本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及l(fā)ncrnaenst00000424523.1及其基因在診斷和治療藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胃癌是世界上最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，統(tǒng)計(jì)顯示70％的胃癌患者屬于發(fā)展中國(guó)家；其中，將近半數(shù)的胃癌患者屬于東亞亞國(guó)家，特別是中國(guó)。胃癌病因復(fù)雜，其涉及的因素有幽門(mén)螺桿菌感染、飲食、環(huán)境致癌物暴露和遺傳易感性等；環(huán)境致癌物被認(rèn)為是導(dǎo)致胃癌發(fā)生最重要的因素之一。

n-亞硝基化合物(nocs)是一類(lèi)與胃癌發(fā)生相關(guān)的強(qiáng)致癌物質(zhì)，生活中主要來(lái)源于各類(lèi)腌制物、煙熏物或由內(nèi)源性形成。n-甲基-n′-硝基-n′-亞硝基胍(mnng)作為n-亞硝基化合物的一種，是公認(rèn)廣泛存在環(huán)境中的化學(xué)誘變劑和致癌劑。雖然目前人們已構(gòu)建mnng誘導(dǎo)胃癌的動(dòng)物模型和細(xì)胞模型，使胃癌的研究取得一定的進(jìn)展，但mnng涉及的胃癌機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。

過(guò)去，化學(xué)致癌物誘發(fā)胃癌的機(jī)制研究主要針對(duì)編碼基因，近年隨著高通量測(cè)序等生物技術(shù)的發(fā)展，非編碼rna與化學(xué)致癌物誘發(fā)胃癌的關(guān)聯(lián)逐漸受到人們的重視。長(zhǎng)鏈非編碼rna(longnoncodingrna，lncrna)是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200核苷酸的非編碼rna。lncrna是一類(lèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控元件，能在多種水平(表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后等)調(diào)控基因的表達(dá)，且與多種疾病密切相關(guān)，如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、凋亡、遷移和粘附等。根據(jù)lncrna在腫瘤發(fā)生中的作用，目前分為致癌作用的lncrna和抑癌作用的lncrna。

胃癌已成為當(dāng)今社會(huì)的疾病難題，早期的臨床診斷和預(yù)后有利于胃癌的治療，同時(shí)胃癌的治療藥物有待于進(jìn)一步研發(fā)。因此，有必要將lncrna與胃癌相結(jié)合，為胃癌的診斷、預(yù)后以及治療提供新的治療思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供lncrnaenst00000424523.1及其基因在診斷和治療藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：lncrnaenst00000424523.1及其基因在篩選或制備胃癌臨床診斷或預(yù)后的芯片、制劑或試劑盒中的應(yīng)用，lncrnaenst00000424523.1的基因序列號(hào)為loc101927497。

另外，本發(fā)明還提供lncrnaenst00000424523.1及其基因在篩選或制備胃癌治療藥物中的應(yīng)用，lncrnaenst00000424523.1的基因序列號(hào)為loc101927497。

另外，本發(fā)明還提供檢測(cè)lncrnaenst00000424523.1的試劑在篩選或制備胃癌臨床診斷或預(yù)后的芯片、制劑或試劑盒中的應(yīng)用。

另外，本發(fā)明還提供一種胃癌臨床診斷或預(yù)后的芯片、制劑或試劑盒，包括測(cè)定lncrnaenst00000424523.1轉(zhuǎn)錄量的特異性引物，所述特異性引物包含如seqidno.1和seqidno.2所示的dna序列。

本發(fā)明首先通過(guò)高通量測(cè)序rna-seq證實(shí)lncrnaenst00000424523.1的基因(loc101927497)在胃癌細(xì)胞和陰性細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄存在差異，并制備了檢測(cè)lncrnaenst00000424523.1的特異性引物，可以用來(lái)作為胃癌的臨床診斷和預(yù)后的標(biāo)記物。

另外，本發(fā)明還提供lncrnaenst00000424523.1促進(jìn)劑在篩選或制備胃癌治療藥物中的應(yīng)用。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述lncrnaenst00000424523.1促進(jìn)劑包含促進(jìn)基因loc101927497過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有基因loc101927497的dna序列。

本發(fā)明構(gòu)建基因loc101927497過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒，并設(shè)計(jì)合成出基因loc101927497的sirna，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在ges-1-t(惡性轉(zhuǎn)化的人胃粘膜細(xì)胞)和mkn-28(胃癌細(xì)胞)兩種細(xì)胞中，上調(diào)表達(dá)lncrnaenst00000424523.1能抑制胃癌細(xì)胞增殖，下調(diào)表達(dá)lncrnaenst00000424523.1能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

另外，本發(fā)明還提供一種胃癌的治療藥物，所述治療藥物包含lncrnaenst00000424523.1促進(jìn)劑。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述lncrnaenst00000424523.1促進(jìn)劑包含促進(jìn)基因loc101927497過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有基因loc101927497的dna序列。

作為上述技術(shù)方案進(jìn)一步地改進(jìn)，所述治療藥物還包含藥學(xué)生上可接受的載體。

在上述技術(shù)方案中，“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣料、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、右旋糖酐、甘油、乙醇等中的一個(gè)或多個(gè)以及它們的組合。在很多情況下，優(yōu)選的是將等滲劑例如糖、多元醇或氯化鈉包括在組合物中。藥學(xué)上可接受的載體還可包含少量的能提高抗體或抗體部分的貨架期或有效性的輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液。

另外，本發(fā)明還提供一種基因loc101927497的sirna，所述sirna為sirna-1、sirna-2或sirna-3，所述sirna-1由如seqidno.3和seqidno.4所示的rna序列組成，所述sirna-2由如seqidno.5和seqidno.6所示的rna序列組成，所述sirna-3由如seqidno.7和seqidno.8所示的rna序列組成。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供lncrnaenst00000424523.1及其基因在診斷和治療藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明首先通過(guò)高通量測(cè)序rna-seq證實(shí)lncrnaenst00000424523.1的基因(loc101927497)在胃癌細(xì)胞和陰性細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄存在差異；并制備了檢測(cè)lncrnaenst00000424523.1的特異性引物，可以應(yīng)用于胃癌的臨床診斷和預(yù)后；rna-seq數(shù)據(jù)及qrt-pcr數(shù)據(jù)都顯示：lncrnaenst00000424523.1在惡性轉(zhuǎn)化的胃粘膜細(xì)胞ges-1-t和胃癌細(xì)胞(mkn-28、mgc-803)中均表達(dá)下調(diào)，上調(diào)表達(dá)lncrnaenst00000424523.1能抑制胃癌細(xì)胞增殖，下調(diào)表達(dá)lncrnaenst00000424523.1能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖；由此可見(jiàn)，lncrnaenst00000424523.1及基因可應(yīng)用于胃癌的臨床診斷、預(yù)后和治療。

附圖說(shuō)明

圖1為ges-1-t細(xì)胞和ges-1-n細(xì)胞的高通量rna-seq測(cè)序結(jié)果圖；圖1a顯示兩種細(xì)胞差異表達(dá)的lncrna，圖1b顯示兩種細(xì)胞差異表達(dá)的mrna；圖中，差異表達(dá)lncrna和mrna用圓圈標(biāo)出；

圖2為驗(yàn)證lncrna的差異表達(dá)的統(tǒng)計(jì)圖；圖2a顯示ges-1-t細(xì)胞和ges-1-n細(xì)胞中l(wèi)ncrna表達(dá)量，en～452050.1為enst00000452050.1的縮寫(xiě)，en～435695.1為enst00000435695.1的縮寫(xiě)，en～424523.1為enst00000424523.1的縮寫(xiě)；圖2b顯示ges-1細(xì)胞、mkn-28細(xì)胞和mgc-803細(xì)胞中l(wèi)ncrnaenst00000424523.1相對(duì)水平；圖中，*表示p<0.05，**表示p<0.01；

圖3顯示上調(diào)lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響；圖3a顯示導(dǎo)入過(guò)表達(dá)載體pcdna-loc101927497的ges-1-t細(xì)胞和mkn-28細(xì)胞中l(wèi)ncrnaenst00000424523.1的相對(duì)表達(dá)量；圖3b顯示導(dǎo)入過(guò)表達(dá)載體pcdna-loc101927497的ges-1-t細(xì)胞和mkn-28細(xì)胞的增殖得到抑制；圖中，pcdna-lncrna為導(dǎo)入基因loc101927497的過(guò)表達(dá)載體，pcdna3.1為陰性對(duì)照；

圖4顯示顯示下調(diào)lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響；圖4a顯示轉(zhuǎn)染sirna的ges-1-t細(xì)胞和mkn-28細(xì)胞中l(wèi)ncrnaenst00000424523.1的相對(duì)表達(dá)量；圖4b顯示轉(zhuǎn)染sirna的ges-1-t細(xì)胞和mkn-28細(xì)胞的增殖得到促進(jìn)；圖中，sirna為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

為更好地說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例、附表和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1高通量rna-seq測(cè)序結(jié)果分析，mnng處理的ges-1-t細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生差異表達(dá)的lncrna

方法：以mnng誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化人胃粘膜細(xì)胞ges-1-t(t：轉(zhuǎn)化)及dmso處理的陰性對(duì)照細(xì)胞ges-1-n(n：正常)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)高通量rna-seq測(cè)序技術(shù)，分析兩種細(xì)胞中l(wèi)ncrna及mrna的表達(dá)差異。分析ges-1-t和ges-1-n細(xì)胞中的lncrna表達(dá)量，以表達(dá)差異倍數(shù)在2倍以上或0.5倍以下、p<0.05為標(biāo)準(zhǔn)確定差異表達(dá)的lncrna，以同樣的標(biāo)準(zhǔn)確定差異表達(dá)的mrna。

結(jié)果：通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，ges-1-t細(xì)胞中檢測(cè)出lncrna17626個(gè)，ges-1-n細(xì)胞中檢測(cè)出lncrna17916個(gè)。ges-1-t細(xì)胞中較ges-1-n細(xì)胞中具有表達(dá)差異的lncrna有253個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的lncrna有94個(gè)，表達(dá)下調(diào)的lncrna有159個(gè)(如圖1a所示)；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞中有表達(dá)差異的mrna共751個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的mrna有244個(gè)，表達(dá)下調(diào)的mrna有507個(gè)(如圖1b所示)。如表1所示，列出ges-1-t細(xì)胞中下調(diào)最明顯的3個(gè)lncrna。

表1

實(shí)施例2lncrnaenst00000424523.1在ges-1-t細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中低表達(dá)

方法：為了進(jìn)一步尋找在mnng誘導(dǎo)ges-1細(xì)胞惡轉(zhuǎn)中可能發(fā)揮作用的lncrna，我們從具有表達(dá)差異性的lncrna中選取變化差異較顯著的3個(gè)lncrna，用qrt-pcr的方法在ges-1-t細(xì)胞與ges-1-n細(xì)胞中檢測(cè)其表達(dá)水平。此外，我們還通過(guò)qrt-pcr檢測(cè)了胃癌細(xì)胞mkn-28和mgc-803中l(wèi)ncrnaenst00000424523.1的表達(dá)。qrt-pcr所使用的lncrna以及內(nèi)參gapdh引物序列如表2所示，表2中forward為正向引物，reverse為反向引物；lncrnaenst00000424523.1的cdna引物序列forward-aatgcttggaatgtgggagc(如seqidno.1所示)，reverse-ggcagctttcaggggtttta(如seqidno.2所示)。

結(jié)果：分析變化差異較顯著的3個(gè)lncrna，從檢測(cè)結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)lncrnaenst00000424523.1，其ncbi基因號(hào)為loc101927497，是一個(gè)未曾被研究的lncrna。與ges-1-n細(xì)胞相比，lncrnaenst00000424523.1在ges-1-t中的表達(dá)明顯下調(diào)(foldchange＝0.3974799±0.26，p<0.05)(如圖2a所示)；lncrnaenst00000424523.1在mkn-28、mgc-803這兩種胃癌細(xì)胞中同樣表現(xiàn)為低表達(dá)水平(如圖2b所示)。這些結(jié)果表明，lncrnaenst00000424523.1在mnng誘導(dǎo)的惡轉(zhuǎn)細(xì)胞ges-1-t和胃癌細(xì)胞株中均表達(dá)下調(diào)，基因loc101927497有可能作為抑癌基因在mnng誘導(dǎo)胃癌過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

表2

實(shí)施例3上調(diào)lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖

方法：為了探討基因loc101927497在mnng誘導(dǎo)胃癌過(guò)程中的功能，通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pcdna-loc101927497，研究基因loc101927497在惡性轉(zhuǎn)化胃癌細(xì)胞ges-1-t和胃癌細(xì)胞系mkn28中的作用。用pcdna-loc101927497分別轉(zhuǎn)染ges-1-t和mkn-28細(xì)胞，48小時(shí)后，用qrt-pcr法檢測(cè)lncrnaenst00000424523.1的過(guò)表達(dá)效果，并用cck-8試劑盒檢測(cè)過(guò)表的lncrnaenst00000424523.1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。

結(jié)果：轉(zhuǎn)染pcdna-loc101927497后，lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)水平在ges-1-t和mkn-28細(xì)胞均有明顯上調(diào)(如圖3a所示)；其次，過(guò)表達(dá)的lncrnaenst00000424523.1明顯削弱ges-1-t細(xì)胞和mkn-28細(xì)胞的增殖(如圖3b所示)。該結(jié)果表明上調(diào)lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖能力有明顯抑制作用。

實(shí)施例4下調(diào)lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖

方法：用sirna干擾lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)，檢測(cè)對(duì)ges-1-t細(xì)胞和mkn-28細(xì)胞增殖的情況。合成了3條特異性sirna：sirna-1、sirna-2、sirna-3(如表3所示)，用3條sirna分別轉(zhuǎn)染ges-1-t細(xì)胞和mkn-28細(xì)胞，48小時(shí)后，用qrt-pcr檢測(cè)lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)水平以驗(yàn)證sirna的干擾效果，并進(jìn)一步用cck-8試劑盒檢測(cè)下調(diào)表達(dá)的lncrnaenst00000424523.1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。

結(jié)果：轉(zhuǎn)染3條sirna后，lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)水平在ges-1-t細(xì)胞和mkn-28細(xì)胞中均有明顯下降(如圖4a所示)；敲低lncrnaenst00000424523.1的表達(dá)后，ges-1-t和mkn-28細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，且mkn-28細(xì)胞較為明顯(如圖4b所示)。

表3

最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

序列表

<110>廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院

<120>lncrnaenst00000424523.1及其基因在診斷和治療藥物中的應(yīng)用

<130>2017.7.3

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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