擴增時與單鏈ctdna發(fā)生堿基配對；接頭部分位于5’端，在后續(xù)的基因測序中發(fā)揮作用；所述dna聚合酶為高保真dna聚合酶，所述高保真dna聚合酶為高保真的klenowfragment、kapahifi家族高保真dna聚合酶、phusion家族高保真dna聚合酶、q5家族高保真dna聚合酶中的任一種。

本實施例中探針序列與所述循環(huán)腫瘤dna特異性結(jié)合以后，通過鏈霉親和素磁珠特異性結(jié)合生物素而捕獲所述循環(huán)腫瘤dna。為提高捕獲ctdna效率，基因互補配對部分的長短可根據(jù)具體情況調(diào)整，一般25bp左右，不低于20bp；在接頭部分設(shè)計時，結(jié)合具體的測序設(shè)備選擇序列，長度一般不低于20bp。

pcr擴增富集ctdna的具體操作方法為：水相和油相依次加入到1.5ml不沾壁(non-stick)的反應(yīng)管中。兩相混合后，將裝有反應(yīng)體系的反應(yīng)管放在組織破碎儀(qiagentissuelyserii)中震蕩90秒，參數(shù)設(shè)為13hz。取下反應(yīng)試管，將油水體系分裝至pcr反應(yīng)管，根據(jù)以下設(shè)置參數(shù)進行pcr反應(yīng)：

反轉(zhuǎn)錄：溫度50℃，10min，1個循環(huán)；

預變性：溫度95℃，10min，1個循環(huán)；

變性：溫度94℃，30s，退火；溫度58℃，60s，共40個循環(huán)；

結(jié)束反應(yīng)：溫度98℃，10min，1個循環(huán)。

2、分離ctdna

收集反應(yīng)管中的水相和油相，9000g離心5min，去掉油相，此時水相仍然呈乳球狀沉淀在反應(yīng)管底部，加入400μl(兩倍體積)的飽和乙醚，混合物充分渦旋，15000rpm離心2min，去掉上層的乙醚；乙醚重復洗滌一次，得到水相的pcr反應(yīng)產(chǎn)物。

實施例3：數(shù)字pcr檢測ctdna

1.配置數(shù)字pcr反應(yīng)體系

配制pcr水相，在超凈臺中往試管中加入5.22μl，102μm的上游引物和下游引物和pcrmix49.42μl，然后將試管轉(zhuǎn)移到pcr模板加入?yún)^(qū)加1.66fmol的模板，在超凈臺中滴加雙蒸水足至260μl，充分混勻；

配制pcr油相，一次性往試管中加入1.95ml甘油、0.3ml的tritionx-100、0.3ml的司盤60、0.45ml的辛癸酸甘油酯依次均勻混合，獲得的溶液作為反應(yīng)油相備用；

分別取水相pcr和油相pcr油相按流量比為1:3的比例在線混合，混合的同時在搖床上渦旋攪拌并反應(yīng)，得到油包水微滴。

2.數(shù)字pcr擴增反應(yīng)

將上述充分乳化的油水體系分裝，手動轉(zhuǎn)移到96孔pcr板上，孔板用錫箱熱封后設(shè)定pcr反應(yīng)條件進行pcr擴增；擴增條件為：(1)反轉(zhuǎn)錄：溫度50℃，10min，1個循環(huán)；(2)預變性：溫度95℃，10min，1個循環(huán)；(3)變性：溫度94℃，30s，退火；溫度58℃，60s，共40個循環(huán)；(4)結(jié)束反應(yīng)：溫度98℃，10min，1個循環(huán)。

3.檢測微滴

pcr反應(yīng)后，將96孔pcr板置于qx100液滴分析儀中，依次吸取每個樣本中的微滴并逐一通過檢測器，有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陽性；

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。