本發(fā)明屬于細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種聯(lián)合檢測(cè)石油污水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的方法。
背景技術(shù)：
硫酸鹽還原菌(srb)是利用污水中的硫酸鹽或者其它氧化態(tài)硫化物作為電子受體來(lái)異化有機(jī)物質(zhì)的微生物，它將so42-還原成h2s，進(jìn)而改變水質(zhì)的ph和金屬的腐蝕狀態(tài)，使金屬腐蝕速度顯著增加的重要因素，對(duì)石油管道帶來(lái)腐蝕、堵塞等諸多有害作用。
硝酸鹽還原菌(nrb)是存在于石油污水系統(tǒng)中具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的拮抗菌，在生活習(xí)性、生長(zhǎng)環(huán)境等方面與srb非常相似，但不產(chǎn)生h2s及其它有害物質(zhì)。因此，可以應(yīng)用nrb通過(guò)生物競(jìng)爭(zhēng)抑制(bio-competitiveexclusion，bcx)作用達(dá)到抑制srb生長(zhǎng)繁殖及其腐蝕金屬管道的目的。
目前，只有單一的檢測(cè)srb或nrb的細(xì)菌計(jì)數(shù)檢測(cè)瓶，不便于細(xì)菌檢測(cè)工作的大量展開(kāi)。同時(shí)，對(duì)這兩種細(xì)菌的檢測(cè)分別進(jìn)行，不能指導(dǎo)現(xiàn)場(chǎng)對(duì)于兩種細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的研究和分析。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種聯(lián)合檢測(cè)石油污水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的方法。本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)石油污水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的方法，解決現(xiàn)有srb和nrb細(xì)菌計(jì)數(shù)檢測(cè)技術(shù)的局限性、適用范圍小、操作復(fù)雜等問(wèn)題，該方法可以準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速地進(jìn)行srb和nrb細(xì)菌計(jì)數(shù)檢測(cè)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種聯(lián)合檢測(cè)石油污水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的方法，包括以下步驟：
(1)對(duì)采集的石油污水水樣進(jìn)行濃度梯度稀釋；
(2)將步驟(1)中稀釋后的石油污水水樣置于檢測(cè)瓶?jī)?nèi)恒溫培養(yǎng)7～14天后，分別對(duì)硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)；
恒溫培養(yǎng)時(shí)采用的聯(lián)合培養(yǎng)液成分為：乳酸鈉2～10g/l、酵母粉0.1～1g/l、氯化鈉3～8g/l、磷酸二氫鉀/磷酸氫二鉀0.2～0.8g/l、氯化銨0.1～0.8g/l、硝酸鉀/鈉0.5～5g/l、硫酸鎂0.5～3g/l、抗壞血酸0.05～0.5g/l、乙二胺四乙酸0.05～0.1g/l、谷胱甘肽0.01～0.05g/l；
恒溫培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為石油污水采樣點(diǎn)的水樣所處流程環(huán)境溫度；
計(jì)數(shù)檢測(cè)時(shí)參照sy/t0532-2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》分別對(duì)硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案：
優(yōu)選的，采用ph調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的ph值為7～8，所述ph調(diào)節(jié)劑為摩爾濃度為0.05～0.5mol/l氫氧化鈉水溶液。
優(yōu)選的，采用亞鐵鹽溶液對(duì)硫酸鹽還原菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)，所述亞鐵鹽溶液中亞鐵離子的質(zhì)量濃度為0.01～1％。
優(yōu)選的，硝酸鹽還原菌的檢測(cè)液分為硝酸根檢測(cè)液和亞硝酸根檢測(cè)液。
優(yōu)選的，采用二苯胺試劑對(duì)硝酸鹽還原菌中的硝酸根進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)；所述二苯胺試劑的體積濃度為0.5％；所述二苯胺試劑的溶劑為濃硫酸；
采用格里斯試劑對(duì)亞硝酸根進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)。格里斯試劑是一種公認(rèn)的廣泛用于檢測(cè)亞硝酸根的試劑溶液。
優(yōu)選的，石油污水水樣采集后進(jìn)行密封處理并在1～8℃下存儲(chǔ)。
優(yōu)選的，硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)溶液在配制完成后需進(jìn)行紫外滅菌，具體為在超凈工作臺(tái)的紫外線下照射10～30分鐘。
優(yōu)選的，檢測(cè)瓶在使用前進(jìn)行三輪清洗，分別為去污水清洗、自來(lái)水清洗和蒸餾水清洗。
優(yōu)選的，在檢測(cè)瓶?jī)?nèi)灌裝聯(lián)合培養(yǎng)液并壓蓋密封后進(jìn)行滅菌，滅菌條件為120～140℃，滅菌時(shí)間10～30分鐘。
優(yōu)選的，計(jì)數(shù)檢測(cè)時(shí)，使用一次性無(wú)菌注射器吸取培養(yǎng)液0.1～1ml，對(duì)硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)。
優(yōu)選的，計(jì)數(shù)檢測(cè)時(shí)，使用一次性無(wú)菌注射器吸取培養(yǎng)液0.1～1ml，對(duì)硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)。本發(fā)明中使用一次性無(wú)菌注射器吸取培養(yǎng)液0.1～1ml，與滅菌后的亞鐵鹽溶液進(jìn)行硫酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)，混合后如出現(xiàn)黑色或黑褐色，說(shuō)明該培養(yǎng)瓶中存在硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)，則記為硫酸鹽還原菌陽(yáng)性；與滅菌后的亞硝酸根檢測(cè)溶液進(jìn)行硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)；與格里斯試劑(對(duì)氨基苯磺酸試劑和ɑ—萘胺試劑)混合后如出現(xiàn)粉色或粉紅色，說(shuō)明該培養(yǎng)瓶中存在硝酸鹽還原菌的生長(zhǎng)，則記為硝酸鹽還原菌陽(yáng)性；與滅菌后的硝酸根定性檢測(cè)溶液進(jìn)行硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)，與0.5％二苯胺試劑混合后如未出現(xiàn)任何顏色變化，說(shuō)明該培養(yǎng)瓶中存在硝酸鹽還原菌的生長(zhǎng)，記為硝酸鹽還原菌陽(yáng)性。
本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)石油污水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的方法中采用的聯(lián)合培養(yǎng)液碳源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足情況下，分別提供相應(yīng)的電子受體，避免兩種細(xì)菌產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制關(guān)系，可以有效保證的細(xì)菌的正常生長(zhǎng)，從而可以達(dá)到同時(shí)檢測(cè)兩種細(xì)菌數(shù)量的目的。
有益效果：
1、本發(fā)明采用聯(lián)合檢測(cè)石油污水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的方法，該方法簡(jiǎn)單，容易操作，可以通過(guò)制備一種srb和nrb均適用的培養(yǎng)液，分別檢測(cè)兩種細(xì)菌的存在及細(xì)菌數(shù)量。
2、本發(fā)明為石油企業(yè)提供了一種方便開(kāi)展的聯(lián)合檢測(cè)石油污水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的方法，有利于石油企業(yè)針對(duì)污水環(huán)境中的硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌數(shù)量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。同時(shí)，為研究分析石油現(xiàn)場(chǎng)污水環(huán)境的硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的菌群結(jié)構(gòu)和水質(zhì)情況的評(píng)價(jià)提供重要的理論依據(jù)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
實(shí)施例1
本實(shí)施例是檢測(cè)某油田生產(chǎn)處理流程中一級(jí)生產(chǎn)分離器的生產(chǎn)水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的過(guò)程。具體過(guò)程如下：
在現(xiàn)場(chǎng)一級(jí)分離器的水相出口排出管線內(nèi)的殘液約3min后，用密封瓶采集水樣約200ml，并及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行低溫4℃保存。
配制硫酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需亞鐵鹽溶液，使用萬(wàn)分之一天平稱取分析純硫酸亞鐵銨(六水合)試劑1.4000g，并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min，取經(jīng)過(guò)120℃高溫高壓下滅菌30min后的無(wú)菌水100ml與紫外滅菌后的硫酸亞鐵銨試劑在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行混合溶解。
配制硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需硝酸根定性檢測(cè)溶液，使用萬(wàn)分之一天平稱取分析純二苯胺試劑0.5000g，并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min，取濃硫酸100ml緩慢與二苯胺試劑混合均勻備用。
配制硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需亞硝酸根定性檢測(cè)溶液，參考格里斯試劑(對(duì)氨基苯磺酸試劑和ɑ—萘胺試劑)配制方法，取分析純對(duì)氨基苯磺酸0.5g并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min后，與10％醋酸150ml混合均勻備用；取分析純ɑ—萘胺0.1g并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min后，與10％醋酸150ml和經(jīng)過(guò)120℃高溫高壓下滅菌30min后的無(wú)菌水20ml混合均勻備用。
取一定數(shù)量的細(xì)菌計(jì)數(shù)用玻璃空瓶及相關(guān)配套的瓶塞和鋁蓋，對(duì)所有器材進(jìn)行三輪次清洗，即去污水清洗、自來(lái)水清洗、蒸餾水清洗。
配制聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液，分別準(zhǔn)確稱取分析純?nèi)樗徕c8g、酵母粉1g、氯化鈉5g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化銨0.5g、硝酸鈉1g、硫酸鎂1.5g、抗壞血酸0.2g、乙二胺四乙酸0.08g、谷胱甘肽0.03g，與蒸餾水1000ml混合均勻后，采用0.2mol/l氫氧化鈉水溶液調(diào)ph值至7.3。
使用移液器準(zhǔn)確量取上述聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液9ml罐裝至清洗完畢的玻璃瓶中，使用配套的瓶塞和鋁蓋對(duì)罐裝完畢的細(xì)菌檢測(cè)玻璃瓶進(jìn)行密封后，在120℃高溫高壓下條件下進(jìn)行滅菌30min處理。
根據(jù)所取水樣中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌預(yù)估的細(xì)菌數(shù)量103～105個(gè)/ml，設(shè)計(jì)細(xì)菌計(jì)數(shù)稀釋濃度梯度對(duì)水樣進(jìn)行細(xì)菌梯度濃度計(jì)數(shù)檢測(cè)，計(jì)數(shù)檢測(cè)方法參考sy/t0532-2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》，使用無(wú)菌注射器吸取1ml水樣注入到1號(hào)瓶?jī)?nèi)并搖勻，重復(fù)前述步驟，進(jìn)行后續(xù)的細(xì)菌瓶稀釋至8號(hào)瓶即稀釋倍數(shù)為10-108。
根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)所取水樣的流程環(huán)境溫度為45℃，對(duì)完成稀釋梯度的硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)瓶，在45℃條件下恒溫培養(yǎng)14天。
經(jīng)過(guò)14天計(jì)數(shù)培養(yǎng)后，對(duì)聯(lián)合計(jì)數(shù)培養(yǎng)瓶進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)，使用一次性無(wú)菌注射器吸取各個(gè)稀釋梯度培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液0.5ml，在比色板中分別與亞鐵鹽溶液、硝酸根定性檢測(cè)溶液、亞硝酸根定性檢測(cè)溶液進(jìn)行混合后定性檢測(cè)和計(jì)數(shù)。
實(shí)施例1的結(jié)果表明此方法可以很好地進(jìn)行油田生產(chǎn)處理流程一級(jí)生產(chǎn)分離器中生產(chǎn)水的srb和nrb細(xì)菌的聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)。具體的計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果和效果對(duì)比如下表所示：
其中，+號(hào)代表細(xì)菌檢測(cè)呈陽(yáng)性；號(hào)代表細(xì)菌檢測(cè)呈陰性。
實(shí)施例2
本實(shí)施例是檢測(cè)某油田注水管匯的注水水樣中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的過(guò)程。具體過(guò)程如下：
在現(xiàn)場(chǎng)注水管匯的取樣點(diǎn)排出管線內(nèi)的殘液約3min后，用密封瓶采集水樣約100ml，并及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行低溫5℃保存。
配制硫酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需亞鐵鹽溶液，使用萬(wàn)分之一天平稱取分析純硫酸亞鐵銨(六水合)試劑0.3500g，并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌40min，取經(jīng)過(guò)125℃高溫高壓下滅菌40min后的無(wú)菌水100ml與紫外滅菌后的硫酸亞鐵銨試劑在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行混合溶解。
配制硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需硝酸根定性檢測(cè)溶液，使用萬(wàn)分之一天平稱取分析純二苯胺試劑0.5000g，并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min，取濃硫酸100ml緩慢與二苯胺試劑混合均勻備用。
配制硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需亞硝酸根定性檢測(cè)溶液，參考格里斯試劑(對(duì)氨基苯磺酸試劑和ɑ—萘胺試劑)配制方法，取分析純對(duì)氨基苯磺酸0.5g并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min后，與10％醋酸150ml混合均勻備用；取分析純ɑ—萘胺0.1g并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min后，與10％醋酸150ml和經(jīng)過(guò)120℃高溫高壓下滅菌30min后的無(wú)菌水20ml混合均勻備用。
取一定數(shù)量的細(xì)菌計(jì)數(shù)用玻璃空瓶及相關(guān)配套的瓶塞和鋁蓋，對(duì)所有器材進(jìn)行三輪次清洗，即去污水清洗、自來(lái)水清洗、蒸餾水清洗。
配制聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液，分別準(zhǔn)確稱取分析純?nèi)樗徕c3.75g、酵母粉0.4g、氯化鈉2.25g、磷酸氫二鉀0.2g、氯化銨0.225g、硝酸鉀0.45g、硫酸鎂0.65g、抗壞血酸0.075g、乙二胺四乙酸0.03g、谷胱甘肽0.01g，與蒸餾水500ml混合均勻后，采用0.1mol/l氫氧化鈉水溶液調(diào)ph值至7.5。
使用移液器準(zhǔn)確量取上述聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液9ml罐裝至清洗完畢的玻璃瓶中，使用配套的瓶塞和鋁蓋對(duì)罐裝完畢的細(xì)菌檢測(cè)玻璃瓶進(jìn)行密封后，在125℃高溫高壓下條件下進(jìn)行滅菌40min處理。
根據(jù)所取水樣中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌預(yù)估的細(xì)菌數(shù)量10～103個(gè)/ml，設(shè)計(jì)細(xì)菌計(jì)數(shù)稀釋濃度梯度為106個(gè)/ml對(duì)水樣進(jìn)行細(xì)菌梯度濃度計(jì)數(shù)檢測(cè)，計(jì)數(shù)檢測(cè)方法參考sy/t0532-2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》，使用無(wú)菌注射器吸取1ml水樣注入到1號(hào)瓶?jī)?nèi)并搖勻，重復(fù)前述步驟，進(jìn)行后續(xù)的細(xì)菌瓶稀釋至6號(hào)瓶即稀釋倍數(shù)為10-106。
根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)所取水樣的流程環(huán)境溫度為50℃，對(duì)完成稀釋梯度的硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)瓶，在50℃條件下恒溫培養(yǎng)7天。
經(jīng)過(guò)7天計(jì)數(shù)培養(yǎng)后，對(duì)聯(lián)合計(jì)數(shù)培養(yǎng)瓶進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)，使用一次性無(wú)菌注射器吸取各個(gè)稀釋梯度培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液1ml，在比色板中分別與亞鐵鹽溶液、硝酸根定性檢測(cè)溶液、亞硝酸根定性檢測(cè)溶液進(jìn)行混合后定性檢測(cè)和計(jì)數(shù)。
實(shí)施例2的結(jié)果表明此方法可以很好地進(jìn)行油田注水管匯注水水樣中的srb和nrb細(xì)菌的聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)。具體的計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果和效果對(duì)比如下表所示：
其中，+號(hào)代表細(xì)菌檢測(cè)呈陽(yáng)性；號(hào)代表細(xì)菌檢測(cè)呈陰性。
實(shí)施例3
本實(shí)施例是檢測(cè)某油田生產(chǎn)處理流程中生產(chǎn)水緩沖罐的水樣中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的過(guò)程。具體過(guò)程如下：
在現(xiàn)場(chǎng)生產(chǎn)水緩沖罐的水相出口排出管線內(nèi)的殘液約3min后，用密封瓶采集水樣約200ml，并及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行低溫5℃保存。
配制硫酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需亞鐵鹽溶液，使用萬(wàn)分之一天平稱取分析純硫酸亞鐵銨(六水合)試劑3.500g，并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌40min，取經(jīng)過(guò)120℃高溫高壓下滅菌40min后的無(wú)菌水100ml與紫外滅菌后的硫酸亞鐵銨試劑在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行混合溶解。
配制硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需硝酸根定性檢測(cè)溶液，使用萬(wàn)分之一天平稱取分析純二苯胺試劑0.5000g，并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min，取濃硫酸100ml緩慢與二苯胺試劑混合均勻備用。
配制硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需亞硝酸根定性檢測(cè)溶液，參考格里斯試劑(對(duì)氨基苯磺酸試劑和ɑ—萘胺試劑)配制方法，取分析純對(duì)氨基苯磺酸0.5g并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min后，與10％醋酸150ml混合均勻備用；取分析純ɑ—萘胺0.1g并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min后，與10％醋酸150ml和經(jīng)過(guò)120℃高溫高壓下滅菌30min后的無(wú)菌水20ml混合均勻備用。
取一定數(shù)量的細(xì)菌計(jì)數(shù)用玻璃空瓶及相關(guān)配套的瓶塞和鋁蓋，對(duì)所有器材進(jìn)行三輪次清洗，即去污水清洗、自來(lái)水清洗、蒸餾水清洗。
配制聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液，分別準(zhǔn)確稱取分析純?nèi)樗徕c10g、酵母粉1g、氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0.6g、氯化銨0.8g、硝酸鈉2g、硫酸鎂2.5g、抗壞血酸0.5g、乙二胺四乙酸0.07g、谷胱甘肽0.05g，與蒸餾水1000ml混合均勻后，采用0.5mol/l氫氧化鈉水溶液調(diào)ph值至7.2。
使用移液器準(zhǔn)確量取上述聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液9ml罐裝至清洗完畢的玻璃瓶中，使用配套的瓶塞和鋁蓋對(duì)罐裝完畢的細(xì)菌檢測(cè)玻璃瓶進(jìn)行密封后，在120℃高溫高壓下條件下進(jìn)行滅菌30min處理。
根據(jù)所取水樣中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌預(yù)估的細(xì)菌數(shù)量103～105個(gè)/ml，設(shè)計(jì)細(xì)菌計(jì)數(shù)稀釋濃度梯度對(duì)水樣進(jìn)行細(xì)菌梯度濃度計(jì)數(shù)檢測(cè)，計(jì)數(shù)檢測(cè)方法參考sy/t0532-2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》，使用無(wú)菌注射器吸取1ml水樣注入到1號(hào)瓶?jī)?nèi)并搖勻，重復(fù)前述步驟，進(jìn)行后續(xù)的細(xì)菌瓶稀釋至8號(hào)瓶即稀釋倍數(shù)為10-108。
根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)所取水樣的環(huán)境溫度為57℃，對(duì)完成稀釋梯度的硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)瓶，在57℃條件下恒溫培養(yǎng)14天。
經(jīng)過(guò)14天計(jì)數(shù)培養(yǎng)后，對(duì)聯(lián)合計(jì)數(shù)培養(yǎng)瓶進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)，使用一次性無(wú)菌注射器吸取各個(gè)稀釋梯度培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液0.5ml，在比色板中分別與亞鐵鹽溶液、硝酸根定性檢測(cè)溶液、亞硝酸根定性檢測(cè)溶液進(jìn)行混合后定性檢測(cè)和計(jì)數(shù)。
實(shí)施例3的結(jié)果表明此方法可以很好地進(jìn)行油田生產(chǎn)處理流程一級(jí)生產(chǎn)分離器中生產(chǎn)水的srb和nrb細(xì)菌的聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)。具體的計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果和效果對(duì)比如下表所示：
其中，+號(hào)代表細(xì)菌檢測(cè)呈陽(yáng)性；號(hào)代表細(xì)菌檢測(cè)呈陰性。
實(shí)施例4
本實(shí)施例是檢測(cè)某油田生產(chǎn)管匯的注水水樣中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的過(guò)程。具體過(guò)程如下：
在現(xiàn)場(chǎng)注水管匯的取樣點(diǎn)排出管線內(nèi)的殘液約2min后，用密封瓶采集油水樣約200ml，并及時(shí)進(jìn)行油水分離后送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行低溫8℃保存。
配制硫酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需亞鐵鹽溶液，使用萬(wàn)分之一天平稱取分析純硫酸亞鐵銨(六水合)試劑0.7000g，并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌40min，取經(jīng)過(guò)120℃高溫高壓下滅菌40min后的無(wú)菌水100ml與紫外滅菌后的硫酸亞鐵銨試劑在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行混合溶解。
配制硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需硝酸根定性檢測(cè)溶液，使用萬(wàn)分之一天平稱取分析純二苯胺試劑0.5000g，并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min，取濃硫酸100ml緩慢與二苯胺試劑混合均勻備用。
配制硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)檢測(cè)所需亞硝酸根定性檢測(cè)溶液，參考格里斯試劑(對(duì)氨基苯磺酸試劑和ɑ—萘胺試劑)配制方法，取分析純對(duì)氨基苯磺酸0.5g并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min后，與10％醋酸150ml混合均勻備用；取分析純ɑ—萘胺0.1g并在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行紫外滅菌30min后，與10％醋酸150ml和經(jīng)過(guò)120℃高溫高壓下滅菌30min后的無(wú)菌水20ml混合均勻備用。
取一定數(shù)量的細(xì)菌計(jì)數(shù)用玻璃空瓶及相關(guān)配套的瓶塞和鋁蓋，對(duì)所有器材進(jìn)行三輪次清洗，即去污水清洗、自來(lái)水清洗、蒸餾水清洗。
配制聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液，分別準(zhǔn)確稱取分析純?nèi)樗徕c2g、酵母粉0.1g、氯化鈉3g、磷酸氫二鉀0.2g、氯化銨0.15g、硝酸鈉0.5g、硫酸鎂0.65g、抗壞血酸0.075g、乙二胺四乙酸0.05g、谷胱甘肽0.01g，與蒸餾水1000ml混合均勻后，采用0.05mol/l氫氧化鈉水溶液調(diào)ph值至7.5。
使用移液器準(zhǔn)確量取上述聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液9ml罐裝至清洗完畢的玻璃瓶中，使用配套的瓶塞和鋁蓋對(duì)罐裝完畢的細(xì)菌檢測(cè)玻璃瓶進(jìn)行密封后，在120℃高溫高壓下條件下進(jìn)行滅菌40min處理。
根據(jù)所取水樣中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌預(yù)估的細(xì)菌數(shù)量10～102個(gè)/ml，設(shè)計(jì)細(xì)菌計(jì)數(shù)稀釋濃度梯度對(duì)水樣進(jìn)行細(xì)菌梯度濃度計(jì)數(shù)檢測(cè)，計(jì)數(shù)檢測(cè)方法參考sy/t0532-2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》，使用無(wú)菌注射器吸取1ml水樣注入到1號(hào)瓶?jī)?nèi)并搖勻，重復(fù)前述步驟，進(jìn)行后續(xù)的細(xì)菌瓶稀釋至5號(hào)瓶即稀釋倍數(shù)為10-105。
根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)所取水樣的環(huán)境溫度為60℃，對(duì)完成稀釋梯度的硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)瓶，在60℃條件下恒溫培養(yǎng)7天。
經(jīng)過(guò)7天計(jì)數(shù)培養(yǎng)后，對(duì)聯(lián)合計(jì)數(shù)培養(yǎng)瓶進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)，使用一次性無(wú)菌注射器吸取各個(gè)稀釋梯度培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液1ml，在比色板中分別與亞鐵鹽溶液、硝酸根定性檢測(cè)溶液、亞硝酸根定性檢測(cè)溶液進(jìn)行混合后定性檢測(cè)和計(jì)數(shù)。
實(shí)施例4的結(jié)果表明此方法可以很好地進(jìn)行油田注水管匯注水水樣中的srb和nrb細(xì)菌的聯(lián)合計(jì)數(shù)檢測(cè)。具體的計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果和效果對(duì)比如下表所示：
其中，+號(hào)代表細(xì)菌檢測(cè)呈陽(yáng)性；號(hào)代表細(xì)菌檢測(cè)呈陰性。
本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)石油污水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的方法中采用的聯(lián)合培養(yǎng)液碳源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足情況下，分別提供相應(yīng)的電子受體，避免兩種細(xì)菌產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制關(guān)系，可以有效保證的細(xì)菌的正常生長(zhǎng)，從而可以達(dá)到同時(shí)檢測(cè)兩種細(xì)菌數(shù)量的目的。本發(fā)明的聯(lián)合檢測(cè)石油污水中硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌的方法與采用單一培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)檢測(cè)出的細(xì)菌數(shù)目相同，說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)方法非常準(zhǔn)確。