本發(fā)明屬于海洋化工工程技術(shù)，具體涉及一種殼聚糖衍生物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

為應(yīng)對(duì)人口增長(zhǎng)所帶來(lái)的糧食壓力，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上長(zhǎng)期大量的使用化學(xué)農(nóng)藥，由此所帶來(lái)的環(huán)境污染、生態(tài)破壞問(wèn)題越來(lái)越突出。同時(shí)，隨著人們環(huán)保意識(shí)及食品安全意識(shí)的提高，因農(nóng)藥殘留導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題也日益尖銳，農(nóng)藥殘留引起的食品安全和綠色壁壘問(wèn)題也日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，有害殘留農(nóng)藥已嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和人類健康。研制高效、低毒、低殘留的生物農(nóng)藥已迫在眉睫。

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，同時(shí)也是一個(gè)海洋大國(guó)，利用豐富的海洋生物資源，開(kāi)發(fā)新型海洋生物源農(nóng)藥，是一個(gè)新的應(yīng)用前景廣闊的研究領(lǐng)域。甲殼素來(lái)源于蝦、蟹、昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物(甲殼綱、昆蟲綱)的外殼或軟體動(dòng)物的外殼以及真菌、低等藻類的細(xì)胞壁。其含量豐富，可再生，是含量?jī)H次于纖維素的第二大天然生物多糖。殼聚糖作為甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，具有無(wú)毒、生物相容性好、可自然降解等特點(diǎn)。有研究表明，用殼聚糖處理種子，能促進(jìn)種子萌芽，提高發(fā)芽率，提高糧食作物分蘗數(shù)和出穗數(shù)，改善蔬菜品質(zhì)提高產(chǎn)量。此外，殼聚糖還能抑制植物病原真菌，改善土壤微生物菌群，誘導(dǎo)植物光譜抗病性。以殼聚糖、寡糖為原料研制的海洋生物源農(nóng)藥已有多個(gè)產(chǎn)品面市。然而，由于殼聚糖為天然產(chǎn)物，其殺菌活性與化學(xué)農(nóng)藥相比差距甚大，且用量大，所以推廣比較困難，限制了其應(yīng)用。

硫元素是構(gòu)成生命的重要元素，很多含硫化合物具有多種重要的生理活性。在植物保護(hù)中，許多高效的殺蟲劑、除草劑、殺菌劑都是含硫化合物。二硫代氨基甲酸酯(鹽)類化合物是一類應(yīng)用廣泛的高效農(nóng)用殺菌劑。如縮氨基硫脲化合物具有廣泛的生物活性,在農(nóng)藥界備受關(guān)注。研究表明,該類化合物及其衍生物具有抗細(xì)菌、抗真菌活性，能與多種金屬離子形成穩(wěn)定的配合物,且形成配合物后活性顯著增強(qiáng)。然而，此類殺菌劑存在毒性大的缺點(diǎn)。因此，急需一種環(huán)境友好、能夠綜合殼聚糖及含硫的殺菌劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提供了一種結(jié)構(gòu)新穎、抑菌活性好的殼聚糖二硫雜環(huán)類衍生物及其制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為：

一種殼聚糖衍生物，殼聚糖衍生物為殼聚糖二硫雜環(huán)類衍生物如通式i或式ⅱ所示，

式i，n＝20-12000。式ⅱ中，或h2，n＝20-12000。

一種殼聚糖衍生物的制備方法：

當(dāng)通式i所示衍生物的制備為：

(1)殼聚糖在醇與水的混溶液中，在堿的催化下，常溫下，先與二硫化碳反應(yīng)5-6h，再與溴甲烷反應(yīng)12h，生成殼聚糖二硫丁烷雜環(huán)衍生物；其中，以殼聚糖單糖為基準(zhǔn)，殼聚糖、堿、二硫化碳與溴甲烷的摩爾比為1:1.5-2:1.5-2:1.5-2；

當(dāng)通式i所示衍生物的制備為：

(2)殼聚糖在醇與水的混溶液中，在堿的催化下，常溫下，先與二硫化碳反應(yīng)5-6h，再與1,2-二溴乙烷反應(yīng)12h，生成殼聚糖二硫戊烷雜環(huán)衍生物；其中，以殼聚糖單糖為基準(zhǔn)，殼聚糖、堿、二硫化碳與1,2-二溴乙烷的摩爾比為1:1.5-2:1.5-2:1.5-2；

當(dāng)r＝h2，通式ⅱ所示衍生物的制備為

(3)殼聚糖先與溶劑中溶脹12h，再與過(guò)量氯乙酰氯與70-80℃下回流18h，反應(yīng)后抽濾，濾餅用醇、去離子水洗滌，于50-60℃干燥后，得殼聚糖酰乙氯衍生物；其中，殼聚糖的質(zhì)量與氯乙酰氯的體積比為1:8.5-9；

(4)將步驟(3)中的殼聚糖酰乙氯衍生物混懸于溶劑中，加入過(guò)量85％水肼，回流反應(yīng)8-10h，反應(yīng)后抽濾，濾餅用醇洗滌，于50-60℃干燥后，得殼聚糖酰乙肼衍生物；其中，殼聚糖酰乙氯衍生物與85％水肼的質(zhì)量體積比為1:1-2；

當(dāng)通式ⅱ所示衍生物的制備為：

(5)將步驟(4)中的殼聚糖酰乙肼在醇與水的混溶液中，在氫氧化鈉的催化下，常溫下，先與二硫化碳反應(yīng)5-6h，再與溴甲烷反應(yīng)8-12h，生成殼聚糖酰乙肼二硫丁烷雜環(huán)衍生物；其中，以殼聚糖單糖為基準(zhǔn)，殼聚糖酰乙肼、氫氧化鈉、二硫化碳與溴甲烷的摩爾比為1:1.5:1.5-2:1.5-2；

當(dāng)通式ⅱ所示衍生物的制備為：

(6)將步驟(4)中的殼聚糖酰乙肼在醇與水的混溶液中，在氫氧化鈉的催化下，常溫下，先與二硫化碳反應(yīng)5-6h，再與1.2-二溴乙烷反應(yīng)8-12h，生成殼聚糖酰乙肼二硫丁烷雜環(huán)衍生物；其中，以殼聚糖單糖為基準(zhǔn)，殼聚糖酰乙肼、氫氧化鈉、二硫化碳與1,2-二溴乙烷的摩爾比為1:1.5:1.5-2:1.5-2。

所述制備通式i或通式ⅱ所示衍生物時(shí)，反應(yīng)后抽濾，濾餅用醇洗，于50-60℃干燥，得純化后通式i或通式ⅱ所示衍生物。

所述殼聚糖的分子量為3200-2000000。

所述步驟(1)、(2)、(5)和(6)中，反應(yīng)溶劑中的醇為甲醇或乙醇，醇與水的體積比為1-4:1，其中，混合溶劑體積與殼聚糖質(zhì)量比為25:1-2。

所述步驟(3)中，反應(yīng)溶劑為三氯甲烷或二氯甲烷與吡啶的混合液，體積比為1:1；其中，混合溶劑體積與殼聚糖質(zhì)量比為10:1。

所述步驟(4)中，反應(yīng)溶劑四氫呋喃或n,n-二甲基甲酰胺，其中，溶劑體積與殼聚糖質(zhì)量比為20:1-2。

所述醇洗所用的醇為甲醇或乙醇。

所述通式i或通式ⅱ所示所示衍生物在制備抑菌劑中的應(yīng)用。

原理：殼聚糖分子的氨基或引入的肼基，可與二硫化碳發(fā)生親核反應(yīng)，生成氨基二硫代甲酸鹽，在小分子單溴化物或多溴化物的存在下，再進(jìn)一步發(fā)生親電取代，最終生成2位取代的二硫環(huán)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

氨基二硫代甲酸酯類農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)上一大類殺蟲、殺菌類的農(nóng)藥，其二硫活性基團(tuán)，具有較高的活性，而二硫雜環(huán)就是二硫代甲酸酯類的衍生化方向之一；本發(fā)明采用活性亞結(jié)構(gòu)拼接原理，以無(wú)毒、易降解的殼聚糖為先導(dǎo)化合物，將二硫雜環(huán)衍生物的生物活性基團(tuán)引入到天然產(chǎn)物殼聚糖骨架中，使其產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，制備出抑菌活性得到顯著提高，切具有誘導(dǎo)抗病活性的新型殼聚糖衍生物，同時(shí)合成的衍生物能保持殼聚糖天然無(wú)毒、易降解、生物相容性好的特性。以此來(lái)減少化學(xué)農(nóng)藥的用量、降低殘留、減少污染，為開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥的開(kāi)辟了新途徑。

附圖說(shuō)明

圖1為殼聚糖的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1650，1589，1374，1315，1024，893。

圖2為殼聚糖衍生物1的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1645，1539，1372，1311，1209，1024，894。

圖3為殼聚糖衍生物2的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1591，1524，1373，1311，1025。

圖4為殼聚糖衍生物3的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1646，1590，1373，1316，1058，1024，893：

圖5為殼聚糖衍生物4的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1635，1521，1372，1312，1025。

圖6為殼聚糖衍生物5的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1633，1584，1522，1373，1025，894。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例。

進(jìn)一步的說(shuō)通式i或式ⅱ所示衍生物的制備：

通式i衍生物：將殼聚糖混懸于甲醇或乙醇與去離子水的混合溶劑中，加入適量氫氧化鈉溶液，常溫?cái)嚢?h，再滴加適量二硫化碳，常溫反應(yīng)5-6h，再加入溴甲烷或1,2-二溴乙烷的，常溫反應(yīng)12h；然后反應(yīng)物通過(guò)抽濾、洗滌、干燥，即為殼聚糖二硫丁烷雜環(huán)或殼聚糖二硫戊烷雜環(huán)衍生物。加入的殼聚糖、氫氧化鈉、二硫化碳與溴甲烷或1,2-二溴乙烷的摩爾比為1:1.5:1.5-2:1.5-2。

通式ⅱ衍生物：殼聚糖先制備成氯乙酰殼聚糖，再進(jìn)一步制備成殼聚糖酰乙肼，以殼聚糖酰乙肼為原料按照通式i衍生物的合成過(guò)程，制得殼聚糖酰乙肼基二硫烷基環(huán)。氯乙酰的制備方法：按一定比例混合二氯甲烷或三氯甲烷與吡啶，加入殼聚糖，溶脹，再滴加氯乙酰氯，滴加完畢，升溫回流，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濾、洗滌、干燥，即為氯乙酰殼聚糖；反應(yīng)溶劑二氯乙烷或三氯乙烷與吡啶的體積比為1:1，混合溶劑的體積與殼聚糖質(zhì)量比為10:1，殼聚糖質(zhì)量與氯乙酰氯的體積比為1：8.5-9，反應(yīng)溫度70-80℃，反應(yīng)時(shí)間為18-20h，洗滌液為甲醇或乙醇、去離子水，干燥溫度為50-60℃。殼聚糖酰乙肼的制備方法為：將氯乙酰殼聚糖與四氫呋喃或n、n-二甲基甲酰胺混合，加入85％水肼，加熱，過(guò)濾，醇洗，水洗，干燥，即為殼聚糖酰乙肼；氯乙酰殼聚糖的質(zhì)量與反應(yīng)溶劑的體積比例為1:10-15，氯乙酰殼聚糖質(zhì)量與85％水肼的體積比為1:2-5，反應(yīng)溫度60-70℃，反應(yīng)時(shí)間8-10h，洗滌液為甲醇或乙醇、去離子水，干燥溫度為50-60℃。

實(shí)施例1衍生物1的制備

將2g分子量為180萬(wàn)的殼聚糖加入到20ml乙醇中，加入5ml去離子水，攪拌，緩慢滴加2ml45％naoh溶液，滴加完畢，堿化1h；將1.035ml二硫化碳，緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中，常溫反應(yīng)5h；將1.5ml溴甲烷，加到上述反應(yīng)體系中，常溫反應(yīng)6h；反應(yīng)完畢，抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇洗滌2次，用去離子水洗滌1次，60℃烘干，得2.2g，黃白色粉末，即為衍生物1：殼聚糖-2-亞胺-1,3-二硫丁烷。結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式ⅰ

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖2)與殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1589cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；且1539cm^-1處出現(xiàn)為c＝n特征吸收峰；1209cm^-1處出現(xiàn)n＝c-s特征吸收峰；綜上，證明衍生物1合成成功。

實(shí)施例2衍生物2的制備

將2g分子量為150萬(wàn)的殼聚糖加入到20ml乙醇中，加入5ml去離子水，攪拌，緩慢滴加2ml48％naoh溶液，滴加完畢，堿化1h；將2.5ml1,3-二溴乙烷，緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中，常溫反應(yīng)6h；反應(yīng)完畢，抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇洗滌2次，用去離子水洗滌1次，60℃烘干，得2.2g，米黃色粉末，即為殼聚糖-2-亞胺-1,3-二硫戊烷。即為衍生物2：殼聚糖-2-亞胺-1,3-二硫戊烷。結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式i

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖3)與殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1589cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明氨基已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；且1524cm^-1處出現(xiàn)為c＝n特征吸收峰；綜上，證明衍生物2合成成功。

實(shí)施例3衍生物3的制備

將20g分子量為180萬(wàn)的殼聚糖加入到200ml二氯甲烷與吡啶(1:1)的混合溶液中，溶脹12h；緩慢滴加120ml氯乙酰氯，65℃回流10h，補(bǔ)加60ml氯乙酰氯，繼續(xù)回流8h，停止加熱，將至室溫，抽濾，濾餅用95乙醇洗滌2次，50％乙醇洗滌一次，抽濾，濾餅60℃烘干，得19.8g米黃色固體，即為氯乙酰殼聚糖。

取10g氯乙酰殼聚糖，加入到100ml四氫呋喃中，再加入8ml85％水合肼，攪拌，60℃回流8h，將至室溫，抽濾，濾餅用95乙醇洗滌2次，常溫真空干燥，得9.37g黃白色固體，即為殼聚糖酰乙肼。即為衍生物3：殼聚糖-酰乙肼。結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式ⅰ(r＝h2,n＝20-12000)

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖4)與殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1590cm^-1的nh的特征吸收峰增強(qiáng)，表明肼基連接上；且1646cm^-1處c＝o特征吸收峰增強(qiáng)；1058cm^-1、1024cm^-1處仍未三峰，表明環(huán)上羥基未取代，說(shuō)明?；B在殼聚糖-nh2上；綜上，證明衍生物3合成成功。

實(shí)施例4衍生物4的制備

將10g分子量為180萬(wàn)的殼聚糖加入到100ml二氯甲烷與吡啶(1:1)的混合溶液中，溶脹12h；緩慢滴加55ml氯乙酰氯，65℃回流10h，補(bǔ)加30ml氯乙酰氯，繼續(xù)回流8h，停止加熱，將至室溫，抽濾，濾餅用95乙醇洗滌2次，50％乙醇洗滌一次，抽濾，濾餅常溫下真空干燥12h，得9g米黃色固體，即為氯乙酰殼聚糖。

取8g氯乙酰殼聚糖，加入到100ml四氫呋喃中，再加入5ml85％水合肼，攪拌，70℃回流8h，將至室溫，抽濾，濾餅用95乙醇洗滌2次，常溫真空干燥，得6.9g黃白色固體，即為殼聚糖酰乙肼。

取2g殼聚糖酰乙肼加入到20ml乙醇中，加入5ml去離子水，攪拌，緩慢滴加2ml46％naoh溶液，滴加完畢，堿化1h；將1.03ml二硫化碳，緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中常溫反應(yīng)5h；將1.3ml溴甲烷，加到上述反應(yīng)體系中，常溫反應(yīng)10h；反應(yīng)完畢，抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇洗滌2次，用去離子水洗滌1次，60℃烘干，得2.2g，黃白色粉末，即衍生物4：為殼聚糖-酰乙基-2-亞肼-1,3-二硫丁烷。結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式ⅱ

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖5)殼聚糖酰乙肼譜圖(圖4)相比，位于1590cm^-1的n-h的彎曲吸收峰減弱，肼基上有反應(yīng)；且1521cm^-1處出現(xiàn)c＝n伸縮振動(dòng)峰；1208cm^-1處出現(xiàn)n＝c-s特征吸收峰；綜上，證明衍生物4成成功。

實(shí)施例5衍生物5的制備

殼聚糖酰乙肼的制備同實(shí)施例4。

取2g殼聚糖酰乙肼加入到20ml乙醇中，加入5ml去離子水，攪拌，緩慢滴加2ml46％naoh溶液，滴加完畢，堿化1h；將1.03ml二硫化碳緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中，常溫反應(yīng)5h；將1.65ml1,3-二溴乙烷，加到上述反應(yīng)體系中，常溫反應(yīng)12h；反應(yīng)完畢，抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇洗滌2次，用去離子水洗滌1次，60℃烘干，得2.0g，黃白色固體，即衍生物4：為殼聚糖-酰乙基-2-亞肼-1,3-二硫戊烷。結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式ⅱ

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖6)與殼聚糖的紅外譜圖(圖4)相比，位于1590cm^-1的n-h的彎曲吸收峰減弱，肼基上有反應(yīng)；且1522cm^-1處出現(xiàn)c＝n特征吸收峰，1202cm^-1處出現(xiàn)n＝c-s特征吸收峰；綜上，證明衍生物5成成功。

抑菌活性測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定樣品對(duì)辣椒疫霉(phytophthoracapsici)的抑菌活性。測(cè)試在3個(gè)樣品濃度下即：100μg/ml、200μg/ml、400ug/ml，對(duì)辣椒疫霉的抑制效果。

實(shí)驗(yàn)以相同濃度的好普寡糖藥劑(市售為2％的水劑)為陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水為陰性對(duì)照。將培養(yǎng)基均勻倒入2個(gè)直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，待完全凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中接種3塊直徑為5mm的菌餅。在27℃下培養(yǎng)48小時(shí)后，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算樣品的抑菌率。每次處理設(shè)置2個(gè)培養(yǎng)皿，每皿接種3個(gè)菌落，對(duì)每個(gè)菌落測(cè)定最大直徑(dmax)和最小直徑(dmin)，取平均值為樣品抑菌圈直徑d樣品，全部試驗(yàn)重復(fù)一次。根據(jù)下式計(jì)算抑菌率。

抑菌率(％)＝(d空白－d樣品)/(d空白－5)×100％

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1

表1部分通式1殼聚糖衍生物對(duì)辣椒疫霉的抑制活性

根據(jù)以上數(shù)據(jù)和衍生物結(jié)構(gòu)分析：

本發(fā)明的衍生物殺菌活性，與殼聚糖相比明顯得到提高，且活性比商業(yè)化的殺菌劑好譜寡糖高，尤其是衍生物3和4，最高活性比伊維菌素高出18個(gè)百分點(diǎn)。同時(shí)，根據(jù)測(cè)量，活性基團(tuán)的取代度為20％左右，若以此計(jì)算，在400mg/ml濃度下，活性基團(tuán)的當(dāng)量濃度為80mg/ml，在此當(dāng)量濃度下，衍生物1和2同對(duì)照好譜寡糖400mg/ml的活性持平，而衍生物3、4和5，超過(guò)好譜寡糖此濃度下的活性很多。因此衍生物具有較好的殺菌活性，尤其是衍生物3和4，具有最高活性。本發(fā)明衍生物，二硫基團(tuán)活性基團(tuán)為小分子，切僅連接在20％左右的單糖上，空間位阻很小，不改變殼聚糖主要結(jié)構(gòu)，因此不影響殼聚糖鏈的植物調(diào)節(jié)作用。故，本發(fā)明衍生物，同時(shí)具體殺菌作用，及植物調(diào)節(jié)功能，由此可發(fā)揮雙重作用，提高效果。本發(fā)明的衍生物，以殼聚糖為基質(zhì)。殼聚糖由天然多糖幾丁質(zhì)經(jīng)脫乙酰得到，制備工藝簡(jiǎn)單，來(lái)源豐富易得，同時(shí)，天然無(wú)毒，與生物相容性好。在連接活性基團(tuán)后，大量的氨基葡萄糖骨架，遮蓋了二硫活性基團(tuán)的毒性，所得產(chǎn)物低毒。重要的是，寡糖鏈不能被皮膚直接吸收，故對(duì)皮膚無(wú)毒，這是一般二硫代氨基甲酸酯(鹽)類農(nóng)藥所不具備的優(yōu)勢(shì)。另外，殼聚糖能夠被微生物利用作為碳源，易降解，能夠迅速發(fā)揮殺菌作用，不易積累及殘留毒性，因此對(duì)環(huán)境友好。相對(duì)于寡糖，殼聚糖的成本更低，更易衍生物處理，且本發(fā)明衍生物所含有的二硫代甲酸酯類活性基團(tuán)，具有其他的殺蟲、殺線活性。以殼聚糖為基質(zhì)開(kāi)發(fā)新的殺菌劑，是另一個(gè)熱點(diǎn)方向。

綜上，本發(fā)明為調(diào)高殺菌效果，為減少化學(xué)農(nóng)藥的用量、降低殘留、減少污染，為開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥的開(kāi)辟了新途徑。