本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌及其應(yīng)用與制備方法，屬于食品微生物篩選與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乳酸菌(lacticacidbacterialab)是一類可利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類細菌的總稱。乳酸菌為革蘭氏陽性球菌或桿菌，屬厭氧或兼性厭氧菌。在乳酸菌發(fā)酵過程中，有時產(chǎn)生揮發(fā)性酸或氣體，早在數(shù)千年前古人就用它來制作腌菜及泡菜等食品，隨著近代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們逐漸關(guān)注益生乳酸菌，這類乳酸菌是對人或動物有益的細菌，可作為食品添加劑服用，有確切的健康功效，對體內(nèi)環(huán)境（胃酸和腸道的膽汁）有一定耐受能力，可以定植于人體腸道內(nèi)。目前作為益生乳酸菌的菌種主要有嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、干酪及副干酪乳桿菌、雙歧桿菌等。

益生乳酸菌能夠產(chǎn)生多種有益的代謝產(chǎn)物，例如有機酸、多糖、細菌素等。其中有機酸是乳糖經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生的重要物質(zhì)，它不僅是發(fā)酵乳發(fā)酵程度的重要指標，也是影響發(fā)酵乳風(fēng)味、營養(yǎng)和健康性的重要因素之一。有機酸中乳酸和和乙酸的合適比例，可以更好地改善腸道微生物組成，增加腸道蠕動，減少腸道內(nèi)腐敗物質(zhì)，使排便處于理想狀態(tài)，促進及維護腸道健康。另外多糖具有抗氧化活性，能產(chǎn)生胞外多糖的乳酸菌可以使益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)地更加細膩光滑，而且一些多糖對人體健康有積極作用，如抗腫瘤、凝血、降血糖、降血脂等。

隨著社會經(jīng)濟的不斷發(fā)展、人民生活水平的日益提高，利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的益生類食品和藥品日漸走俏，迅速成為全球關(guān)注的健康食品。目前，利用益生菌發(fā)酵果蔬，開發(fā)出酸甜爽口且具有多種營養(yǎng)保健功效的益生菌發(fā)酵果蔬飲料，頗受市場歡迎。因此，建立乳酸菌菌種庫，并在此基礎(chǔ)上篩選具有益生功效的乳酸菌及開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品的研究顯得尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對以上問題，提供一種植物乳桿菌及其應(yīng)用與制備方法。

發(fā)明目的通過以下方案實現(xiàn)：一種植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）a11，于2017年6月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.14216。

進一步的，其菌落形態(tài)學(xué)特征為：圓形菌落，3mm寬，凸起，光滑，細密，白色，偶爾淺黃色或深黃色；其菌體形態(tài)特性為：革蘭氏陽性，無芽孢，圓端直桿菌，單個、成對、成短鏈。

進一步的，植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）發(fā)酵后有機酸組成：草酸2.3%、酒石酸6.77%、、蘋果酸3.07%、乳酸77.0%、乙酸6.42%、檸檬酸2.80%、琥珀酸1.65%。

一種植物乳桿菌的應(yīng)用，植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）用于制備具有生理調(diào)節(jié)作用的食品、保健品、化妝品。

一種植物乳桿菌的應(yīng)用，植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）與其它菌株進行復(fù)配制成發(fā)酵劑，應(yīng)用于發(fā)酵乳、果蔬、干酪、肉制品食品的發(fā)酵。

一種植物乳桿菌的應(yīng)用，植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）具有降解膽固醇能力。

進一步的，通過果蔬發(fā)酵制備成具有保健功效的益生菌發(fā)酵飲料。

一種植物乳桿菌的應(yīng)用，益生菌發(fā)酵飲料，其發(fā)酵的工藝配方為：胡蘿卜汁25%，蔗糖5%，葡萄糖3%，k2hpo40.03%，kh2po40.02%，mgso40.03%，檸檬酸0.1%

進一步的，益生菌發(fā)酵飲料以2%的接種量將植物乳桿菌a11接種到上述配方中，37℃發(fā)酵14h，即得乳酸菌果蔬飲料，其中活菌數(shù)濃度達10⁸cfu/ml以上。

一種分離植物乳桿菌的方法，從溫州泰順山區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜食品的微生物群落中篩選菌株;將采集的泡菜樣品置于滅菌的生理鹽水試管中，充分震蕩后，取1ml，加到9ml滅菌生理鹽水中，振蕩均勻，依次進行梯度稀釋10-2、10-3、10-4，各取0.1ml涂布于mrs固體培養(yǎng)基的平板上，37℃培養(yǎng)48h；觀察菌落形態(tài)，如出現(xiàn)微凸起、乳白色的圓形菌落初步定為目標菌株，然后從目標菌株中挑取單菌落反復(fù)劃線，直至獲得純培養(yǎng)物；挑選該單菌進行革蘭氏染色、鏡檢及過氧化氫酶實驗，將革蘭氏染色呈陽性，鏡檢為桿狀或球狀，過氧化氫酶實驗為陰性的菌株定為目標菌株；將純化的目標菌株進行甘油低溫凍存，以備后續(xù)保藏鑒定及應(yīng)用。

生物材料保藏

本發(fā)明所提供的植物乳桿菌a11（lactobacillusplantarum）于2017年6月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.14216，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

說明書附圖

圖1膽固醇含量的標準曲線。

圖2膽固醇溶液的氣相色譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明：

實施例1，本發(fā)明的一種植物乳桿菌a11于2017年6月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.14216。

一種植物乳桿菌，其菌落形態(tài)學(xué)特征為：圓形菌落，3mm寬，凸起，光滑，細密，白色，偶爾淺黃色或深黃色；其菌體形態(tài)特性為：革蘭氏陽性，無芽孢，圓端直桿菌，單個、成對或成短鏈。

一種植物乳桿菌，植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）16srdna全序列為序列表所示。

一種植物乳桿菌，植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）用于制備具有生理調(diào)節(jié)作用的食品、保健品或化妝品。

一種植物乳桿菌，植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）與其它菌株進行復(fù)配制成發(fā)酵劑，應(yīng)用于發(fā)酵乳、果蔬、干酪、肉制品食品的發(fā)酵。

一種植物乳桿菌，植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）具有降解膽固醇能力，可以通過果蔬發(fā)酵制備成具有保健功效的益生菌發(fā)酵飲料。

一種植物乳桿菌，其發(fā)酵的工藝配方為：胡蘿卜汁25%，蔗糖5%，葡萄糖3%，k2hpo40.03%，kh2po40.02%，mgso40.03%，檸檬酸0.1%。

一種植物乳桿菌，以2%的接種量將植物乳桿菌a11接種到上述配方中，37℃發(fā)酵14h，即得乳酸菌果蔬飲料，其中活菌數(shù)濃度達108cfu/ml以上。

實施例2，一種植物乳桿菌在制備具有降低膽固醇功能產(chǎn)品中的應(yīng)用。

實施例3，一種植物乳桿菌在制備酸奶發(fā)酵劑中的應(yīng)用。

實施例4，一種植物乳桿菌具有抗氧化能力。

實施例5，一種分離植物乳桿菌的方法，植物乳桿菌a11為采自溫州泰順山區(qū)農(nóng)家的傳統(tǒng)手工泡菜中分離篩選所得，具體的分離鑒定步驟如下：

將采集的泡菜樣品置于滅菌的生理鹽水試管中，充分震蕩后，取1ml，加到9ml滅菌生理鹽水中，振蕩均勻，依次進行梯度稀釋10-2、10-3、10-4，各取0.1ml涂布于mrs固體培養(yǎng)基的平板上，37℃培養(yǎng)48h。觀察菌落形態(tài)，如出現(xiàn)微凸起、乳白色的圓形菌落初步定為目標菌株，然后從目標菌株中挑取單菌落反復(fù)劃線，直至獲得純培養(yǎng)物。挑選該單菌進行革蘭氏染色、鏡檢及過氧化氫酶實驗，將革蘭氏染色呈陽性，鏡檢為桿狀或球狀，過氧化氫酶實驗為陰性的菌株定為目標菌株。將純化的目標菌株進行甘油低溫凍存，以備后續(xù)保藏鑒定及應(yīng)用。

實施例6植物乳桿菌a11的分離純化與鑒定保藏

本發(fā)明的植物乳桿菌a11為采自溫州泰順山區(qū)農(nóng)家的傳統(tǒng)手工泡菜中分離篩選所得，具體的分離鑒定步驟如下：

將采集的泡菜樣品置于滅菌的生理鹽水試管中，充分震蕩后，取1ml，加到9ml滅菌生理鹽水中，振蕩均勻，依次進行梯度稀釋10-2、10-3、10-4，各取0.1ml涂布于mrs固體培養(yǎng)基的平板上，37℃培養(yǎng)48h。觀察菌落形態(tài)，如出現(xiàn)微凸起、乳白色的圓形菌落初步定為目標菌株，然后從目標菌株中挑取單菌落反復(fù)劃線，直至獲得純培養(yǎng)物。挑選該單菌進行革蘭氏染色、鏡檢及過氧化氫酶實驗，將革蘭氏染色呈陽性，鏡檢為桿狀或球狀，過氧化氫酶實驗為陰性的菌株定為目標菌株。將純化的目標菌株進行甘油低溫凍存，以備后續(xù)保藏鑒定及應(yīng)用。

將純化的目標菌株進行16srdna基因測序鑒定，具體操作如下：用ezup柱式細菌基因組dna抽提試劑盒提取目標菌株基因組dna，采用細菌通用引物對27f：5’-agtttgatcmtggctcag-3’，1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’)進行16srdna的pcr實驗，pcr反應(yīng)擴增結(jié)束后，將pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并凝膠成像，將擴增出單一、清晰條帶的菌株用基因測序儀進行測序，結(jié)果如seqidno.1所示，在ncbi網(wǎng)站上進行blast序列比對，結(jié)果顯示該序列與植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）的16srdna序列同源性超過99%，結(jié)合a11菌的形態(tài)特征和生理生化實驗，以及系統(tǒng)發(fā)育樹中的同源性分析，判斷篩選的a11菌株為植物乳桿菌。

然后將分離純化的目標菌株進行api生理生化鑒定，過程如下：1）接種物的制備：將純化的菌株在mrs肉湯培養(yǎng)基上傳代兩次后接種于mrs瓊脂，37℃培養(yǎng)24h，挑取5個菌落形態(tài)一致的菌落在api50chl培養(yǎng)基中制成菌懸液。2）試劑條的接種：用已接種的api50chl培養(yǎng)基加入有試劑條的無菌試管，并用無菌礦物油覆蓋所有測定管，37℃培養(yǎng)48h。3）判讀試劑條：培養(yǎng)中所含溴甲酚紫指示劑變黃（25號七葉靈測定管從紫變黑）為陽性結(jié)果，所有測定管結(jié)果構(gòu)成菌株的生化圖譜，參照標準菌株的反應(yīng)鑒定表，進一步判斷該菌株為植物乳桿菌，這一結(jié)果與16srdna基因測序鑒定結(jié)果一致，最終確定目標菌株a11為植物乳桿菌。

本發(fā)明菌株命名為植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）a11，于2017年6月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.14216。地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵政編碼100101。

實施例7植物乳桿菌a11發(fā)酵后有機酸組成

將植物乳桿菌進行傳代活化后，以2%接種量接種于mrs液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48h，4000r/min，離心15min，收集發(fā)酵上清液，0.45μm水相濾膜過濾，濾液供上機分析用。色譜條件流動相：3％ch3oh-0.5％nh4h2po4(ph=2.5)溶液，流速為1.0ml/min，紫外檢測波長為210nm，進樣量為10μl。

植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）發(fā)酵后有機酸組成：

有機酸對發(fā)酵乳風(fēng)味有重要的影響。在傳統(tǒng)的發(fā)酵乳中發(fā)現(xiàn)了痕量的蘋果酸、甲酸、琥珀酸、丙酸等有機酸。并且各有機酸含量之間及滴定酸度之間都呈現(xiàn)顯著相關(guān)或極顯著相關(guān)。

實施例8植物乳桿菌a11的耐酸耐膽鹽試驗

植物乳桿菌a11由甘油凍存管活化，挑取單菌落至10ml的mrs液體培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24h，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2-3次，將其濃度調(diào)至109cfu/ml，然后將此菌液接種于ph為3.0的mrs液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，于0h和3h分別取樣進行活菌計數(shù)，以0h樣品為對照，計算3h樣品菌株的存活率，存活率=（3h的活菌數(shù)/0h的活菌數(shù)）×100%

植物乳桿菌a11由甘油凍存管活化，挑取單菌落至10ml的mrs液體培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24h，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2-3次，將其濃度調(diào)至109cfu/ml，然后將此菌液接種于膽鹽濃度為0.3%的mrs液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，于0h和3h分別取樣進行活菌計數(shù)，以0h樣品為對照，計算3h樣品菌株的存活率，存活率=（3h的活菌數(shù)/0h的活菌數(shù)）×100%

同時以嗜酸乳桿菌atcc43121作為對照，進行上述耐酸耐膽鹽實驗，具體結(jié)果見表1

表1菌株耐酸、耐膽鹽檢測結(jié)果

乳酸菌定植存活過程取決與乳酸菌能否抵御體內(nèi)不良環(huán)境，通常用乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力作為衡量指標。從表1的數(shù)據(jù)可以看出，與嗜酸乳桿菌atcc43121相比，我們篩選出來的植物乳桿菌a11具有較強的耐酸和耐膽鹽能力，尤其在ph=3的條件下存活率高達108.56%，說明植物乳桿菌a11在胃酸中不僅可以存活，而且在一定程度上稍有增殖。這一結(jié)果證明了植物乳桿菌a11具備較高的胃腸道生存能力，也顯示了該菌株作為益生菌開發(fā)的潛力。

實施例9植物乳桿菌a11對膽固醇的去除實驗

標準曲線的繪制：準確配制0.2mg/ml的膽固醇標準液，分別取1、2、3、4、5ml于10ml容量瓶中，用異丙醇定容。然后用agilentgchp-5(30m×0.32mm×0.25μm)，進行檢測，柱溫：初始溫度為100℃，保持1min，以20℃/min速率升溫至300℃，保持10min，進樣口溫度250℃，檢測器溫度300℃，進樣量1μl，每個樣品進樣三次，記下峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線。

樣品的制備：植物乳桿菌a11由甘油凍存管活化，挑取單菌落至5ml的mrs液體培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24h，按2%的接種量傳代到10ml的mrs液體培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24h，然后將此制好的種子液按2%的接種量接種于含有0.1mg/ml膽固醇的mrs液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h

膽固醇提取和測定：將發(fā)酵液5000rpm離心15min，取上清1ml于螺口試管，加10%入氫氧化鉀甲醇溶液2ml（w/v），旋緊試管，于75℃水浴皂化50min，其間每隔10分鐘震蕩一次，皂化完成后，冷卻，加入2ml水，4ml正己烷（重復(fù)萃取一次），漩渦震蕩2min，靜置10min，分層，取上層正己烷層于新試管中，合并兩次萃取的正己烷層共8ml，氮氣吹干，1ml異丙醇溶解，過0.45μm濾膜后注入氣相色譜儀，測定峰面積，由標準曲線得到試樣溶液中膽固醇的濃度，根據(jù)保留時間定性，外標法定量。其中將未接菌株的含有0.1mg/ml膽固醇的mrs液體培養(yǎng)基作為空白對照。

同時以嗜酸乳桿菌atcc43121作為對照，進行上述膽固醇降解實驗，具體結(jié)果見表2

表2菌株降膽固醇檢測結(jié)果

從表2的數(shù)據(jù)可以看出：與嗜酸乳桿菌atcc43121相比，我們篩選出來的植物乳桿菌a11具有較好的膽固醇降解能力，可以應(yīng)用果蔬發(fā)酵制備成具有保健功效的益生菌發(fā)酵飲料。

實施例10植物乳桿菌a11的抗氧化實驗

活化傳代2次后的植物乳桿菌a11按2%的接種量接種到10ml的mrs液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18h，4000r/min，離心15min，收集發(fā)酵上清液和菌體。用ph=7.4的磷酸緩沖溶液重懸菌體，繼而用超聲波破碎法提取菌體的無細胞提取物。

采用dpph法測定植物乳桿菌a11的發(fā)酵上清液和無細胞提取物的抗氧化活性：各取2ml菌體的發(fā)酵上清液和無細胞提取物，分別加入2ml95%的乙醇配制的0.2mmdpph溶液，搖勻后室溫黑暗處靜置反應(yīng)30min，用紫外分光光度計測定其在517nm處的吸光度。

dpph清除率(%)=[1?(asample-ablank)/acontrol]×100

asample:樣品與dpph混合液的吸光度；

ablank:樣品與95%乙醇混合液的吸光度；

acontrol:溶解樣品的溶劑與dpph混合液的吸光度；

表3菌株抗氧化檢測結(jié)果

結(jié)果顯示：植物乳桿菌a11的發(fā)酵上清液和無細胞提取物有較強的抗氧化能力，對dpph自由基清除能力分別為96.95%和64.21%，發(fā)酵上清液對dpph自由基清除效果要明星高于無細胞提取物。說明植物乳桿菌a11發(fā)酵過程產(chǎn)生的如多糖類的代謝產(chǎn)物對dpph自由基發(fā)揮了更重要的作用，具有更強的抗氧化能力。

實施例11植物乳桿菌a11制備益生菌發(fā)酵飲料

植物乳桿菌a11種子液的制備：活化傳代后的植物乳桿菌a11按2%的接種量接種到10ml的mrs液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48h，4000r/min，離心15min，收集菌體，用無菌水洗滌2-3次，將其濃度調(diào)至109cfu/ml。

配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基：將胡蘿卜洗凈，切塊，加入等質(zhì)量的蒸餾水，用打漿機打漿成胡蘿卜汁，將配方中的配料加入胡蘿卜汁中，使得胡蘿卜汁25%，蔗糖5%，葡萄糖3%，k2hpo40.03%，kh2po40.02%，mgso40.03%，檸檬酸0.1%，攪拌均勻后剪切、均質(zhì)，121℃滅菌30min，冷切至37℃左右。

將2%的植物乳桿菌a11的種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵14h，放入4℃冰箱8h，用檸檬酸鈉和蔗糖進行口味調(diào)配，即可得到新鮮可口，營養(yǎng)豐富、天然胡蘿卜味濃郁并具有良好保健功能的益生菌發(fā)酵飲料。

雖然本發(fā)明已通過參考優(yōu)選的實施例進行了描述，但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，可以不限于上述實施例的描述，在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，可作出形式和細節(jié)上的各種變化。

序列表

<110>浙江一鳴食品股份有限公司

<120>一種植物乳桿菌a11及其應(yīng)用

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1428

<212>dna

<213>植物乳桿菌a11（lactobacillusplantaruma11）

<400>1

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