本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒及測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：腦卒中(cerebralstroke)是一種急性腦血管疾病，是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病，包括缺血性和出血性卒中。腦卒中具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重頭痛、昏厥、失去意識(shí)等，這也成為了中國成年人殘疾的首要原因。腦卒中患者需要長期服用降壓藥，定期進(jìn)行常規(guī)檢查，控制顱內(nèi)壓，可見腦卒中患者給社會(huì)和家庭帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腦卒中是一種由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起的復(fù)雜性疾病，對(duì)腦卒中發(fā)病機(jī)制的探索進(jìn)而尋找出適合診斷治療藥物已然成為了現(xiàn)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)。而在腦卒中的發(fā)病機(jī)制尚未清晰闡明的情況下，對(duì)腦卒中的預(yù)防以及早期檢測(cè)更是刻不容緩。腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase，ahcy)是一種蛋白編碼基因，它能夠催化s-腺苷同型半胱氨酸可逆水解為腺苷和l-高半胱氨酸。該蛋白的缺乏是高蛋氨酸血癥的極大風(fēng)險(xiǎn)因素，進(jìn)而提高腦卒中的患病風(fēng)險(xiǎn)。腺苷高半胱氨酸酶是由位于20號(hào)染色體的腺苷高半胱氨酸酶基因(adenosylhomocysteinasegene，ahcy)(chr20：34234840-34311976)編碼而成的?，F(xiàn)在國內(nèi)外的研究已經(jīng)確定同型半胱氨酸水平與腦卒中的發(fā)生有著較大的關(guān)聯(lián)，但是對(duì)同型半胱氨酸水平的影響因素與其調(diào)控機(jī)制的研究較少。目前關(guān)于腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒和測(cè)定方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒，對(duì)指定基因啟動(dòng)子區(qū)域dna甲基化水平的進(jìn)行測(cè)定，是一種檢測(cè)方便、普適度高、準(zhǔn)確率高的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的測(cè)定方法，該方法檢測(cè)方便、普適度高、準(zhǔn)確率高。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括dan提取液、熒光定量pcr反應(yīng)液、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和多個(gè)帶蓋密封管，所述熒光定量pcr反應(yīng)液包括一對(duì)腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物：primerf：5’-ggtcgtaatcggttgtag-3’(seqidno.1)和primerr：5’-caattcctattcccaaactaaa-3’(seqidno.2)。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑盒還包括洗滌液和洗脫液。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的熒光定量pcr反應(yīng)液還包括10×pcrbuffer、mgcl2、dntps、熱啟動(dòng)taqdna酶、dna模板、無菌雙蒸水以及熒光染料。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的熒光染料為2×sybrgreeni。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的pcr反應(yīng)液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動(dòng)taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μl。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的陽性對(duì)照為正常人樣本的基因組完全甲基化后所得到的完全dna甲基化樣本；所述陰性對(duì)照為無菌雙蒸水。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的測(cè)定方法，其包括dna提取步驟：提取全血基因組dna并檢測(cè)dna的濃度；用甲基化試劑盒對(duì)全血基因組dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化步驟：用ezdnamethylation-gold試劑盒將上述提取額全血基因組dna與亞硫酸氫鹽反應(yīng)會(huì)使單鏈中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?，然后?jīng)過上樣、洗滌、洗脫等步驟得到轉(zhuǎn)化后的dna；dna甲基化水平測(cè)定步驟：上述轉(zhuǎn)化后的dna作為樣本dna加入含熒光定量pcr反應(yīng)液進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，使基因序列進(jìn)行倍數(shù)擴(kuò)增，每一個(gè)樣本dna對(duì)應(yīng)一個(gè)的擴(kuò)增曲線；曲線與既設(shè)閾值相交的橫坐標(biāo)點(diǎn)即為ct值，并通過下述計(jì)算式計(jì)算出甲基化率：δδct＝dna樣本(ct靶基因-ctactb)-陽性對(duì)照(ct靶基因-ctactb)；其中，δδct是指甲基化率，ct靶基因是指目標(biāo)基因的pcr循環(huán)數(shù)即腺苷高半胱氨酸酶基因的ct值，ctactb是指一種常用的內(nèi)參基因即actb的pcr循環(huán)數(shù)。作為進(jìn)一步的方案，上述測(cè)定方法中所述的pcr反應(yīng)液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動(dòng)taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μl。作為進(jìn)一步的方案，上述測(cè)定方法中所述的甲基化水平測(cè)定步驟具體如下：首先將轉(zhuǎn)化后的dna樣本加入到熱啟動(dòng)taqdna酶中，然后加入一對(duì)腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物primerf和primerr；最后依次加入dna模板、10×pcrbuffer、mgcl2、dntps、2×sybrgreeni以及無菌雙蒸水。作為進(jìn)一步的方案，上述測(cè)定方法中所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃，10min；95℃，20s，退火溫度，20s，72℃，single，30s，45個(gè)循環(huán)；溶解曲線95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保溫40℃，10min。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：1.本發(fā)明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒采用熒光定量pcr技術(shù)，具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，特異性強(qiáng)，精確定量的優(yōu)勢(shì)，確保診斷結(jié)果的精確性；2.本發(fā)明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒是基于血漿、唾液、尿液等體液檢查的試劑盒，隨時(shí)隨地進(jìn)行檢測(cè)，并且能在較短時(shí)間內(nèi)取得檢測(cè)結(jié)果；3.本發(fā)明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)費(fèi)用低、易于為大眾所接受。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。附圖說明圖1為腺苷高半胱氨酸酶基因的染色體定位圖。圖2為腺苷高半胱氨酸酶基因的測(cè)序圖。圖3為腺苷高半胱氨酸酶基因的電泳圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括dan提取液、熒光定量pcr反應(yīng)液、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和多個(gè)帶蓋密封管，所述熒光定量pcr反應(yīng)液包括一對(duì)腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物：primerf：5’-ggtcgtaatcggttgtag-3’(seqidno.1)和primerr：5’-caattcctattcccaaactaaa-3’(seqidno.2)。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑盒還包括洗滌液和洗脫液。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的熒光定量pcr反應(yīng)液還包括10×pcrbuffer、mgcl2、dntps、熱啟動(dòng)taqdna酶、dna模板、無菌雙蒸水以及熒光染料。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的熒光染料為2×sybrgreeni。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的pcr反應(yīng)液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動(dòng)taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μl。作為進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的陽性對(duì)照為正常人樣本的基因組完全甲基化后所得到的完全dna甲基化樣本；所述陰性對(duì)照為無菌雙蒸水。本發(fā)明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的測(cè)定方法，其包括dna提取步驟：提取全血基因組dna并檢測(cè)dna的濃度；利用甲基化試劑盒對(duì)全血基因組dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化步驟：用ezdnamethylation-gold試劑盒將上述提取額全血基因組dna與亞硫酸氫鹽反應(yīng)會(huì)使單鏈中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?，然后?jīng)過上樣、洗滌、洗脫等步驟得到轉(zhuǎn)化后的dna；dna甲基化水平測(cè)定步驟：上述轉(zhuǎn)化后的dna作為樣本dna加入含熒光定量pcr反應(yīng)液進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，使基因序列進(jìn)行倍數(shù)擴(kuò)增，每一個(gè)樣本dna對(duì)應(yīng)一個(gè)的擴(kuò)增曲線；曲線與既設(shè)閾值相交的橫坐標(biāo)點(diǎn)即為ct值，并通過下述計(jì)算式計(jì)算出甲基化率：δδct＝dna樣本(ct靶基因-ctactb)-陽性對(duì)照(ct靶基因-ctactb)；其中，δδct是指甲基化率，ct靶基因是指目標(biāo)基因的pcr循環(huán)數(shù)即腺苷高半胱氨酸酶基因的ct值，ctactb是指一種常用的內(nèi)參基因即actb的pcr循環(huán)數(shù)。作為進(jìn)一步的方案，上述方法中所述的pcr反應(yīng)液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動(dòng)taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μl。作為進(jìn)一步的方案，上述方法中所述的甲基化水平測(cè)定步驟具體如下：首先將轉(zhuǎn)化后的dna樣本加入到熱啟動(dòng)taqdna酶中，然后加入一對(duì)腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物primerf和primerr；最后依次加入dna模板、10×pcrbuffer、mggl2、dntps、2×sybrgreeni以及無菌雙蒸水。作為進(jìn)一步的方案，上述方法中所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃，10min；95℃，20s，退火溫度，20s，72℃，single，30s，45個(gè)循環(huán)；溶解曲線95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保溫40℃，10min。由于腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase，ahcy)是一種蛋白編碼基因，它能夠催化s-腺苷同型半胱氨酸可逆水解為腺苷和l-高半胱氨酸。腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化水平會(huì)導(dǎo)致該基因的低表達(dá)甚至表達(dá)沉默，導(dǎo)致血氨大幅度升高，可能成為腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，通過檢測(cè)腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平作為非診斷性檢測(cè)腦卒中的一種方法，為輔助診斷腦卒中提供依據(jù)。以下是本發(fā)明具體的實(shí)施例，在下述實(shí)施例中，除在本發(fā)明有特殊限定外，所采用的試劑、原料和設(shè)備均可以通過購買獲得。實(shí)施例1一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括dan提取液、熒光定量pcr反應(yīng)液、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和多個(gè)帶蓋密封管，所述熒光定量pcr反應(yīng)液包括所述的pcr反應(yīng)液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動(dòng)taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μl；其中primerf和primerr核苷酸序列如下：primerf：5’-ggtcgtaatcggttgtag-3’(seqidno.1)和primerr：5’-caattcctattcccaaactaaa-3’(seqidno.2)：所述的陽性對(duì)照為正常人樣本的基因組完全甲基化后所得到的完全dna甲基化樣本；所述陰性對(duì)照為無菌雙蒸水。實(shí)施例2一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的測(cè)定方法，其包括dna提取步驟：利用lab-aid820全自動(dòng)核酸提取儀提取全血基因組dna并利用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)dna的濃度；用甲基化試劑盒對(duì)全血基因組dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化步驟：用ezdnamethylation-gold試劑盒將上述提取額全血基因組dna與亞硫酸氫鹽反應(yīng)會(huì)使單鏈中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?，然后?jīng)過上樣、洗滌、洗脫等步驟得到轉(zhuǎn)化后的dna；dna甲基化水平測(cè)定步驟：上述轉(zhuǎn)化后的dna作為樣本dna加入含熒光定量pcr反應(yīng)液進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，使基因序列進(jìn)行倍數(shù)擴(kuò)增，每一個(gè)樣本dna對(duì)應(yīng)一個(gè)的擴(kuò)增曲線，曲線與既設(shè)閾值相交的橫坐標(biāo)點(diǎn)即為ct值，并通過下述計(jì)算式計(jì)算出甲基化率：δδct＝dna樣本(ct靶基因-ctactb)-陽性對(duì)照(ct靶基因-ctactb)；其中，δδct是指甲基化率，ct靶基因是指目標(biāo)基因的pcr循環(huán)數(shù)即腺苷高半胱氨酸酶基因的ct值，ctactb是指一種常用的內(nèi)參基因即actb的pcr循環(huán)數(shù)。所述的pcr反應(yīng)液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動(dòng)taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μl；所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件如表1：表1由圖1可知被檢測(cè)序列所在區(qū)域具體位置為chr20：32891017-32891140，據(jù)此進(jìn)行后續(xù)甲基化分析；由圖2的dna序列分析結(jié)果表明，模板dna的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成功；圖3顯示毛細(xì)管電泳證實(shí)擴(kuò)增片段長度為124bp。應(yīng)用實(shí)施例1選擇樣本：對(duì)深圳地區(qū)腦卒中病人172例作為病例組(62.00(61.00，67.00)歲)和年齡匹配且無腦卒中家族史的289名正常者作為對(duì)照組(65.00(59.00，69.00)歲)；所有研究對(duì)象在知情同意的前提下，抽血檢測(cè)尿酸水平、甘油三酯等一般生化指標(biāo)，同時(shí)抽取靜脈血3ml作為樣本入edta抗凝管中，-80℃低溫儲(chǔ)存，備用；dna提取步驟：利用lab-aid820全自動(dòng)核酸提取儀(中國廈門，致善生物科技)提取全血基因組dna并利用nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(美國，thermofisherscientific)檢測(cè)dna的濃度；用甲基化試劑盒對(duì)全血基因組dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化步驟：用ezdnamethylation-gold試劑盒將上述提取額全血基因組dna與亞硫酸氫鹽反應(yīng)會(huì)使單鏈中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?，然后?jīng)過上樣、洗滌、洗脫等步驟得到轉(zhuǎn)化后的dna；dna甲基化水平測(cè)定步驟：上述轉(zhuǎn)化后的dna作為樣本dna加入含熒光定量pcr反應(yīng)液進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，使基因序列進(jìn)行倍數(shù)擴(kuò)增，每一個(gè)樣本dna對(duì)應(yīng)一個(gè)的擴(kuò)增曲線，曲線與既設(shè)閾值相交的橫坐標(biāo)點(diǎn)即為ct值，并通過下述計(jì)算式計(jì)算出甲基化率：δδct＝dna樣本(ct靶基因-ctactb)-陽性對(duì)照(ct靶基因-ctactb)；其中，δδct是指甲基化率，ct靶基因是指目標(biāo)基因的pcr循環(huán)數(shù)即腺苷高半胱氨酸酶基因的ct值，ctactb是指一種常用的內(nèi)參基因即actb的pcr循環(huán)數(shù)。所述的pcr反應(yīng)液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動(dòng)taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補(bǔ)足至20μl；所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件與實(shí)施例2的表1中相同；甲基化率的計(jì)算結(jié)果參見表2-4：表2：深圳地區(qū)病例組與對(duì)照組間的比較(n＝784)注：n表示樣本個(gè)數(shù)，p值是兩個(gè)數(shù)組之間進(jìn)行對(duì)照的結(jié)果，若其小于0.05，則表示這兩個(gè)數(shù)組間具有較大的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表述為陽性結(jié)果，用字符加粗來強(qiáng)調(diào)。pa是腦卒中患者與高血壓患者進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果；pb是腦卒中患者與正常人進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果；pc是高血壓患者與正常人進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用中位數(shù)(四分位數(shù))來表示，其計(jì)算所得p值后加#；符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用平均數(shù)±方差來表示，其計(jì)算所得p值后加*，具有其合理性。以下下表格同。表3：深圳地區(qū)男性高血壓患者與對(duì)照組間的比較(n＝330)分組高血壓患者正常人p值甲基化率0.08(0，0.80)0.05(0，0.18)0.003#年齡71.10±5.7365.30±9.482.93e-07*ua(μmol/l)395.79±98.26385.99±87.680.040*tg(mmol/l)1.39(0.97，1.79)1.49(1.06，2.06)0.077#tc(mmol/l)4.92±1.104.95±1.040.460*ldl(mmol/l)2.92±0.763.10±0.760.940*表4：深圳地區(qū)女性高血壓患者與對(duì)照組間的比較(n＝282)應(yīng)用實(shí)施例2選擇樣本：收集寧波地區(qū)腦卒中病人56例作為病例組(63.00(56.00，71.75)歲)和年齡匹配且無腦卒中家族史的137名正常者作為對(duì)照組(63.00(56.50，72.50)歲)對(duì)所有研究對(duì)象在知情同意的前提下，抽血檢測(cè)尿酸水平、甘油三酯等一般生化指標(biāo)，同時(shí)抽取靜脈血3ml作為樣本入edta抗凝管中，-80℃低溫儲(chǔ)存，備用；按照上述應(yīng)用實(shí)施例1的步驟進(jìn)行檢測(cè)、計(jì)算甲基化率并將結(jié)果與應(yīng)用實(shí)施例中深圳組的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果參見表5-7：表5寧波地區(qū)病例組與對(duì)照組間的比較(n＝193)分組腦卒中患者正常人p值甲基化率0.38±1.601.03±10.700.290*性別(男/女)35/2181/560.664年齡63.00(56.00，71.75)63.00(56.50，72.50)0.867#ua(μmol/l)288.50(239.75，348.50)278.00(202.00，363.00)0.470#tg(mmol/l)1.56±1.181.33±1.100.326*tc(mmol/l)4.09(3.43，4.99)4.49(3.71，5.38)0.125#ldl(mmol/l)2.34(1.82，3.00)2.77(2.19，3.41)0.025#表6深圳與寧波地區(qū)病例組間的比較(n＝228)表7深圳與寧波地區(qū)對(duì)照組間的比較(n＝426)分組深圳正常人寧波正常人p值甲基化率0.04(0，0.17)0.06(0，0.17)0.689#性別(男/女)175/11481/560.778年齡65.00(59.00，69.00)63.00(56.50，72.50)0.774#ua(μmol/l)354.00(302.00，411.00)278.00(202.00，363.00)3.36e-12#tg(mmol/l)1.52(1.09，2.09)1.10(0.79，1.57)5.88e-09#tc(mmol/l)5.04(4.41，5.64)4.49(3.71，5.38)8.95e-06#ldl(mmol/l)3.09(2.64，3.63)2.77(2.19，3.41)9.57e-05#由表2和表5可見：基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化是導(dǎo)致腦卒中患者發(fā)病的一個(gè)較大危險(xiǎn)因素(pc＝0.013)，而高血壓等潛在的因素也會(huì)大大提高腦卒中患者的患病風(fēng)險(xiǎn)，他們的甲基化水平差異有著較好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(pa＝7.04e-05)。就深圳地區(qū)的年齡因素考慮，腦卒中患者、高血壓患者與正常人之間存在著較為顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(pa＝0.013，pb＝0.006，pc＝1.59e-10)。由于深圳地區(qū)的高血壓患者和正常人之間就性別因素考量有著較大的差異，因此本研究把深圳地區(qū)的男/女性高血壓患者與其對(duì)應(yīng)的正常人進(jìn)行比較研究，得出深圳地區(qū)男性高血壓患者與正常人之間存在較好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而女性對(duì)比差異不明顯，見表3、表4)。據(jù)表6可知寧波地區(qū)和深圳地區(qū)的腦卒中患者的甲基化率存在顯著差異，由表6和7顯示寧波地區(qū)和深圳地區(qū)的正常人的諸多生化指標(biāo)(如ua、tg、tc、ldl等)皆有著明顯的不同(p＜0.05)，可見地域因素也是腦卒中患者發(fā)病的一個(gè)不容忽視的原因。上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。sequencelisting<110>深圳市南山區(qū)慢性病防治院<120>一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度檢測(cè)試劑盒及測(cè)定方法<130>深圳市南山區(qū)慢性病防治院<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<400>1ggtcgtaatcggttgtag20<210>2<211>22<212>dna<400>2caattcctattcccaaactaaa22當(dāng)前第1頁12