本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及osgrf7基因(oryzasativagrowth-regulatingfactor7)在水稻株型調(diào)控中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻的株型包括分蘗數(shù)目、分蘗角度、穗形和株高等性狀。良好的株型是提高水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，同時(shí)也是水稻應(yīng)對(duì)環(huán)境的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用的大部分栽培品種為含有半矮桿基因sd1的矮桿品種。與傳統(tǒng)的高桿品種相比，矮桿品種具有較多的優(yōu)勢(shì)。但是，矮桿品種固有的缺點(diǎn)卻限制了其產(chǎn)量的進(jìn)一步提高，這包括分蘗數(shù)較少、穗子較小等缺點(diǎn)。為了克服當(dāng)前大部分栽培品種增產(chǎn)潛力有限的缺點(diǎn)，進(jìn)一步滿足人們對(duì)糧食的需求，國(guó)際水稻所的育種學(xué)家提出了水稻新株型的概念，新株型的主要特點(diǎn)是分蘗少，沒(méi)有無(wú)效分蘗；穗子大，穗粒數(shù)多；莖稈粗壯，抗倒伏。水稻分蘗數(shù)目是水稻生產(chǎn)中的一個(gè)重要農(nóng)藝性狀。單位面積的有效分蘗數(shù)決定了有效穗數(shù)，而有效穗又是決定單位面積上水稻產(chǎn)量的四個(gè)關(guān)鍵因素之一。因此，合理的控制水稻分蘗的發(fā)生，盡量減少無(wú)效分蘗具有重要的生產(chǎn)意義?？沟狗芰σ恢笔撬居N學(xué)家十分重視的方面。雖然其不能直接提高水稻的產(chǎn)量，但它對(duì)于產(chǎn)量的穩(wěn)定具有十分重要的作用，是產(chǎn)量進(jìn)一步提高的限制性因素。與傳統(tǒng)高桿品種相比，矮桿品種通過(guò)降低株高，提高了植株的抗倒伏能力，是水稻更高產(chǎn)的前提。在這種情況下，改變莖稈的性狀，培育更加粗壯，抗倒伏能力更強(qiáng)的品種一直是育種學(xué)家努力的目標(biāo)。國(guó)際水稻所新株型的基本特點(diǎn)為少分蘗、粗桿和大穗。模擬研究表明，在熱帶地區(qū)、干季的條件下，具有新株型品種的產(chǎn)量可以比當(dāng)前品種再提高25％。因此，闡明分蘗、莖稈和穗子發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)理，對(duì)于獲得更加高產(chǎn)的品種具有十分重要的意義。當(dāng)前，盡管已經(jīng)克隆了很多產(chǎn)量相關(guān)的基因，但是能夠從整體上改變水稻株型，使之產(chǎn)生新株型特點(diǎn)的基因還未見(jiàn)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供水稻生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因7(osgrf7)與水稻分蘗數(shù)目、株高、粒徑大小，千粒重等株型性狀的關(guān)系，進(jìn)而提供osgrf7在提高水稻產(chǎn)量上的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：第一方面，提供一種osgrf7基因在改變水稻株型中的應(yīng)用，所述的改變水稻株型包括分蘗數(shù)目降低、株高降低、莖稈直徑及粒徑變寬、千粒重增加；osgrf7基因編碼的蛋白質(zhì)grf7的氨基酸序列如下(1)或(2)所示：(1)seqidno.1所示的氨基酸序列；(2)將seqidno.1所示序列的氨基酸殘基經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失/或添加，仍能發(fā)揮與seqidno.1所示蛋白質(zhì)一樣的改變水稻株型的作用。優(yōu)選地，本發(fā)明提供編碼seqidno.1所示的氨基酸序列的cdna核苷酸序列，如seqidno.2所示。優(yōu)選地，所述的水稻為粵泰b。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，在水稻體內(nèi)過(guò)表達(dá)osgrf7基因發(fā)現(xiàn)：所述轉(zhuǎn)基因水稻與所述目的水稻相比，分蘗減少、莖稈粗壯、粒子變寬、千粒重增加、株高降低。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，在水稻體內(nèi)通過(guò)攜帶osgrf7基因干擾載體的表達(dá)，使osgrf7基因失活或降低活性后，分蘗增多、莖稈變細(xì)、粒子變窄、千粒重下降。第二方面，本發(fā)明提供擴(kuò)增osgrf7基因全長(zhǎng)或其中任一片段的引物在改變水稻株型中的應(yīng)用。第三方面，本發(fā)明提供含有osgrf7基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌在提高水稻產(chǎn)量上的應(yīng)用。第四方面，本發(fā)明提供一種提高水稻產(chǎn)量的方法，為提高水稻體內(nèi)osgrf7基因的表達(dá)量，具體為將osgrf7基因通過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入到水稻體內(nèi)使osgrf7過(guò)表達(dá)。具體為，可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有osgrf7基因的重組表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物瞬時(shí)表達(dá)的載體等，如pcambia1301-ubi、pcambia1391、pgwb或其他衍生植物表達(dá)載體。使用osgrf7基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子、泛素(ubiquitin)基因啟動(dòng)子(pubi)等，它們可單獨(dú)使用或與其他的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；翻譯起始區(qū)域可來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物總表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、gfp基因、flag基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物、潮霉素標(biāo)記物等)。所述重組表達(dá)載體具體可為在植物表達(dá)載體pcambia1301的多克隆位點(diǎn)間或者ph7wg2d重組位點(diǎn)插入上述與水稻株型調(diào)控基因得到的重組表達(dá)載體。所述與水稻株型相關(guān)的基因osgrf7是通過(guò)上述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的水稻中的。攜帶有本發(fā)明的與水稻株型調(diào)控基因osgrf7的植物表達(dá)載體可通過(guò)ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、直接dna轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到水稻細(xì)胞或組織中。第五方面，osgrf7基因還可以作為分子標(biāo)記用于水稻育種中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：本發(fā)明通過(guò)將osgrf7基因在水稻中過(guò)表達(dá)之后，水稻分蘗減少、莖稈粗壯、粒子變寬、千粒重增加，株高降低；而將本發(fā)明保護(hù)的基因在水稻中失活或降低活性后，分蘗增多、莖稈變細(xì)、粒子變窄、千粒重下降，說(shuō)明該基因可控制水稻的株型。因此，osgrf7基因?yàn)榉肿訕?biāo)記輔助育種及利用基因工程的方法培育新株型水稻品種，從而進(jìn)一步提高水稻的產(chǎn)量提供了有力的手段，具有重要的理論意義和巨大的應(yīng)用潛力。附圖說(shuō)明圖1水稻osgrf7基因過(guò)表達(dá)、干涉和常規(guī)秈稻粵泰b的表型。圖2osgrf7基因的cdna和蛋白序列圖及mirna結(jié)合osgrf7轉(zhuǎn)錄本的示意圖a、藍(lán)色的核苷酸代表5’和3’非編碼區(qū)，下滑線所標(biāo)注的蛋白序列代表qlq結(jié)構(gòu)域和wrc結(jié)構(gòu)域，紅色星號(hào)代表mirna396靶位點(diǎn)；b、race的結(jié)果證明mirna結(jié)合了osgrf7轉(zhuǎn)錄本。圖3過(guò)表達(dá)及干涉的轉(zhuǎn)基因水稻相關(guān)農(nóng)藝性狀的比較。具體實(shí)施方式通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中水稻材料的田間栽培：水稻種子浸種2天后，30度催芽2天，然后播種，25天后移栽到大田。【實(shí)施例1】轉(zhuǎn)基因植物的獲得及其陽(yáng)性檢測(cè)一、水稻基因組dna的提?。翰捎胏tab方法從水稻葉片中提取基因組dna。取1g水稻葉片，加0.1mlctab和一顆鋼珠，在植物組織打樣機(jī)中5min，之后65度水浴1h提取dna，獲得的dna沉淀溶解于200μl的ddh2o中。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1)基因的克隆利用表2中的引物組合grf7oe-f/grf7oe-r從粵泰b的幼穗cdna中擴(kuò)增出了osgrf7的cds區(qū)段，通過(guò)回收連接到t載體上得到最終的cds區(qū)段表2、引物序列2)構(gòu)建表達(dá)載體將步驟1)得到的包含全長(zhǎng)osgrf7基因的cds區(qū)段重組到ph7wg2d中，得到重組表達(dá)載體grf7oe，經(jīng)驗(yàn)證載體構(gòu)建正確。2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得將質(zhì)粒grf7oe通過(guò)電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105中，篩選得到含有重組質(zhì)粒grf7oe的重組農(nóng)桿菌菌株。用含有重組質(zhì)粒grf7oe的重組農(nóng)桿菌菌株侵染粵泰b愈傷組織，在黑暗處25度共培養(yǎng)3天后，在含有50mg/l潮霉素和400mg/l的頭孢的篩選培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷進(jìn)一步得到轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在組培室煉苗3天后移栽到水田中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株為t0代。收獲t0代植株的種子，按照上述田間栽培的方法進(jìn)行栽培，并通過(guò)常規(guī)分子檢測(cè)，獲得含grf7oe的t1代轉(zhuǎn)基因植株。三、轉(zhuǎn)基因植株的株型檢測(cè)1、通過(guò)qrt–pcr檢測(cè)osgrf7基因的表達(dá)量利用trizol(購(gòu)自invitrogen公司)提取轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照粵泰b植株的totalrna，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自invitrogen公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna。利用引物grf7rt-f和grf7rt-r進(jìn)行定量檢測(cè)osgrf7的表達(dá)量。利用引物ubi-f和ubi-r擴(kuò)增ubiquitin基因作為內(nèi)參，引物序列如表3。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株中osgrf7表達(dá)量增加。(圖3)表3、引物序列引物名稱引物序列(5’-3’)grf7rt-faagtactgcgagcggcacatagrf7rt-ragattggccttccacatgctubi-faccacttcgaccgccactactubi-racgcctaagcctgctggtt2、轉(zhuǎn)基因植株的株型檢測(cè)對(duì)grf7oe的t4代轉(zhuǎn)基因植株、粵泰b對(duì)照植株進(jìn)行株型的統(tǒng)計(jì)，每種材料統(tǒng)計(jì)15個(gè)單株。結(jié)果如圖3所示，grf7oe轉(zhuǎn)基因t4代植株與粵泰b對(duì)照植株相比，其分蘗數(shù)目降低，粒子變寬，株高降低，千粒重增加?！緦?shí)施例2】osgrf7基因干涉載體轉(zhuǎn)基因植株的獲得及其檢測(cè)一、轉(zhuǎn)基因植株的獲得1、干涉片段的獲得利用osgrf7全長(zhǎng)cdna作為模板，用表4中的引物對(duì)grf7rnai-f/grf7rnai-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。表4、引物序列seqidno.3是seqidno.2的第662bp到978bp的317bp片段，見(jiàn)圖2a，經(jīng)全基因組比對(duì)分析確認(rèn)在水稻基因組中無(wú)其他同源序列。2、干涉載體的構(gòu)建將引物對(duì)grf7rnai-f/grf7rnai-r擴(kuò)增得到的產(chǎn)物重組到表達(dá)載體panic8a載體中，得到重組表達(dá)載體grf7rnai，插入片段表達(dá)后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。3、轉(zhuǎn)基因植株的獲得將質(zhì)粒grf7rnai通過(guò)電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105中，篩選得到含有重組質(zhì)粒grf7rnai的重組農(nóng)桿菌菌株。用含有重組質(zhì)粒grf7rnai的重組農(nóng)桿菌菌株侵染粵泰b愈傷組織，在黑暗處25度共培養(yǎng)3天后，在含有50mg/l潮霉素和400mg/l的頭孢的篩選培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷進(jìn)一步得到轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在組培室煉苗3天后移栽到水田中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株為t0代。收獲t0代植株的種子，按照上述田間栽培的方法進(jìn)行栽培，并通過(guò)常規(guī)分子檢測(cè)，獲得含grf7rnai的t1代轉(zhuǎn)基因植株。race的結(jié)果證明mirna結(jié)合osgrf7轉(zhuǎn)錄本，見(jiàn)圖2b。二、轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)1、通過(guò)qrt–pcr檢測(cè)osgrf7基因的表達(dá)量利用trizol(購(gòu)自invitrogen公司)提取轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照粵泰b植株的totalrna，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自invitrogen公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna。利用引物grf7rt-f和grf7rt-r進(jìn)行定量檢測(cè)osgrf7的表達(dá)量。利用引物ubi-f和ubi-r擴(kuò)增ubiquitin基因作為內(nèi)參，引物序列如表3。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株中osgrf7表達(dá)量下降。(圖3)2、轉(zhuǎn)基因植株的株型檢測(cè)對(duì)grf7rnai的t4代轉(zhuǎn)基因植株、粵泰b對(duì)照植株進(jìn)行株型的統(tǒng)計(jì)，每種材料統(tǒng)計(jì)15個(gè)單株。結(jié)果如圖3所示，grf7rnai轉(zhuǎn)基因t4代植株與粵泰b對(duì)照植株相比，其分蘗數(shù)目增加，粒子變窄，株高降低，千粒重下降。sequencelisting<110>武漢大學(xué)<120>osgrf7基因在水稻株型調(diào)控中的應(yīng)用<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>430<212>prt<213>水稻（oryzasativa）<400>1metalametalathrprothrthrasnglyserpheleuleuglyser151015glyglytyrproglyalaglnileleuserpheserserserglyhis202530serglyasnglyleuaspcysglyserseraspvalalaargmetgln354045glyvalleualaargvalargglyprophethrprothrglntrpmet505560gluleugluhisglnalaleuiletyrlyshisilevalalaasnala65707580provalproalaglyleuleuleuproileargargserleuhispro859095provalpheprohispheserserglyglyileleuglyserserser100105110leuglytrpglyserpheglnleuglytyrserglyseralaaspser115120125gluproglyargcysargargthraspglylyslystrpargcysser130135140argaspalavalvalaspglnlystyrcysgluarghisileasnarg145150155160glyarghisargserarglyshisvalgluglyglnserserhisala165170175alalysalathrvalproalailealaglnproproileglyalaser180185190asnglylysleuserglyserhisglyvalserasngluleuthrlys195200205thrleualathrasnargmetmetleuasplysalaasnleuileglu210215220argserglnasptyrthrasnglnglnhisasnileleuglnasnasn225230235240thrlysglyaspasntrpsergluglumetserserglnalaasptyr245250255alavalileproalaglyserleumetasnthrproglnseralaasn260265270leuasnproileproglnglnglnargcyslysglnserleuphegly275280285lysglyileglnhisaspaspileglnleuserileserileproval290295300aspasnseraspleuprothrasntyrasnlysalaglnmetasphis305310315320valvalglyglyserserasnglyglyasnasnthrargalasertrp325330335ileproglysertrpglualaserileglyglyproleuglygluphe340345350phethrasnthrserseralaseraspasplysglylysserarghis355360365proproserleuasnleuleualaaspglyhisthrthrserprogln370375380leuglnserprothrglyvalleuglnmetthrserpheserserval385390395400proserserthrvalserserproalaglyserleucysasnglyleu405410415leuthrserglyleuvalasnalaglnthrvalglnthrleu420425430<210>2<211>1293<212>dna<213>水稻（oryzasativa）<400>2atggcaatggcgacccctacgaccaacggcagcttccttcttggatcaggtggctatccc60ggtgcccagattctaagcttctcctcctcaggtcacagcggcaatgggttggattgtgga120agctcagatgtggcaagaatgcagggggttttagcaagggttagggggccattcacacca180acacaatggatggagctggagcaccaggctctgatctacaagcacattgtggcgaatgcg240ccggtaccggccggcttgctcctccccatcaggagaagcctccatccaccagtgttccca300cacttctcctctggtggcattcttggctccagctccttgggatgggggtcatttcagctg360ggctattctgggagtgctgactccgagcccgggagatgccgtcgaaccgatggcaagaaa420tggcggtgctcgagagacgcagttgtcgaccaaaagtactgcgagcggcacataaaccgg480ggtcgccaccgttcaagaaagcatgtggaaggccaatctagccatgccgcaaaagcaacg540gttcccgccatagcacaaccacccattggtgcatctaatggcaaattgtcaggcagccat600ggtgtgtcaaatgagctcacgaaaaccttggctactaacaggatgatgttggataaagca660aatcttattgaacgctcccaggactacactaatcagcaacacaacatcctacagaacaac720acaaaaggtgataattggtctgaagagatgtcctcacaagcagactatgcagtaatccct780gctggctctctcatgaacacaccgcaatcggcgaatttaaatccaattccccagcaacaa840cgctgtaagcagtcactctttggcaaagggatacagcatgatgacattcagctgtcgata900tccattcccgtggataactccgacttacccactaactacaacaaggctcaaatggaccat960gtagtaggcggttcatcgaatggcggaaacaacacgcgagcaagttggataccgggctcc1020tgggaagcgtccataggtggacctctgggtgagttcttcaccaacaccagcagcgcatca1080gacgacaaaggcaaaagccgccacccgccatctttgaacctcttagctgatggacatact1140acaagtccacagctgcaatcgcccaccggagtcctgcagatgactagcttcagttcagtg1200cccagcagcactgttagtagtcctgcaggcagcctctgcaatggcttgctcacttcaggc1260ctggtgaatgcccagactgtccaaacactgtga1293<210>3<211>317<212>dna<213>水稻（oryzasativa）<400>3atcttattgaacgctcccaggactacactaatcagcaacacaacatcctacagaacaaca60caaaaggtgataattggtctgaagagatgtcctcacaagcagactatgcagtaat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