本發(fā)明涉及一株副干酪乳桿菌及其應用,屬于食品防腐領域。
背景技術:
乳酸菌(lacticacidbacteria,lab)歸類于乳酸菌科。特征是革蘭氏染色陽性,無芽孢(個別屬除外),不運動或少運動,耐酸的球菌或桿菌。并能利用可發(fā)酵糖產生大量乳酸的細菌。乳酸菌廣泛存在于人和動物腸道、許多食品中。乳酸菌不但可以提升食品的營養(yǎng)價值,改善食品風味,并幫助改善食品的保藏性。還可以調節(jié)人體胃腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡,對人和動物健康都有益。乳酸菌通過發(fā)酵碳水化合物,可以分泌大量有機酸,乳酸菌素,過氧化氫等抑菌物質來抑制腐敗菌的生長來改善食品的風味和品質。
粉條,是以紅薯,馬鈴薯等為原料,經過磨漿沉淀等加工后制成的絲條狀干燥的特色傳統(tǒng)食品。一般鮮粉條的保質期在10天左右,尤其在夏季,保質期更短往往在4,5天就已經開始腐敗了。而通過添加食品添加劑,防腐劑來延長保鮮時間,對產品風味會有影響,對人體也不好。乳酸菌產生的有機酸,乳酸菌素等能抑制大量腐敗菌的生長。但是產酸能力過強的乳酸菌也會導致粉條的口感、質感下降,風味不佳等問題。
菊粉是植物中儲備性多糖,可以穩(wěn)定血糖,防止并發(fā)癥,降低血脂防止心血管疾病等功效。它作為膳食纖維,促進礦物元素尤其是鈣元素吸收。另外,菊粉是一種益生素,能夠使乳酸菌增殖,從而促進腸道有益菌繁殖,對人體健康大有益處。而乳酸菌通過發(fā)酵菊粉可以使其轉化為一些果糖,低聚糖使人體易于吸收,而發(fā)酵產生的有機酸也能促進人體腸道消化。
技術實現(xiàn)要素:
為解決上述問題,本發(fā)明篩選得到一株產酸能力適中,并且高效利用菊粉的副干酪乳桿菌。
本發(fā)明的第一個目的是提供一株副干酪乳桿菌(lactobacillusparacasei)dy2,所述副干酪乳桿菌dy2已于2017年6月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,分類學命名為副干酪乳桿菌dy2lactobacillusparacaseidy2,保藏編號為cctccno:m2017303,保藏地址為中國武漢武漢大學。
在本發(fā)明的一種實施方式中,所述副干酪乳桿菌dy2是一種兼性細菌,在好氧或厭氧條件下均能生存和生長,在厭氧條件下生長迅速。
在本發(fā)明的一種實施方式中,所述副干酪乳桿菌dy2經革蘭氏染色確定為革蘭氏陽性菌,平板培養(yǎng)基菌落中等大小,凸起,白色濕潤。
在本發(fā)明的一種實施方式中,所述副干酪乳桿菌dy2能夠利用半乳糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖或木糖產酸。
本發(fā)明的第二個目的是提供所述副干酪乳桿菌dy2在食品防腐中的應用。
在本發(fā)明的一種實施方式中,所述應用是利用副干酪乳桿菌dy2抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌在食品中繁殖。
本發(fā)明的第三個目的是提供所述副干酪乳桿菌dy2在粉條保鮮中的應用。
在本發(fā)明的一種實施方式中,所述應用是將副干酪乳桿菌dy2以1-4%的接種量加入粉條中。
在本發(fā)明的一種實施方式中,所述應用是將副干酪乳桿菌dy2以2%的接種量加入粉條中。
在本發(fā)明的一種實施方式中,所述應用是在溫度為35-38℃條件下進行粉條保鮮。
本發(fā)明的第四個目的是提供所述副干酪乳桿菌dy2在發(fā)酵消化益生元菊粉中的應用。
本發(fā)明的第五個目的是提供一種包含所述副干酪乳桿菌dy2的微生物菌劑。
在本發(fā)明的一種實施方式中,所述微生物菌劑為固態(tài)菌劑或液態(tài)菌劑。
本發(fā)明有益效果
本發(fā)明的副干酪乳桿菌可以有效的延長鮮粉條的保藏時間,防止粉條的快速腐敗,比未加副干酪乳桿菌的粉條保藏時間提高了6天。同時,本發(fā)明的副干酪乳桿菌產酸能力適中,不會導致粉條酸化,并能保持住粉條的風味。此外,本發(fā)明的副干酪乳桿菌能高效利用益生元菊粉,利于腸道消化,有助于人體腸道健康。
生物材料保藏
本發(fā)明的副干酪乳桿菌(lactobacillusparacasei)dy2,已于2017年6月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,分類學命名為副干酪乳桿菌dy2lactobacillusparacaseidy2,保藏編號為cctccno:m2017303,保藏地址為中國武漢武漢大學。
附圖說明
圖1是副干酪乳桿菌在平板培養(yǎng)基形態(tài);
圖2是副干酪乳桿菌在mrs培養(yǎng)基生長曲線;
圖3是副干酪乳桿菌生長過程中ph變化曲線;
圖4是副干酪乳桿菌在菊粉發(fā)酵培養(yǎng)基生長曲線。
具體實施方式
實施例1:菌株的篩選
本發(fā)明菌株采用平板稀釋分離法從酸菜樣品中分離篩選出抑菌效果好的菌株。
分離篩選方法如下所述:
1、混合菌種的稀釋:從購買的酸菜樣品,將1g酸菜放入mrs培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時,并進行菌種的梯度稀釋。
2、mrs培養(yǎng)基:蛋白胨10.0,牛肉膏8.0,酵母粉4.0,葡萄糖20.0,磷酸氫二鉀2.0,檸檬酸三銨2.0,乙酸鈉5.0,七水硫酸鎂0.58,四水硫酸錳0.25,吐溫801ml,蒸餾水1l,115℃滅菌20分鐘。
3、菌株的初篩:取梯度稀釋后的菌液100微升涂于初篩添加有溴甲酚紫的mrs固體培養(yǎng)基平板,37℃培養(yǎng)24小時。選擇生長快、菌落大、黃色菌圈大的菌株,經過多次初篩,得到3株乳酸菌種,將其編號為dy1-dy3。
4、菌種的復篩:將初篩出來的3株菌接入到復篩液體培養(yǎng)基(蛋白胨10.0,牛肉膏8.0,酵母粉4.0,葡萄糖20.0,磷酸氫二鉀2.0,檸檬酸三銨2.0,乙酸鈉5.0,七水硫酸鎂0.58,四水硫酸錳0.25,吐溫801ml,蒸餾水1l,ph6.5),37℃200rpm培養(yǎng)24h,按照實施例3的方法測定其抑菌效果。
5、最優(yōu)菌種的篩選:dy2相對于dy1,dy3抑菌效果最佳。最終篩選出編號dy2的菌種作為保鮮菌株。
6、菌種的鑒定:將篩選出來的菌種dy1-dy3涂布于mrs固體培養(yǎng)基,挑取單菌落利用通用引物1492r和27f進行擴增,將擴增產物交由生工生物工程(上海)有限公司進行16srrna測序,序列所得結果通過ncbi的nucleotideblast與genbank中的模式菌株進行同源性比對。比對結果顯示與genbank中相關模式菌株的16srna有99%的相似性,確定該菌株為副干酪乳桿菌(lactobacillusparacasei)。
圖1是本發(fā)明的副干酪乳桿菌dy2在平板培養(yǎng)基上的形態(tài)圖片。副干酪乳桿菌dy2的16srrna序列如seqidno:1所示。
所述副干酪乳桿菌(lactobacillusparacasei)dy2,已于2017年6月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為cctccno:m2017303。
實施例2:副干酪乳桿菌dy2生理生化特征的鑒定
生理生化特征:
(1)石蕊牛奶實驗:牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白,在其中加入石蕊作指示劑和氧化還原指示劑,石蕊在中性時呈淡紫色酸性時呈粉紅色堿性時呈藍色還原時,則自上而下使牛奶褪色還原為白色。乳酸細菌發(fā)酵乳糖產酸,石蕊變紅,當酸度很高時,可使牛奶凝固。觀察接種和培養(yǎng)后的石蕊牛奶實驗結果,37℃培養(yǎng)一天即可觀測石蕊牛奶產酸和凝固反應。
(2)過氧化氫酶測定:將實驗菌接種于pyg培養(yǎng)基斜面上,37℃培養(yǎng)24h,取培養(yǎng)物,涂在干凈的載玻片上,然后在其上滴加5%的過氧化氫,有氣泡的則為陽性反應,無氣泡為陰性反應。
(3)淀粉水解實驗:將菌種接種于含有可溶性淀粉的基礎培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h,取少許培養(yǎng)液于比色盤內,同時取未接種的培養(yǎng)液作對照,分別在其中加入盧哥氏碘液。不顯色表示淀粉水解,顯藍黑色或藍紫色時,表示淀粉未水解或水解不完全。
(4)明膠液化實驗:將實驗菌株接種于含有明膠的基礎培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng)24h,以一支未接種的試管作為對照。將接種的和未接種的對照管置于4℃冰箱中,等待對照管凝固后記錄實驗結果,反復觀察對比多次。如對照管凝固時,接種管液化為陽性反應,凝固為陰性反應。
(5)v-p實驗:將實驗菌接種于pyg培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h,取培養(yǎng)液在其中加入茶酚和氫氧化鉀,置于不加蓋的試管中混合,并陸續(xù)振蕩30分鐘,顯示紅色為陽性反應。
(6)葡聚糖實驗:將新鮮的培養(yǎng)物接種于含有蔗糖的培養(yǎng)基斜面上,37℃培養(yǎng)24h。斜面上培養(yǎng)物形成粘稠的菌苔,表明產生葡聚糖,為陽性反應,否則為陰性反應。
(7)硫化氫實驗:將新鮮的培養(yǎng)物接種于含有半胱氨酸或胱氨酸的培養(yǎng)基中,用無菌的鑷子夾取一乙酸鉛濾紙條懸掛于接種試管內,下端接近培養(yǎng)基表面而不接觸液面,上端用棉塞塞緊,實驗中設空白對照,在沒接種的試管培養(yǎng)基上懸掛乙酸鉛紙條,置于37℃培養(yǎng)24h,進行觀察比較,紙條變黑色為陽性反應。
(8)葡萄糖產氣:在1升py基礎培養(yǎng)基內加入20g葡萄糖和0.5%的吐溫80,再添加6g瓊脂和的澳甲酚紫作指示劑,分裝試管。把菌液滴加入上述融化的培養(yǎng)基中,充分混勻,再在上面加一層7mm厚的的瓊脂,置37℃培養(yǎng)24h。軟瓊脂柱內有氣泡或出現(xiàn)將的瓊脂層向上頂?shù)默F(xiàn)象,表示產氣。
(9)精氨酸產氨:接種新鮮的實驗菌種于含精氨酸的培養(yǎng)基中,并同時接種不含精氨酸的培養(yǎng)基作對照,置37℃培養(yǎng)一天,取少許培養(yǎng)液于比色盤中,加奈氏試劑數(shù)滴,當產氨時會出現(xiàn)橙黃或黃褐的沉淀。含精氨酸培養(yǎng)液與試劑的反應強于對照液才能是陽性反應。
糖發(fā)酵實驗:將需要測定的糖或醇類等碳水化合物加入基礎培養(yǎng)基中,分別分裝到5ml試管。37℃,振蕩培養(yǎng)24h。檢測時取培養(yǎng)液少許置于比色盤內,同時取未加碳水化合物的培養(yǎng)液作為對照,滴加btb-mr試劑比較顏色的變化,記錄產酸的強弱。
dy2菌株的生理生化特性見表1,表2,為石蕊牛奶,v-p實驗陽性,淀粉水解、過氧化氫酶、硫化氫實驗、葡聚糖、葡萄糖產氣、精氨酸產氨、明膠液化呈陰性。能發(fā)酵利用麥芽糖,鼠李糖,d-半乳糖,甘露糖,阿拉伯糖產酸,產氣。
表1dy2菌的生理特性
注:“-”表示陰性,“+”表示陽性
表2dy2菌糖發(fā)酵結果
注:“+”表示強發(fā)酵,“d”表示略微發(fā)酵
實施例3:副干酪乳桿菌抑菌性研究
指示菌菌液的制備:將大腸桿菌、沙門氏菌和金黃葡萄球菌三種指示菌接種于lb液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24h。
采用牛津杯法:取直徑約90mm的平板,分別傾注加熱融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基18-20ml,使其在平板內均勻攤布,放置水平臺面上使凝固,作為底層。另取半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂含量為1%)適量加熱融化后,放冷至48-50℃,沒50-100ml培養(yǎng)基加入指示菌菌懸液0.1-0.2ml,在每1個平板中分別加入5ml,使其在底層上均勻攤布,作為菌層。在每1平板中以等距離均勻安置牛津杯4個備用,每個雙層平板中的牛津杯中分別滴裝200μl乳酸菌上清液,37℃培養(yǎng)18h后,測量各抑菌圈直徑以作出評價。
結果表明:副干酪乳桿菌dy2對大腸桿菌,沙門氏菌,金黃色葡萄球菌有良好的抑制作用且效果優(yōu)秀,抑制效果略低于購買的副干酪乳桿菌cicc22709。
表3副干酪乳桿菌抑菌效果
實施例4:副干酪乳桿菌發(fā)酵菊粉實驗
活化培養(yǎng)基:蛋白陳10.0g,牛肉粉8.0g,酵母粉4.0g,葡萄糖20.0g,磷酸氫二鉀2.0g,乙酸鈉5.0g,檸檬酸三銨2.0g,硫酸鎂0.2g,硫酸錳0.05g,蒸餾水1000ml。乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白陳10.0g,酵母粉10g,菊粉10.0g,葡萄糖10.0g,無水氯化鈣0.01g,氯化鈉0.08g,七水硫酸鎂0.8g,磷酸氫二鉀0.04g,磷酸二氫鉀0.04g,碳酸氫鈉0.4g,去離子水1000ml,ph調至6.5,115℃高壓滅菌20min-30min。從斜面上挑取乳酸菌接種于上述活化培養(yǎng)基,37℃,200rpm振蕩培養(yǎng)12h,再以2%的接種量轉接到乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24h測定生長狀況。
菊粉的含量測定通過苯酚硫酸法進行測定,菊粉含量等于總糖含量減去還原糖的量,總糖的含量通過苯酚硫酸法測定,還原糖的含量通過dns法測定。
結果表明:副干酪乳桿菌dy2相對于dy1,dy3以及購買的副干酪乳桿菌cicc22709對菊粉有更好的利用率,另外相對于植物乳桿菌,鼠李糖乳桿菌有特別明顯的優(yōu)勢。另外關于副干酪乳桿菌利用菊粉的研究還比較少,但表現(xiàn)出優(yōu)于其他菌株的優(yōu)先效果。
表4乳酸菌發(fā)酵消化菊粉情況
實施例5:副干酪乳桿菌粉條保鮮實驗
(1)乳酸菌菌液制備:將保存管中的副干酪乳桿菌按2%的接種量接種于mrs液體培養(yǎng)基中進行活化,37℃下活化24h,再以1%的接種量轉接于mrs液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h,獲得菌液。
(2)粉條的制備:選用馬鈴薯淀粉,用淀粉量50%的熱水將淀粉調成稀糊狀,然后再用沸水向調好的淀粉稀糊中猛沖,迅速攪拌,加入0.5%的明礬,通過壓粉機將粉壓入沸水,反應40秒,迅速用冷水冷卻,將水瀝干,稱重保持每袋粉條重量約250g。
(3)乳酸菌的添加:取10袋粉條為一組,以2%的乳酸菌添加量分別加入副干酪乳桿菌dy1、dy2、dy3和cicc22709。
(4)菊粉的添加:另外在每袋250g的粉條加入10g的菊粉,進行混合均勻。
在第10天進行感官評價,結果如表6所示,結果表明副干酪乳桿菌dy2的保藏時間最長,且粉條風味保持較好,而購買的副干酪乳桿菌cicc22709,由于產酸能力強,導致最終粉條酸味過重,彈性下降。
表5副干酪乳桿菌粉條保藏效果
實施例5:副干酪乳桿菌dy2菌添加量對粉條保藏效果
(1)乳酸菌菌液制備:將保存管中的副干酪乳桿菌按2%的接種量接種于mrs液體培養(yǎng)基中進行活化,37℃下活化24h,再以1%的接種量轉接于mrs液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h,獲得菌液。
(2)粉條的制備:選用馬鈴薯淀粉,用淀粉量50%的熱水將淀粉調成稀糊狀,然后再用沸水向調好的淀粉稀糊中猛沖,迅速攪拌,加入0.5%的明礬,通過壓粉機將粉壓入沸水,反應40秒,迅速用冷水冷卻,將水瀝干,稱重保持每袋粉條重量約250g。
(3)乳酸菌的添加:取10袋粉條為一組,第一組作為對照不添加乳酸菌,第二組以0.5%的乳酸菌添加量加入粉條,第三組以1%的乳酸菌添加量加入,第四組以1.5%的乳酸菌添加量加入,第五組以2%的乳酸菌添加量加入,第六組以3%的乳酸菌添加量加入,第七組以4%的乳酸菌添加量加入。
(4)菊粉的添加:另外在每袋250g的粉條加入10g的菊粉,進行混合均勻。
表6副干酪乳桿菌添加量對粉條保藏效果
結果表明,添加副干酪乳桿菌有助于提高粉條的保藏期限,不添加的保藏期限效果明顯很差,在自然狀態(tài)下,副干酪乳桿菌的添加量與保藏期限密切相關,接種量為2%時,保藏效果最佳達到了14天,比未添加的整整提高了6天。說明副干酪的乳桿菌的添加可以有效的提高鮮粉條的保藏期限??梢院芎脩糜谑称繁2?。另外添加菊粉在食用后可以很好的刺激腸道乳酸菌增值,進一步延長其保藏時間,而菊粉作為益生元也有益于健康。
實施例6:副干酪乳桿菌dy2對粉條風味物質的影響
根據形態(tài),色澤,氣味與滋味,雜質情況對粉條進行感官評價。
表7粉條的感官指標
評分標準:5分最好;4分好;3分一般;2分不合格;1分太差
表8不同接種量感官評分
結果表明:2%的接種量對粉條感官影響最好,過低的接種量并不能對粉條進行有效的保藏,而過高的接種量雖然可以有效的提高保藏時間,但過高的接種量會導致感官受影響,導致粉條過酸,影響口感。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上,但其并非用以限定本發(fā)明,任何熟悉此技術的人,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內,都可做各種的改動與修飾,因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
序列表
<110>江南大學
<120>一株副干酪乳桿菌及其應用
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>968
<212>dna
<213>人工合成
<400>1
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