本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：靶向治療，是在細(xì)胞分子水平上，針對(duì)已經(jīng)明確的致癌位點(diǎn)(該位點(diǎn)可以是腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的一個(gè)蛋白分子，也可以是一個(gè)基因片段)，來設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)會(huì)特意地選擇致癌位點(diǎn)來相結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，而不會(huì)波及腫瘤周圍的正常組織細(xì)胞，所以分子靶向治療又被稱為“生物導(dǎo)彈”。靶向治療是指以標(biāo)準(zhǔn)化的生物標(biāo)記物來識(shí)別是否存在某種疾病特定的控制腫瘤生長的基因或基因譜，以此確定針對(duì)特異性靶點(diǎn)的治療方法。但是，由于與腫瘤或癌癥相關(guān)的基因突變在不同的個(gè)體中是不同的，對(duì)于不同的基因或不同的位點(diǎn)突變，其對(duì)于某種藥物的敏感性是不同的，也就是說某些患者可能對(duì)某種藥物存在天然的耐藥性。另外，在靶向治療的過程，腫瘤有可能產(chǎn)生其他位點(diǎn)的基因突變，而抑制靶向藥物的治療作用，產(chǎn)生獲得性耐藥性。而耐藥性一旦產(chǎn)生，繼續(xù)用已經(jīng)不具備治療的作用的靶向藥物，對(duì)患者無任何好處，還會(huì)增加副作用。為了更好的指導(dǎo)臨床用藥，需要對(duì)患者的基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測。市場上已經(jīng)有很多基因突變位點(diǎn)的檢測試劑盒，但是，其通常是在rna水平上對(duì)基因進(jìn)行檢測，因此，對(duì)某些基因位于內(nèi)含子區(qū)域的突變難以檢出。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供一種肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒，以提高基因檢測的覆蓋度和捕獲效率。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒。該試劑盒包括：肺癌臨床用藥突變基因捕獲探針，捕獲探針通過疊瓦式設(shè)計(jì)獲得，覆蓋待檢測基因的外顯子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域，且探針密度能夠確保每條待檢測區(qū)域的dna模板都有對(duì)應(yīng)探針與之結(jié)合。進(jìn)一步地，肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒用于檢測ros1-slc34a2融合斷裂點(diǎn)，捕獲探針覆蓋區(qū)域如表1所示：表1進(jìn)一步地，捕獲探針的序列包括slc34a2探針序列和ros1探針序列，其中，slc34a2探針序列具體包括seqidno:103至seqidno:212的110條探針，ros1探針序列具體包括seqidno:213至seqidno:227的329條探針。進(jìn)一步地，捕獲探針為探針混合物，探針混合物的濃度為20～30ng/μl，優(yōu)選為25ng/μl。進(jìn)一步地，肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒還包括文庫構(gòu)建相關(guān)試劑，文庫構(gòu)建相關(guān)試劑包括2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液，2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液包括：850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動(dòng)酶和0.5～0.7mm雙脫氧核糖核酸。進(jìn)一步地，2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液包括：900mmtris-hcl、5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動(dòng)酶和0.6mm雙脫氧核糖核酸。進(jìn)一步地，文庫構(gòu)建相關(guān)試劑還包括：末端修復(fù)加a反應(yīng)體系、接頭連接體系以及文庫富集引物；優(yōu)選地，末端修復(fù)加a反應(yīng)體系包括末端修復(fù)加a反應(yīng)緩沖液以及末端修復(fù)加a酶，更優(yōu)選地，末端修復(fù)加a反應(yīng)緩沖液包括400～600mmtris～hcl、80～120mmmgcl2、80～120mmdtt、8～10nmatp、3～5mmdatp、3～5mmdctp、3～5mmdgtp、3～5mmdttp；末端修復(fù)加a酶的濃度為0.04～0.06u/μl；優(yōu)選地，接頭連接體系包括雙鏈寡核苷酸接頭、dna連接酶以及dna連接酶緩沖液；更優(yōu)選地，雙鏈寡核苷酸接頭包括48對(duì)，dna連接酶的濃度為0.04～0.06u/μl；dna連接酶緩沖液包括800～900mm的tris～hcl、40～60mm的mgcl2、40～60mm的dtt及0.5～1.5mm的atp；優(yōu)選地，文庫富集引物的濃度為3～6μm，進(jìn)一步優(yōu)選為5μm。進(jìn)一步地，肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒還包括：肺癌臨床用藥突變基因捕獲試劑，肺癌臨床用藥突變基因捕獲試劑包括：雜交通用引物和雜交index引物；優(yōu)選地，雜交通用引物的濃度為225～275μm，更優(yōu)選為250μm；優(yōu)選地，雜交index引物1-48的濃度為22.5～27.5μm，更優(yōu)選為25μm；優(yōu)選地，雜交index引物為48個(gè)。進(jìn)一步地，肺癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括2×雜交緩沖液、雜交組分a以及胎盤dna，2×雜交緩沖液為2m的四甲基氯化銨緩沖液，雜交組分a為100％的甲酰胺；優(yōu)選地，肺癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液和捕獲樣本富集引物；更優(yōu)選，捕獲樣本富集緩沖液包括：850～950mmtris～hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/ul高保真熱啟動(dòng)酶和0.5～0.7mm雙脫氧核糖核酸；進(jìn)一步優(yōu)選，捕獲樣本富集緩沖液包括900mmtris～hcl、5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動(dòng)酶和0.6mm雙脫氧核糖核酸；更優(yōu)選地，捕獲樣本富集引物的濃度為3～6μm，進(jìn)一步優(yōu)選為5μm。進(jìn)一步地，試劑盒還包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，其中，陰性對(duì)照品為正常細(xì)胞beas-2b培養(yǎng)提取的細(xì)胞系dna并進(jìn)行超聲打斷后的片段化dna；陽性對(duì)照品為多種腫瘤細(xì)胞系dna混合后超聲打斷的片段化dna，所有檢測位點(diǎn)均為陽性。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，捕獲探針覆蓋待檢測基因的外顯子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域，這樣就可以在dna水平上檢測到斷點(diǎn)在外顯子和內(nèi)含子上的多種已知融合和未知融合，對(duì)斷點(diǎn)位置進(jìn)行準(zhǔn)確定位；探針通過疊瓦式設(shè)計(jì)獲得，且探針密度能夠確保每條待檢測區(qū)域的dna模板都有對(duì)應(yīng)探針與之結(jié)合，從而大大提高了捕獲探針覆蓋度和捕獲效率。具體實(shí)施方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒通常是在rna水平上對(duì)基因進(jìn)行檢測，對(duì)某些基因位于內(nèi)含子區(qū)域的突變難以檢出的技術(shù)問題，根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供一種肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒。該試劑盒包括：肺癌臨床用藥突變基因捕獲探針，捕獲探針通過疊瓦式設(shè)計(jì)獲得，覆蓋待檢測基因的外顯子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域，且探針密度能夠確保每條待檢測區(qū)域的dna模板都有對(duì)應(yīng)探針與之結(jié)合。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，捕獲探針覆蓋待檢測基因的外顯子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域，這樣就可以在dna水平上檢測到斷點(diǎn)在外顯子和內(nèi)含子上的多種已知融合和未知融合，對(duì)斷點(diǎn)位置進(jìn)行準(zhǔn)確定位；探針通過疊瓦式設(shè)計(jì)獲得，且探針密度能夠確保每條待檢測區(qū)域的dna模板都有對(duì)應(yīng)探針與之結(jié)合，從而大大提高了捕獲探針覆蓋度和捕獲效率。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒用于檢測ros1-slc34a2融合斷裂點(diǎn)，捕獲探針覆蓋區(qū)域如表1所示：表1當(dāng)然也可以根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明思想，設(shè)計(jì)其他基因的檢測試劑盒。優(yōu)選的，捕獲探針的序列包括slc34a2探針序列和ros1探針序列，其中，slc34a2探針序列具體包括seqidno:103至seqidno:212的110條探針，ros1探針序列具體包括seqidno:213至seqidno:227的329條探針。采用這些探針可以捕獲slc34a2和ros1基因外顯子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域，可以在dna水平上檢測到斷點(diǎn)在外顯子和內(nèi)含子上的多種已知融合和未知融合，對(duì)斷點(diǎn)位置進(jìn)行準(zhǔn)確定位；探針通過疊瓦式設(shè)計(jì)獲得，且探針密度能夠確保每條待檢測區(qū)域的dna模板都有對(duì)應(yīng)探針與之結(jié)合，從而大大提高了捕獲探針覆蓋度和捕獲效率。具體的探針序列見表18或序列表。優(yōu)選的，捕獲探針為探針混合物，探針混合物的濃度為20～30ng/μl，優(yōu)選為25ng/μl。符合此種條件的探針，檢測均一性較好。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒還包括文庫構(gòu)建相關(guān)試劑，文庫構(gòu)建相關(guān)試劑包括2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液，2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液包括：850～950mmtris～hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動(dòng)酶和0.5～0.7mm雙脫氧核糖核酸。2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液具有高保真性，可降低檢測的假陽性率。優(yōu)選的，2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液包括：900mmtris-hcl、5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動(dòng)酶和0.6mm雙脫氧核糖核酸。為了方便操作及提高檢測的準(zhǔn)確性，根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，文庫構(gòu)建相關(guān)試劑還包括：末端修復(fù)加a反應(yīng)體系、接頭連接體系以及文庫富集引物；優(yōu)選地，末端修復(fù)加a反應(yīng)體系包括末端修復(fù)加a反應(yīng)緩沖液以及末端修復(fù)加a酶，更優(yōu)選地，末端修復(fù)加a反應(yīng)緩沖液包括400～600mmtris～hcl、80～120mmmgcl2、80～120mmdtt、8～10nmatp、3～5mmdatp、3～5mmdctp、3～5mmdgtp、3～5mmdttp；所述末端修復(fù)加a酶的濃度為0.04～0.06u/μl；優(yōu)選地，所述接頭連接體系包括雙鏈寡核苷酸接頭、dna連接酶以及dna連接酶緩沖液；更優(yōu)選地，所述雙鏈寡核苷酸接頭為24～96個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為48個(gè)；所述dna連接酶的濃度為0.04～0.06u/μl；所述dna連接酶緩沖液包括800～900mm的tris～hcl、40～60mm的mgcl2、40～60mm的dtt及0.5～1.5mm的atp；優(yōu)選地，所述文庫富集引物的濃度為3～6μm，進(jìn)一步優(yōu)選為5μm。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒還包括：肺癌臨床用藥突變基因捕獲試劑，肺癌臨床用藥突變基因捕獲試劑包括：雜交通用引物和雜交index引物；優(yōu)選地，雜交通用引物的濃度為225～275μm，更優(yōu)選為250μm；優(yōu)選地，雜交index引物1-48的濃度為22.5～27.5μm，更優(yōu)選為25μm；優(yōu)選地，雜交index引物為48個(gè)。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，肺癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括2×雜交緩沖液、雜交組分a以及胎盤dna(cotdna)，2×雜交緩沖液為2m的四甲基氯化銨緩沖液，雜交組分a為100％的甲酰胺；優(yōu)選地，肺癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液和捕獲樣本富集引物；更優(yōu)選，捕獲樣本富集緩沖液包括：850～950mmtris～hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/ul高保真熱啟動(dòng)酶和0.5～0.7mm雙脫氧核糖核酸；進(jìn)一步優(yōu)選，所述捕獲樣本富集緩沖液包括900mmtris～hcl、5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動(dòng)酶和0.6mm雙脫氧核糖核酸；更優(yōu)選地，捕獲樣本富集引物的濃度為3～6μm，進(jìn)一步優(yōu)選為5μm。為了方便操作及提高檢測的準(zhǔn)確性，根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，所述試劑盒還包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，其中，陰性對(duì)照品為正常細(xì)胞beas-2b培養(yǎng)提取的細(xì)胞系dna并進(jìn)行超聲打斷后的片段化dna，所有檢測位點(diǎn)均為陰性；陽性對(duì)照品為多種腫瘤細(xì)胞系dna混合后超聲打斷的片段化dna，所有檢測位點(diǎn)均為陽性。下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)樣本：hcc78腫瘤細(xì)胞系dna進(jìn)行qubit定量及ddpcr檢測。詳細(xì)信息如下：突變基因slc34a2-ros1，突變位點(diǎn)為slc34a2的4號(hào)內(nèi)含子與ros1的31號(hào)內(nèi)含子發(fā)生融合，ddpcr頻率48.28％，qubit濃度93.8ng/μl。再用各位點(diǎn)均為野生型的beas-2b細(xì)胞系dna對(duì)母液進(jìn)行稀釋，將突變頻率分別稀釋成2％、1％、0.5％、0.1％，超聲打斷后再用ddh2o將dna濃度稀釋至5ng/μl，分別命名為l1、l2、l3和l4。提取hcc78腫瘤細(xì)胞系rna將其反轉(zhuǎn)錄成cdna后，進(jìn)行qubit定量和ddpcr檢測。詳細(xì)信息如下：突變基因slc34a2-ros1，突變位點(diǎn)為slc34a2的4號(hào)外顯子與ros1的32號(hào)外顯子發(fā)生融合，ddpcr頻率為47.3％，qubit濃度為25.4ng/ul。再用slc34a2和ros1未發(fā)生融合的細(xì)胞系beas-2b的cdna對(duì)其進(jìn)行稀釋，將突變頻率分別稀釋成2％、1％、0.5％、0.1％，超聲打斷后再用ddh2o將dna濃度稀釋至5ng/μl，分別命名為l5、l6、l7和l8。陰性樣本：對(duì)beas-2b細(xì)胞系dna、amo-1細(xì)胞系dna、nci-h596細(xì)胞系dna和nci-h929細(xì)胞系dna分別進(jìn)行qubit定量得到細(xì)胞系dna的濃度(ng/μl)，根據(jù)濃度，每種細(xì)胞系dna各取30μg進(jìn)行超聲打斷，打斷后用ddh2o稀釋至5ng/μl作為陰性參考品n1、n2、n3、n4。本實(shí)施例具體所使用的試劑盒的成分見下表2：表2附：pre-pcr引物：指文庫富集引物；post-pcr引物指捕獲樣本富集引物；上述試劑盒中的引物及探針的具體序列見后續(xù)的表18。操作步驟如下：1.末端修復(fù)及加a取dna樣品和試劑依次加入配制混合液1(見表3)，渦旋震蕩混勻后，于pcr儀中20℃孵育30分鐘，65℃孵育30分鐘。表3組分加入量dna樣品大于等于20ng末端修復(fù)&加a緩沖液7μl末端修復(fù)&加a酶3μl水補(bǔ)足至60μl2.添加接頭向末端修復(fù)&加a后的混合液1中依次加入試劑配制混合液2(見表4)，用移液器吹打混勻后，于pcr儀中20℃孵育15分鐘。表41接頭的使用濃度根據(jù)如下表5進(jìn)行調(diào)整：表5模板dna量/ng接頭的濃度/μm1000155001525015100155015257.510351.52.50.7510.33.添加接頭后純化(1)將添加接頭后的110μl混合液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，向其中加入88μl純化磁珠，用移液器吹打混勻，室溫靜置5～15分鐘，使dna和磁珠充分結(jié)合。(2)將離心管置于磁力架上至溶液澄清后，用移液器吸去上清。(3)向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。(4)重復(fù)上一步，室溫靜置3～5分鐘至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。(5)乙醇完全揮發(fā)后，從磁力架上取下離心管，每個(gè)離心管中分別依次加入22μl水，用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。(6)將離心管置于磁力架上至溶液上清澄清后，取1μl上清用于qubit定量。4.文庫富集(1)按表6要求依次加入試劑配制混合液3于pcr管中。表6組分加入量(μl)上清202×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液25pre-pcr引物5合計(jì)50(2)調(diào)整移液器至最佳量程上下吹打混勻液體并蓋好pcr管蓋，短暫離心。(3)將配制好的混合液3置于pcr儀，按以下表7反應(yīng)程序擴(kuò)增：表72具體循環(huán)數(shù)可根據(jù)如下表8進(jìn)行調(diào)整：表8注：擴(kuò)增后的產(chǎn)物于4℃或-20℃保存，但不超過72小時(shí)。(4)擴(kuò)增后純化及片段大小分選1)將50μl擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入50μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻。室溫靜置15分鐘。2)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。3)向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。4)重復(fù)上一步，室溫靜置3～5分鐘至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。5)從磁力架上取下離心管，加50μl水，用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。6)離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器移取50μl上清至新的離心管中。7)向上述50μl上清中加入35μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻，室溫靜置10分鐘。8)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取上清約85μl于新的離心管中注：此步需小心留取上清，而非棄上清。9)向上述85μl上清中，加入10μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻，室溫靜置10分鐘。10)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。11)向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。12)重復(fù)上一步，室溫靜置數(shù)秒至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。13)乙醇完全揮發(fā)后，從磁力架上取下離心管，加52μl水，用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。14)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取1μl進(jìn)行qubit定量檢測，吸取50μl上清至新的離心管中。15)dna文庫樣品質(zhì)量分析：對(duì)文庫樣品進(jìn)行qubit定量，濃度應(yīng)不小于2.5ng/μl；用2100生物分析儀分析文庫大小，應(yīng)在于150～500bp之間。注：純化后的文庫溶液應(yīng)在-20℃條件下保存，于7天內(nèi)完成后續(xù)處理。5.文庫雜交和捕獲(1)按表9要求依次加入試劑配制混合液4于新的1.5ml離心管中：表9組分加入量dna文庫混合樣品1μg3雜交通用引物1000pmol雜交index引物1000pmol4cotdna5μl3根據(jù)文庫樣品濃度計(jì)算樣本量，按下表10等質(zhì)量加入文庫樣本。1個(gè)捕獲樣本至少加入8個(gè)文庫，至多加入12個(gè)文庫：表10組分加入量dna文庫樣品1125dna文庫樣品2125dna文庫樣品3125dna文庫樣品4125dna文庫樣品5125dna文庫樣品6125dna文庫樣品7125dna文庫樣品81254應(yīng)加入與接頭相對(duì)應(yīng)的雜交index引物，加入量根據(jù)以下表11格調(diào)整：表11(2)用移液器吹打混勻后，用真空離心濃縮儀在60℃、1350r/min下進(jìn)行干燥，直至液體完全蒸干。(3)待液體蒸干后，按下表12加入試劑配制混合液5：表12組分加入量(μl)2×雜交緩沖液7.5雜交組分a3合計(jì)10.5(4)向干燥后的混合液4中，加入10.5μl混合液5配成雜交混合液，渦旋震蕩混勻，短暫離心以去除管壁殘留。于恒溫金屬浴儀95℃孵育10分鐘使dna變性，短暫離心以去除管壁殘留。(5)用移液器將雜交混合液轉(zhuǎn)移至新的pcr管中，加入4.5μl探針，渦旋震蕩混勻，短暫離心以去除管壁殘留。于pcr儀47℃孵育16～20小時(shí)，同時(shí)pcr儀加熱蓋溫度設(shè)置為57℃以上。6.文庫清洗(1)緩沖液的稀釋方法(見表13)：表13(2)取100μl1×洗脫緩沖液i和400μl1×洗脫緩沖液iv在47℃預(yù)熱至少2小時(shí)。(3)取100μl捕獲磁珠于新的1.5ml離心管中，將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(4)從磁力架上取下離心管，加入200μl1×磁珠洗脫緩沖液，渦旋震蕩混勻。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(5)重復(fù)上一步。(6)向離心管加入100μl1×磁珠洗脫緩沖液，渦旋震蕩混勻。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(7)取雜交后的文庫樣品15μl，加入到磁珠離心管中，用移液器吹打混勻，于pcr儀47℃孵育45分鐘。每間隔15分鐘渦旋震蕩3秒，使磁珠處于懸浮狀態(tài)。(8)孵育結(jié)束后，向離心管中加入100μl47℃預(yù)熱的1×洗脫緩沖液i，渦旋震蕩混勻。(9)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(10)從磁力架上取下離心管，加入200μl47℃預(yù)熱的1×洗脫緩沖液iv，用移液器吹打混勻。于恒溫金屬浴儀47℃孵育5分鐘。(11)重復(fù)一次(9)-(10)的步驟。(12)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(13)從磁力架上取下離心管，每個(gè)離心管中分別依次加入200μl未加熱的1×洗脫緩沖液i，渦旋震蕩2分鐘。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(14)從磁力架上取下離心管，每個(gè)離心管中分別依次加入200μl1×洗脫緩沖液ii，渦旋震蕩1分鐘。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(15)從磁力架上取下離心管，每個(gè)離心管中分別依次加入200μl1×洗脫緩沖液iii，渦旋震蕩30秒。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(16)從磁力架上取下離心管，加入40μl水，用移液器吹打混勻。將混勻后的液體標(biāo)記為“1”。7.捕獲樣本富集及純化(1)按下表14要求配制混合液6表14組分加入量(μl)2×hifi熱啟動(dòng)酶緩沖液50post-pcr引物10合計(jì)60(2)將混合液6與“1”混合，渦旋震蕩混勻。按50μl/管分裝量分裝到兩個(gè)新的pcr管中，按以下表15反應(yīng)程序擴(kuò)增：表15注：擴(kuò)增后的產(chǎn)物可于2～8℃保存，但不超過72小時(shí)。(3)將100μl擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入180μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻。室溫靜置15分鐘。(4)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(5)向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。(6)重復(fù)上一步，室溫靜置3～5分鐘至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。(7)乙醇完全揮發(fā)后，從磁力架上取下離心管，分別加入52μl水。用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。(8)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器轉(zhuǎn)移50μl上清于新的離心管中。此時(shí)捕獲的文庫樣品處于上清中。注：純化后的文庫溶液應(yīng)在-20℃以下保存7天。8.上機(jī)測序使用illumina公司生產(chǎn)的nextseq500測序儀及相關(guān)配套試劑進(jìn)行上機(jī)測序。生物信息學(xué)分析推薦使用臻和(北京)科技有限公司的基因突變分析軟件v1.0。對(duì)陰性參考品進(jìn)行ngs測序，結(jié)果如表16：表16樣品ngs檢測結(jié)果如表17：表17結(jié)果表明：采用本發(fā)明的試劑盒能夠以dna為模板，既可以檢測到斷點(diǎn)位置在內(nèi)含子區(qū)域的融合突變也可以檢測到斷點(diǎn)位置在內(nèi)含子區(qū)域的融合突變。本申請(qǐng)的上述試劑盒中的引物及探針的具體序列均見下表18。表18：對(duì)比例1采用康為世紀(jì)公司生產(chǎn)的建庫試劑盒(cw2585t)和羅氏公司生產(chǎn)的捕獲試劑盒(07145594001)作為對(duì)比試劑盒，并按照其說明書進(jìn)行操作，得到以下結(jié)果(表19)：表19經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)，斷點(diǎn)位置均在外顯子上的融合突變可以被檢測到，但是斷點(diǎn)位置在內(nèi)含子上的突變無法被檢測到。從以上的描述中，可以看出，本發(fā)明上述的實(shí)施例實(shí)現(xiàn)了如下技術(shù)效果：應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，捕獲探針覆蓋待檢測基因的外顯子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域，這樣就可以在dna水平上檢測到斷點(diǎn)在外顯子和內(nèi)含子上的多種已知融合和未知融合，對(duì)斷點(diǎn)位置進(jìn)行準(zhǔn)確定位；探針通過疊瓦式設(shè)計(jì)獲得，且探針密度能夠確保每條待檢測區(qū)域的dna模板都有對(duì)應(yīng)探針與之結(jié)合，從而大大提高了捕獲探針覆蓋度和捕獲效率。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>臻悅生物科技江蘇有限公司<120>肺癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒<130>pn73758zhkej<160>329<170>patentinversion3.5<210>1<211>58<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭1-48第一鏈<400>1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>2<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭1-48第一鏈<400>2gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaacgtgatatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>3<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭2第二鏈<400>3gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaaacatcgatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>4<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭3第二鏈<400>4gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatgcctaaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>5<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭4第二鏈<400>5gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacagtggtcaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>6<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭5第二鏈<400>6gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaccactgtatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>7<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭6第二鏈<400>7gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacacattggcatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>8<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭7第二鏈<400>8gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcaccagatctgatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>9<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭8第二鏈<400>9gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcaccatcaagtatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>10<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭9第二鏈<400>10gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcaccgctgatcatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>11<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭10第二鏈<400>11gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacacaagctaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>12<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭11第二鏈<400>12gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacctgtagccatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>13<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭12第二鏈<400>13gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacagtacaagatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>14<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭13第二鏈<400>14gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaacaaccaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>15<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭14第二鏈<400>15gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaaccgagaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>16<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭15第二鏈<400>16gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaacgcttaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>17<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭16第二鏈<400>17gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaagacggaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>18<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭17第二鏈<400>18gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaaggtacaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>19<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭18第二鏈<400>19gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacacacagaaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>20<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭19第二鏈<400>20gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacacagcagaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>21<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭20第二鏈<400>21gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacacctccaaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>22<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭21第二鏈<400>22gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacacgctcgaatctc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