本發(fā)明涉及生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種蛻膜和絨毛配對(duì)cdna芯片。
背景技術(shù)：
生物芯片是指包被在硅片、尼龍膜等固相支持物上的高密度組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸、糖類以及其他生物組分的高通量微陣列。利用高通量生物芯片，通過(guò)特異性分子雜交及染色技術(shù)，對(duì)受檢樣本進(jìn)行檢測(cè)，可準(zhǔn)確、快速獲取大量的分子檢測(cè)信息。目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)分子診斷、以及生物抗體靶向藥物篩查和驗(yàn)證等領(lǐng)域。
正常妊娠是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，胎兒雖攜有遺傳自父系的hla抗原，但卻并未引發(fā)母體產(chǎn)生針對(duì)胎兒這種特殊半同種“天然移植物”的排斥。妊娠期母-胎間存在著復(fù)雜的分子對(duì)話機(jī)制，以維持胎兒胎盤正常發(fā)育。妊娠早期胎兒絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(evt)侵入蛻膜組織，與母體蛻膜免疫細(xì)胞(dic)及蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(dsc)直接接觸，形成精細(xì)調(diào)控的母-胎界面。母-胎界面主要由3種細(xì)胞構(gòu)成：胚胎來(lái)源的滋養(yǎng)細(xì)胞(trophoblast,tro)，母體來(lái)源的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(decidualstromalcell,dsc)和蛻膜免疫細(xì)胞(decicidualimmunecell,dic)。作為母-胎界面唯一攜帶有父系抗原的滋養(yǎng)細(xì)胞，其侵襲與遷移是胚泡著床、胎盤發(fā)育，并建立母-胎關(guān)系的關(guān)鍵步驟。蛻膜基質(zhì)細(xì)胞除參與蛻膜營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)之外，還分泌多種活性分子調(diào)節(jié)胚泡著床與胎盤發(fā)育，并作為免疫潛能細(xì)胞，參與抗原提呈和分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。蛻膜免疫細(xì)胞是母-胎免疫耐受的基礎(chǔ)，通過(guò)表達(dá)特殊的活化標(biāo)記和分泌大量的細(xì)胞因子，在母-胎界面局部發(fā)揮著不同于外周的免疫調(diào)節(jié)作用。正常生理妊娠時(shí)母-胎界面呈現(xiàn)th2型免疫優(yōu)勢(shì)和調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(regulatorytcells,treg)擴(kuò)增現(xiàn)象，一旦這種耐受狀態(tài)被打破，th1型免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)，將導(dǎo)致妊娠失敗或妊娠并發(fā)癥如復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子癇前期等。
對(duì)母-胎界面形成的深入研究是揭示正常妊娠維持機(jī)制和病理妊娠發(fā)病機(jī)制的重要途徑和手段。
中國(guó)專利文獻(xiàn)cn103614473a公開了一種桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯抗藥性水平檢測(cè)cdna芯片及其制作方法和應(yīng)用。中國(guó)專利文獻(xiàn)cn101235420a公開了一種斑茅抗旱cdna表達(dá)譜芯片及其應(yīng)用。中國(guó)專利文獻(xiàn)cn101245386a公開了一種用于多種腫瘤抑瘤基因檢測(cè)的cdna芯片。中國(guó)專利文獻(xiàn)cn101942515a公開了一種檢測(cè)茶樹次生代謝相關(guān)基因表達(dá)信息的cdna芯片。目前尚沒(méi)有利用蛻膜和絨毛組織制備組織cdna芯片的技術(shù)及應(yīng)用的專利和文獻(xiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種蛻膜和絨毛配對(duì)cdna芯片。
本發(fā)明的再一的目的是，提供一種蛻膜和絨毛配對(duì)cdna芯片的制備方法。
本發(fā)明的另一的目的是，提供一種蛻膜和絨毛配對(duì)cdna芯片的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種蛻膜和絨毛配對(duì)cdna芯片，所述的cdna芯片通過(guò)如下方法制得：取蛻膜和絨毛組織，提取其rna，逆轉(zhuǎn)錄成cdna，預(yù)置在pcr反應(yīng)板內(nèi)，制作成cdna芯片。
進(jìn)一步地，所述的pcr反應(yīng)板為96孔或384孔。
進(jìn)一步地，所述的蛻膜和絨毛組織為孕早期流產(chǎn)婦女的蛻膜和絨毛組織。
為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的制備方法包括以下步驟：取孕早期流產(chǎn)婦女的蛻膜和絨毛組織，提取其rna，逆轉(zhuǎn)錄成cdna，預(yù)置在pcr反應(yīng)板內(nèi)，制作成cdna芯片。
進(jìn)一步地，提取rna的方法按照rna提取試劑盒oligotextm進(jìn)行。
進(jìn)一步地，逆轉(zhuǎn)錄成cdna的方法按照stratagene公司cdna文庫(kù)構(gòu)建系列試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
進(jìn)一步地，將制備好的cdna芯片置于濕盒中水化，取出置90～120℃平臺(tái)烘30秒至1分鐘后，再紫外光照射10～40分鐘固定。
進(jìn)一步地，制作cdna芯片的點(diǎn)樣液為2×ssc緩沖液、50％二甲基亞砜、3×ssc+1.5mol/l甜菜堿或150mmol/l磷酸鈉。
為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的cdna芯片在制備檢測(cè)基因表達(dá)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
進(jìn)一步地，所述的產(chǎn)品用于病理妊娠病因篩查及分子分型、新型標(biāo)志物篩選與驗(yàn)證、個(gè)體化治療患者篩選以及療效和預(yù)后判斷；所述病理妊娠為妊娠時(shí)限異常、異位妊娠、妊娠特有疾病、妊娠晚期出血或其它妊娠性疾病，所述妊娠時(shí)限異常包括流產(chǎn)、早產(chǎn)和過(guò)期妊娠，所述妊娠特有疾病包括妊娠高血壓疾病、妊娠劇吐，所述妊娠晚期出血包括前置胎盤和胎盤早剝，所述其它妊娠性疾病包括羊水量異常、胎兒窘迫、胎膜早破、多胎妊娠和母兒血型不合。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
1、每一位流產(chǎn)婦女分別取其蛻膜和絨毛組織cdna形成配對(duì)，集中在同一芯片上，實(shí)現(xiàn)生理結(jié)構(gòu)上的母-胎界面在體外芯片上功能呈現(xiàn)。
2、高通量，一張芯片至少可以集成45例患者蛻膜和絨毛配對(duì)組織cdna，一次即獲大量信息，成百上千倍地提高效率。
3、特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)單快速、定量準(zhǔn)確性高、結(jié)果可靠性強(qiáng)、結(jié)果分析簡(jiǎn)單并且樣本帶有完整的病例臨床信息等優(yōu)勢(shì)，可用于定量檢測(cè)目的基因在不同病人的表達(dá)情況及進(jìn)行深入的臨床信息相關(guān)性分析。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明取孕早期流產(chǎn)婦女的蛻膜和絨毛組織，提取其rna，逆轉(zhuǎn)錄成cdna，預(yù)置在pcr反應(yīng)板(96孔或384孔)內(nèi)，制作成cdna芯片，為一種通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量的方法來(lái)檢測(cè)目的基因的表達(dá)的cdna陣列。其特點(diǎn)：1)每一位流產(chǎn)婦女分別取其蛻膜和絨毛組織cdna形成配對(duì)，集中在同一芯片上，實(shí)現(xiàn)生理結(jié)構(gòu)上的母-胎界面在體外芯片上功能呈現(xiàn)；2)高通量，一張芯片至少可以集成45例患者蛻膜和絨毛配對(duì)組織cdna，一次即獲大量信息，成百上千倍地提高效率；3)特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)單快速、定量準(zhǔn)確性高、結(jié)果可靠性強(qiáng)、結(jié)果分析簡(jiǎn)單并且樣本帶有完整的病例臨床信息等優(yōu)勢(shì)，可用于定量檢測(cè)目的基因在不同病人的表達(dá)情況及進(jìn)行深入的臨床信息相關(guān)性分析。
實(shí)施例1cdna芯片的制備(一)
1、人蛻膜組織rna的提取
收集清宮術(shù)中蛻膜和絨毛組織，記錄患者的年齡、bmi、流產(chǎn)次數(shù)、治療方案、內(nèi)分泌、自身抗體、血凝，免疫、染色體篩查或遺傳性易栓癥篩查的資料參數(shù)，建立臨床資料數(shù)據(jù)庫(kù)。采用rna提取試劑盒oligotextm直接從孕早期流產(chǎn)婦女的蛻膜、絨毛組織中提取rna。所用的蛻膜、絨毛組織來(lái)自上海市第一婦嬰保健院(要求：月經(jīng)周期規(guī)律28～32天，末次月經(jīng)確切，無(wú)腹痛及陰道流血史，無(wú)避孕藥史和抗早孕藥史)。整個(gè)取材過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。提取的rna的方法及步驟應(yīng)嚴(yán)格參照rna提取試劑盒oligotextm進(jìn)行。
2、cdna文庫(kù)的構(gòu)建
按照stratagene公司cdna文庫(kù)構(gòu)建系列試劑盒說(shuō)明書完成。利用上述合成的mrna為模板、oligo(dt)為引導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)錄酶rt的催化，合成cdna第一條鏈；用cdna合成酶i進(jìn)行第二條鏈的合成。然后，用pfudna聚合酶修飾cdna末端。再在末端連接ecori連接子，并用t4多核苷酸激合酶磷酸化ecori末端。使其能與其后的非磷酸化ecori位點(diǎn)相連。滅活t4多核苷酸激合酶活性。用xhoi酶消化cdna，使其分裂成為小片段，用乙醇沉淀后溶于1×ste緩沖液中。用sepharosecl-2b凝膠過(guò)濾柱對(duì)cdna進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，分步收集樣品，合并較大的cdna片段。利用eb平皿鑒定所獲得的cdna片段的質(zhì)量。
將cdna片段與uni-zapxr載體連接。用zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit試劑盒對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行包裝，形成包裝噬菌體顆粒。先用該試劑盒所提供的vcs257細(xì)菌和野生型dna作預(yù)實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)該試劑盒的包裝效率。再培養(yǎng)xl1-bluemrf’宿主菌，用包裝產(chǎn)物感染宿主菌，鋪于瓊脂平板。
3、cdna芯片的制作
取cdna溶液或pcr產(chǎn)物10μl，加入2×ssc緩沖液3μl混勻，轉(zhuǎn)移至96孔板中，將板置于自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)平臺(tái)上，按順序以2000點(diǎn)/cm2的密度在載玻片上制作cdna芯片。將制備好的cdna芯片置于濕盒中水化5～10分鐘，取出置90～120℃平臺(tái)烘30秒至1分鐘后，面朝下置于uv透射分析儀上，以功率為0.5mw/cm2的320nm紫外光照射10～40分鐘固定。
實(shí)施例2cdna芯片的制備(二)
1、人蛻膜組織rna的提取
收集清宮術(shù)中蛻膜和絨毛組織，記錄患者的年齡、bmi、流產(chǎn)次數(shù)、治療方案、內(nèi)分泌、自身抗體、血凝，免疫、染色體篩查或遺傳性易栓癥篩查的資料參數(shù)，建立臨床資料數(shù)據(jù)庫(kù)。采用rna提取試劑盒oligotextm直接從孕早期流產(chǎn)婦女的蛻膜、絨毛組織中提取rna。所用的蛻膜、絨毛組織來(lái)自上海市第一婦嬰保健院(要求：月經(jīng)周期規(guī)律28～32天，末次月經(jīng)確切，無(wú)腹痛及陰道流血史，無(wú)避孕藥史和抗早孕藥史)。整個(gè)取材過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。提取的rna的方法及步驟應(yīng)嚴(yán)格參照rna提取試劑盒oligotextm進(jìn)行。
2、cdna文庫(kù)的構(gòu)建
按照stratagene公司cdna文庫(kù)構(gòu)建系列試劑盒說(shuō)明書完成。利用上述合成的mrna為模板、oligo(dt)為引導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)錄酶rt的催化，合成cdna第一條鏈；用cdna合成酶i進(jìn)行第二條鏈的合成。然后，用pfudna聚合酶修飾cdna末端。再在末端連接ecori連接子，并用t4多核苷酸激合酶磷酸化ecori末端。使其能與其后的非磷酸化ecori位點(diǎn)相連。滅活t4多核苷酸激合酶活性。用xhoi酶消化cdna，使其分裂成為小片段，用乙醇沉淀后溶于1×ste緩沖液中。用sepharosecl-2b凝膠過(guò)濾柱對(duì)cdna進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，分步收集樣品，合并較大的cdna片段。利用eb平皿鑒定所獲得的cdna片段的質(zhì)量。
將cdna片段與uni-zapxr載體連接。用zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit試劑盒對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行包裝，形成包裝噬菌體顆粒。先用該試劑盒所提供的vcs257細(xì)菌和野生型dna作預(yù)實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)該試劑盒的包裝效率。再培養(yǎng)xl1-bluemrf’宿主菌，用包裝產(chǎn)物感染宿主菌，鋪于瓊脂平板。
3、cdna芯片的制作
取cdna溶液或pcr產(chǎn)物10μl，加入50％二甲基亞砜3μl混勻，轉(zhuǎn)移至96孔板中，將板置于自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)平臺(tái)上，按順序以2000點(diǎn)/cm2的密度在載玻片上制作cdna芯片。將制備好的cdna芯片置于濕盒中水化5～10分鐘，取出置90～120℃平臺(tái)烘30秒至1分鐘后，面朝下置于uv透射分析儀上，以功率為0.5mw/cm2的320nm紫外光照射10～40分鐘固定。
實(shí)施例3cdna芯片的制備(三)
1、人蛻膜組織rna的提取
收集清宮術(shù)中蛻膜和絨毛組織，記錄患者的年齡、bmi、流產(chǎn)次數(shù)、治療方案、內(nèi)分泌、自身抗體、血凝，免疫、染色體篩查或遺傳性易栓癥篩查的資料參數(shù)，建立臨床資料數(shù)據(jù)庫(kù)。采用rna提取試劑盒oligotextm直接從孕早期流產(chǎn)婦女的蛻膜、絨毛組織中提取rna。所用的蛻膜、絨毛組織來(lái)自上海市第一婦嬰保健院(要求：月經(jīng)周期規(guī)律28～32天，末次月經(jīng)確切，無(wú)腹痛及陰道流血史，無(wú)避孕藥史和抗早孕藥史)。整個(gè)取材過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。提取的rna的方法及步驟應(yīng)嚴(yán)格參照rna提取試劑盒oligotextm進(jìn)行。
2、cdna文庫(kù)的構(gòu)建
按照stratagene公司cdna文庫(kù)構(gòu)建系列試劑盒說(shuō)明書完成。利用上述合成的mrna為模板、oligo(dt)為引導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)錄酶rt的催化，合成cdna第一條鏈；用cdna合成酶i進(jìn)行第二條鏈的合成。然后，用pfudna聚合酶修飾cdna末端。再在末端連接ecori連接子，并用t4多核苷酸激合酶磷酸化ecori末端。使其能與其后的非磷酸化ecori位點(diǎn)相連。滅活t4多核苷酸激合酶活性。用xhoi酶消化cdna，使其分裂成為小片段，用乙醇沉淀后溶于1×ste緩沖液中。用sepharosecl-2b凝膠過(guò)濾柱對(duì)cdna進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，分步收集樣品，合并較大的cdna片段。利用eb平皿鑒定所獲得的cdna片段的質(zhì)量。
將cdna片段與uni-zapxr載體連接。用zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit試劑盒對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行包裝，形成包裝噬菌體顆粒。先用該試劑盒所提供的vcs257細(xì)菌和野生型dna作預(yù)實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)該試劑盒的包裝效率。再培養(yǎng)xl1-bluemrf’宿主菌，用包裝產(chǎn)物感染宿主菌，鋪于瓊脂平板。
3、cdna芯片的制作
取cdna溶液或pcr產(chǎn)物10μl，加入3×ssc+1.5mol/l3μl混勻，轉(zhuǎn)移至96孔板中，將板置于自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)平臺(tái)上，按順序以2000點(diǎn)/cm2的密度在載玻片上制作cdna芯片。將制備好的cdna芯片置于濕盒中水化5～10分鐘，取出置90～120℃平臺(tái)烘30秒至1分鐘后，面朝下置于uv透射分析儀上，以功率為0.5mw/cm2的320nm紫外光照射10～40分鐘固定。
實(shí)施例4cdna芯片的制備(四)
1、人蛻膜組織rna的提取
收集清宮術(shù)中蛻膜和絨毛組織，記錄患者的年齡、bmi、流產(chǎn)次數(shù)、治療方案、內(nèi)分泌、自身抗體、血凝，免疫、染色體篩查或遺傳性易栓癥篩查的資料參數(shù)，建立臨床資料數(shù)據(jù)庫(kù)。采用rna提取試劑盒oligotextm直接從孕早期流產(chǎn)婦女的蛻膜、絨毛組織中提取rna。所用的蛻膜、絨毛組織來(lái)自上海市第一婦嬰保健院(要求：月經(jīng)周期規(guī)律28～32天，末次月經(jīng)確切，無(wú)腹痛及陰道流血史，無(wú)避孕藥史和抗早孕藥史)。整個(gè)取材過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。提取的rna的方法及步驟應(yīng)嚴(yán)格參照rna提取試劑盒oligotextm進(jìn)行。
2、cdna文庫(kù)的構(gòu)建
按照stratagene公司cdna文庫(kù)構(gòu)建系列試劑盒說(shuō)明書完成。利用上述合成的mrna為模板、oligo(dt)為引導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)錄酶rt的催化，合成cdna第一條鏈；用cdna合成酶i進(jìn)行第二條鏈的合成。然后，用pfudna聚合酶修飾cdna末端。再在末端連接ecori連接子，并用t4多核苷酸激合酶磷酸化ecori末端。使其能與其后的非磷酸化ecori位點(diǎn)相連。滅活t4多核苷酸激合酶活性。用xhoi酶消化cdna，使其分裂成為小片段，用乙醇沉淀后溶于1×ste緩沖液中。用sepharosecl-2b凝膠過(guò)濾柱對(duì)cdna進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，分步收集樣品，合并較大的cdna片段。利用eb平皿鑒定所獲得的cdna片段的質(zhì)量。
將cdna片段與uni-zapxr載體連接。用zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit試劑盒對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行包裝，形成包裝噬菌體顆粒。先用該試劑盒所提供的vcs257細(xì)菌和野生型dna作預(yù)實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)該試劑盒的包裝效率。再培養(yǎng)xl1-bluemrf’宿主菌，用包裝產(chǎn)物感染宿主菌，鋪于瓊脂平板。
3、cdna芯片的制作
取cdna溶液或pcr產(chǎn)物10μl，加入150mmol/l磷酸鈉點(diǎn)樣液3μl混勻，轉(zhuǎn)移至96孔板中，將板置于自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)平臺(tái)上，按順序以2000點(diǎn)/cm2的密度在載玻片上制作cdna芯片。將制備好的cdna芯片置于濕盒中水化5～10分鐘，取出置90～120℃平臺(tái)烘30秒至1分鐘后，面朝下置于uv透射分析儀上，以功率為0.5mw/cm2的320nm紫外光照射10～40分鐘固定。
實(shí)施例5cdna芯片的評(píng)價(jià)
將實(shí)施例1-4制備的cdna芯片與cy5標(biāo)記探針雜交，對(duì)掃描圖像進(jìn)行分析：實(shí)施例1-實(shí)施例4點(diǎn)的形狀均較為規(guī)則，其中，實(shí)施例1最規(guī)則；實(shí)施例1-4的dna固定效率均較高(＞50％)，其中，實(shí)施例1的固定效率最高(95％)。實(shí)施例1點(diǎn)樣時(shí)間短，點(diǎn)的形狀規(guī)則，固定效率高。
實(shí)施例6cdna芯片的應(yīng)用
將獲得的蛻膜和絨毛配對(duì)的mrna進(jìn)行標(biāo)記，加至實(shí)施例1中制作獲得的cdna芯片上進(jìn)行雜交，利用正常妊娠婦女蛻膜和絨毛組織在cdna芯片上差異表達(dá)來(lái)尋找目的基因。
1、樣品的標(biāo)記
分別提取正常妊娠和孕早期流產(chǎn)婦女的蛻膜和絨毛組織中的總mrna，然后再反轉(zhuǎn)錄時(shí)分別用cy3和cy5進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后將分別標(biāo)記的熒光樣品1:1混合備用。
2、雜交和檢測(cè)
取標(biāo)記好的樣品溶液加至預(yù)先熱變性的cdna芯片上，蓋上蓋玻片置于濕盒中雜交5小時(shí)，然后置于2×ssc，0.1％sds溶液中洗5分鐘，0.1×ssc，0.1％sds溶液中洗5分鐘，0.1×ssc溶液中蕩洗數(shù)遍，晾干。
將雜交完畢晾干的cdna微陣列芯片用激光共聚焦掃描儀在適當(dāng)條件下掃描檢測(cè)其雜交信號(hào)。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。