本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素降解和微生物代謝領(lǐng)域，主要涉及一種釀酒酵母和尖孢鐮刀菌兩種菌同步糖化共發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，通過在不同時(shí)間段添加尖孢鐮刀菌和釀酒酵母，以避免兩種菌拮抗作用，提高己糖和戊糖利用率，從而達(dá)到利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的目的，同時(shí)通過原位酶的生產(chǎn)降低總成本。
背景技術(shù)：
纖維素是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物，同時(shí)也是地球上數(shù)量最多的生物質(zhì)資源，植物每年通過光合作用產(chǎn)生約1.55×1011噸纖維素類物質(zhì)，僅我國(guó)農(nóng)作物秸稈量就達(dá)7億多噸。目前，自然界中只有小部分纖維素得到了利用，絕大多數(shù)纖維素被浪費(fèi)并造成環(huán)境污染。產(chǎn)量巨大的木質(zhì)纖維材料的主要成分為糖類和芳香族化合物，利用微生物生產(chǎn)的纖維素酶將其轉(zhuǎn)化為糖，并進(jìn)一步發(fā)酵生成乙醇等化工原料，對(duì)于開發(fā)新能源、保護(hù)環(huán)境具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
從纖維素生物質(zhì)的乙醇生產(chǎn)涉及五個(gè)單元操作：預(yù)處理、纖維素酶的生產(chǎn)、酶水解、微生物發(fā)酵、產(chǎn)品回收。纖維素生產(chǎn)生物乙醇的過程一般有四種方式：?jiǎn)为?dú)水解和發(fā)酵、同步糖化發(fā)酵、同步糖化共發(fā)酵、聯(lián)合生物加工技術(shù)。目前使用最為廣泛的為同步糖化發(fā)酵。此方法用纖維素酶對(duì)纖維素進(jìn)行水解，水解同時(shí)加入乙醇發(fā)酵菌，使水解與發(fā)酵在同一容器內(nèi)進(jìn)行。酶水解過程中得到的糖類能迅速被微生物利用生產(chǎn)乙醇。酶解過程中產(chǎn)生的葡萄糖和纖維二糖會(huì)很快積累，會(huì)對(duì)纖維素酶產(chǎn)生非常顯著的終端產(chǎn)物反饋抑制作用，抑制酶解，使得最終的糖的轉(zhuǎn)化率降低。同步糖化發(fā)酵在同一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行，可以消除纖維素酶受葡萄糖和纖維二糖的終產(chǎn)物抑制，提高纖維素酶解的效果并能降低酶制劑的用量，所得酒精濃度較高等優(yōu)點(diǎn)。
在纖維素乙醇生產(chǎn)過程中，纖維素酶較高的成本一直是制約纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素，尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum)是一種絲狀真菌，具有分解纖維素和半纖維素的酶系統(tǒng)，釀酒酵母主要利用己糖生成乙醇，對(duì)戊糖基本不能利用，而尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum，除了具有分解纖維素和半纖維素的酶系統(tǒng)，還可以利用戊糖發(fā)酵生成乙醇。將尖孢鐮刀菌和釀酒酵母共培養(yǎng)同步糖化共發(fā)酵木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，通過分段添加已活化的釀酒酵母和尖孢鐮刀菌，可減少纖維素酶用量，降低纖維素乙醇生產(chǎn)過程的成本，同時(shí)可提高己糖和戊糖利用率，進(jìn)而達(dá)到利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的目的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)原位酶的生產(chǎn)成本高，木糖利用率低，木質(zhì)纖維素到乙醇的轉(zhuǎn)化效率低的缺點(diǎn)，采用釀酒酵母和尖孢鐮刀菌兩種菌同步糖化共發(fā)酵方法。在同步糖化發(fā)酵前先使用naoh在低料液比下預(yù)處理小麥秸稈和水稻秸稈原料，破壞原料中部分木質(zhì)素。通過添加少量纖維素酶對(duì)原料進(jìn)行預(yù)酶解，再通過在不同時(shí)間段添加尖孢鐮刀菌和釀酒酵母糖化發(fā)酵預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，以避免兩種菌拮抗作用，提高己糖和戊糖利用率，從而達(dá)到提高木質(zhì)纖維素到乙醇轉(zhuǎn)化效率的目的。
實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
(1)將小麥秸稈與0.5mnaoh溶液按料液比1∶20混合，于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、預(yù)處理1小時(shí)，固體殘?jiān)粗林行裕娓扇缓蠓鬯椋^20目篩。
(2)將上述經(jīng)naoh處理后的物料添加少量纖維素酶進(jìn)行預(yù)酶解，反應(yīng)體積為100ml，葡聚糖負(fù)荷為3％-6％(w/v)。預(yù)酶解12-24小時(shí)。
(3)將上述預(yù)酶解12-24小時(shí)原料進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，在不同時(shí)間段分別添加已活化的釀酒酵母和尖孢鐮刀菌。
(4)將酵母接種的時(shí)間定義為同步糖化發(fā)酵開始起點(diǎn)0h，在不同時(shí)間間隔取樣監(jiān)測(cè)發(fā)酵情況。用高效液相色譜法測(cè)乙醇和葡萄糖、木糖含量。
本發(fā)明的最大特點(diǎn)是在同步糖化發(fā)酵過程中的不同時(shí)間段添加釀酒酵母和尖孢鐮刀菌兩種菌進(jìn)行共發(fā)酵，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1)同步糖化發(fā)酵在同一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行，可以消除纖維素酶受葡萄糖和纖維二糖的終產(chǎn)物抑制，提高纖維素酶解的效果并能降低酶制劑的用量，所得酒精濃度較高等優(yōu)點(diǎn)。
2)尖孢鐮刀菌可以利用己糖和戊糖發(fā)酵生成乙醇，提高纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的轉(zhuǎn)化效率。
3)通過不同時(shí)間段添加尖孢鐮刀菌和釀酒酵母避免兩種菌的拮抗作用，提高己糖和戊糖利用率，從而達(dá)到提高木質(zhì)纖維素到乙醇轉(zhuǎn)化效率的目的。
附圖說明
圖1同步糖化共發(fā)酵工藝流程圖
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明。
本發(fā)明關(guān)鍵在于控制同步糖化發(fā)酵過程中釀酒酵母和尖孢鐮刀菌添加時(shí)間，以獲得較高乙醇濃度和轉(zhuǎn)化率。因此，具體實(shí)施方式的主要差別為釀酒酵母和尖孢鐮刀菌添加時(shí)間。具體實(shí)施方式如下：
實(shí)施例1：
(1)將自然風(fēng)干的小麥秸稈切割為長(zhǎng)度小于3cm的小段，按料液比為1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混勻，于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、預(yù)處理1小時(shí)，固體殘?jiān)粗林行?，烘干后粉碎?/p>
(2)將上述經(jīng)naoh處理后的物料進(jìn)行預(yù)酶解，反應(yīng)體積為100ml，葡聚糖負(fù)荷為3％(w/v)。預(yù)酶解12-24小時(shí)。纖維素酶和β-葡萄糖苷酶按酶負(fù)荷為25fpu/g葡聚糖加入酶解體系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶體系中。加入終濃度50mg/l的氨芐卡那霉素防止發(fā)酵過程雜菌污染。
(3)酶解條件為50℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，預(yù)酶解12h后取1ml測(cè)糖濃度。
(4)將酵母接種的時(shí)間定義為同步糖化發(fā)酵開始起點(diǎn)0h，將尖孢鐮刀菌種子液按總體積5％加入預(yù)酶解樣品中。
(5)在6h、12h、24h、48h、72h取樣監(jiān)測(cè)發(fā)酵情況。樣品12000rpm下離心5min，取上清，用高效液相色譜法測(cè)乙醇和葡萄糖、木糖含量。
實(shí)施例2：
(1)將自然風(fēng)干的小麥秸稈切割為長(zhǎng)度小于3cm的小段，按料液比為1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混勻，于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、預(yù)處理1小時(shí)，固體殘?jiān)粗林行?，烘干后粉碎?/p>
(2)將上述經(jīng)naoh處理后的物料進(jìn)行預(yù)酶解，反應(yīng)體積為100ml，葡聚糖負(fù)荷為3％(w/v)。預(yù)酶解12-24小時(shí)。纖維素酶和β-葡萄糖苷酶按酶負(fù)荷為25fpu/g葡聚糖加入酶解體系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶體系中。加入終濃度50mg/l的氨芐卡那霉素防止發(fā)酵過程雜菌污染。
(3)酶解條件為50℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，預(yù)酶解12h后取1ml測(cè)糖濃度。
(4)將酵母接種的時(shí)間定義為同步糖化發(fā)酵開始起點(diǎn)0h，將尖孢鐮刀菌種子液按總體積5％加入預(yù)酶解樣品中，24h后將酵母種子液按總體積5％(3.2×107個(gè)/ml)加入酶解液中。
(5)在6h、12h、24h、30h、36h、48h、72h取樣監(jiān)測(cè)發(fā)酵情況。樣品12000rpm下離心5min，取上清，用高效液相色譜法測(cè)乙醇和葡萄糖、木糖含量。
實(shí)施例3
(1)將自然風(fēng)干的小麥秸稈切割為長(zhǎng)度小于3cm的小段，按料液比為1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混勻，于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、預(yù)處理1小時(shí)，固體殘?jiān)粗林行裕娓珊蠓鬯椤?/p>
(2)將上述經(jīng)naoh處理后的物料進(jìn)行預(yù)酶解，反應(yīng)體積為100ml，葡聚糖負(fù)荷為3％(w/v)。預(yù)酶解12-24小時(shí)。纖維素酶和β-葡萄糖苷酶按酶負(fù)荷為25fpu/g葡聚糖加入酶解體系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶體系中。加入終濃度50mg/l的氨芐卡那霉素防止發(fā)酵過程雜菌污染。
(3)酶解條件為50℃，搖床轉(zhuǎn)速180pm，預(yù)酶解12h后取1ml測(cè)糖濃度。
(4)將酵母接種的時(shí)間定義為同步糖化發(fā)酵開始起點(diǎn)0h，將尖孢鐮刀菌種子液按總體積5％加入預(yù)酶解樣品中，36h后將酵母種子液按總體積5％(3.2×107個(gè)/ml)加入酶解液中。
(5)在6h、12h、24h、36h、42h、48h、60h、72h取樣監(jiān)測(cè)發(fā)酵情況。樣品12000rpm下離心5min，取上清，用高效液相色譜法測(cè)乙醇和葡萄糖、木糖含量。
實(shí)施例4
(1)將自然風(fēng)干的小麥秸稈切割為長(zhǎng)度小于3cm的小段，按料液比為1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混勻，于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、預(yù)處理1小時(shí)，固體殘?jiān)粗林行?，烘干后粉碎?/p>
(2)將上述經(jīng)naoh處理后的物料進(jìn)行預(yù)酶解，反應(yīng)體積為100ml，葡聚糖負(fù)荷為3％(w/v)。預(yù)酶解12-24小時(shí)。纖維素酶和β-葡萄糖苷酶按酶負(fù)荷為25fpu/g葡聚糖加入酶解體系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶體系中。加入終濃度50mg/l的氨芐卡那霉素防止發(fā)酵過程雜菌污染。
(3)酶解條件為50℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，預(yù)酶解12h后取1ml測(cè)糖濃度。
(4)將酵母接種的時(shí)間定義為同步糖化發(fā)酵開始起點(diǎn)0h，將尖孢鐮刀菌種子液按總體積5％加入預(yù)酶解樣品中，48h后將酵母種子液按總體積5％(3.2×107個(gè)/ml)加入酶解液中。
(5)在6h、12h、24h、48h、54h、60h、72h取樣監(jiān)測(cè)發(fā)酵情況。樣品12000rpm下離心5min，取上清，用高效液相色譜法測(cè)乙醇和葡萄糖、木糖含量。
實(shí)施例5
(1)將自然風(fēng)干的小麥秸稈切割為長(zhǎng)度小于3cm的小段，按料液比為1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混勻，于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、預(yù)處理1小時(shí)，固體殘?jiān)粗林行?，烘干后粉碎?/p>
(2)將上述經(jīng)naoh處理后的物料進(jìn)行預(yù)酶解，反應(yīng)體積為100ml，葡聚糖負(fù)荷為6％(w/v)。預(yù)酶解12-24小時(shí)。纖維素酶和β-葡萄糖苷酶按酶負(fù)荷為25fpu/g葡聚糖加入酶解體系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶體系中。加入終濃度50mg/l的氨芐卡那霉素防止發(fā)酵過程雜菌污染。
(3)酶解條件為50℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，預(yù)酶解12h后取1ml測(cè)糖濃度。
(4)將酵母接種的時(shí)間定義為同步糖化發(fā)酵開始起點(diǎn)0h，將尖孢鐮刀菌種子液按總體積5％加入預(yù)酶解樣品中，24h后將酵母種子液按總體積5％(3.2×107個(gè)/ml)加入酶解液中。
(5)在6h、12h、24h、48h、54h、60h、72h取樣監(jiān)測(cè)發(fā)酵情況。樣品12000rpm下離心5min，取上清，用高效液相色譜法測(cè)乙醇和葡萄糖、木糖含量。
同步糖化發(fā)酵過程中釀酒酵母和尖孢鐮刀菌添加時(shí)間選擇原則是：得到高的乙醇產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率。