本發(fā)明提供檢測(cè)樣本中bcr-fgfr1融合基因的寡核苷酸、方法和試劑盒，采用探針taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，用于檢測(cè)人類(lèi)8p11骨髓增殖綜合征(ems)患者體內(nèi)bcr-fgfr1融合基因表達(dá)水平，同時(shí)對(duì)高危人群進(jìn)行較為準(zhǔn)確的篩查。該試劑盒可有效的節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)精度。
背景技術(shù)：
：染色體易位，形成融合基因，進(jìn)而導(dǎo)致酪氨酸激酶的組成型表達(dá)在血液惡性腫瘤，尤其是骨髓增生綜合征的疾病的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用。纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(fgfr1)基因定位于染色體的8p11，其編碼的fgfr1蛋白是受體酪氨酸激酶家族成員之一。fgfr1蛋白擁有胞外受體結(jié)合域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶催化域，在非激活狀態(tài)時(shí)以單體形式存在。其在染色體易位時(shí)也會(huì)受到同樣的激活，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。8p11骨髓增殖綜合征(ems)是一種的伴fgfrl基因重排的非常罕見(jiàn)的侵襲性血液腫瘤，其主要生物學(xué)特征為：染色體涉及8p11異常，常伴嗜酸細(xì)胞增多，淋巴結(jié)腫大并伴有淋巴母細(xì)胞淋巴瘤，短期內(nèi)迅速進(jìn)展為急性血液病。目前已報(bào)道fgfr1的伙伴基因有14種，而bcr-fgfr1融合基因相對(duì)罕見(jiàn)，該融合基因?qū)?dǎo)致bcr基因第4號(hào)外顯子和fgfr1基因的第9號(hào)外顯子相連接。2004年，roumiantsev等以小鼠模型證實(shí)bcr-fgfr1蛋白很可能通過(guò)bcr的177位酪氨酸和grb蛋白結(jié)合，參與bcr-abl信號(hào)通路傳導(dǎo)，導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生cml樣的白血病。在疾病發(fā)生的早期使用針對(duì)性的靶向藥物對(duì)此類(lèi)疾病的治療來(lái)說(shuō)十分重要，大多數(shù)cml新診患者的可通過(guò)口服伊馬替尼出現(xiàn)完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解，但是由于對(duì)這類(lèi)疾病缺乏足夠認(rèn)識(shí)，許多患者喪失最佳治療時(shí)機(jī)。故融合基因bcr-fgfr1的檢測(cè)的開(kāi)展有利于疾病的早期診斷和治療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明設(shè)計(jì)了檢測(cè)內(nèi)參/目的基因用引物、探針序列，采用熒光定量pcr技術(shù)，利用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，分別構(gòu)建內(nèi)參基因abl和目的基因bcr-fgfr1的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)bcr-fgfr1的相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)水平。試劑盒通過(guò)調(diào)整兩個(gè)基因的引物探針比例，以及pcr反應(yīng)條件，使擴(kuò)增效率和速率均達(dá)到最佳。本發(fā)明中的“bcr-fgfr1cdna序列”指的是bcr-fgfr1融合基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mrna經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cdna序列，或者根據(jù)這種cdna序列通過(guò)化學(xué)合成手段直接合成出。不論是經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄還是通過(guò)化學(xué)合成手段直接產(chǎn)生的cdna序列插入到合適的質(zhì)粒后，可作為陽(yáng)性對(duì)照品進(jìn)行使用。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣本中bcr-fgfr1融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括檢測(cè)bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r和探針bcr-fgfr1-probe，其堿基序列為：bcr-fgfr1-f:gaagcctttgaaagccgc；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra。進(jìn)一步地，bcr-fgfr1-f：bcr-fgfr1-r：bcr-fgfr1-probe的摩爾比為2:2:1。進(jìn)一步地，所述寡核苷酸還包括檢測(cè)abl內(nèi)參基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探針abl-probe，其堿基序列為：abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct–tamra。進(jìn)一步地，abl-f：abl-r：abl-probe的摩爾比為2:2:1。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)樣本中bcr-fgfr1融合基因的方法，其步驟如下所示：(1)提取樣本中的rna；(2)將(1)提取出的rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna；(3)加入(2)中所述的cdna到反應(yīng)管中，利用檢測(cè)bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r和探針bcr-fgfr1-probe檢測(cè)樣本中的bcr-fgfr1融合基因熒光信號(hào)；利用檢測(cè)abl內(nèi)參基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探針abl-probe檢測(cè)樣本中的abl內(nèi)參基因熒光信號(hào)，其中bcr-fgfr1-f:gaagcctttgaaagccgc；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra；abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct–tamra。(4)根據(jù)(3)中的bcr-fgfr1融合基因熒光信號(hào)和abl內(nèi)參基因熒光信號(hào)，確定樣本中的bcr-fgfr1融合基因相對(duì)表達(dá)量。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)樣本中bcr-fgfr1融合基因的試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)體系pcr反應(yīng)液，其特征在于，所述檢測(cè)體系pcr反應(yīng)液包括檢測(cè)bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r和探針bcr-fgfr1-probe以及檢測(cè)abl內(nèi)參基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探針abl-probe，其中，bcr-fgfr1-f:tgcctatccctgtgcctg；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra；abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。進(jìn)一步地，bcr-fgfr1-f：bcr-fgfr1-r：bcr-fgfr1-probe的摩爾比為2:2:1。進(jìn)一步地，abl-f：abl-r：abl-probe的摩爾比為2:2:1。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和空白對(duì)照品，所述陽(yáng)性對(duì)照品為含有bcr-fgfr1cdna序列的質(zhì)粒溶液，所述陰性對(duì)照品為不含有bcr-fgfr1cdna序列的質(zhì)粒溶液，所述空白對(duì)照品為生理鹽水或不加任何物質(zhì)。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括樣本rna提取液和紅細(xì)胞裂解液，所述紅細(xì)胞裂解液包括16μmol/l氯化銨、1mmol/l碳酸氫鉀和12.5μmol/ledta，所述樣本rna提取液包括trizol、氯仿、異丙醇、75％乙醇和rnase-free水。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)結(jié)合采用taqman探針，利用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，分別構(gòu)建內(nèi)參基因abl和目的基因bcr-fgfr1的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)受測(cè)者體內(nèi)bcr-fgfr1的相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)水平。相比于測(cè)序法，該試劑盒具有精度高，可定量等優(yōu)點(diǎn)。加之該試劑盒將反應(yīng)體系所需的引物、探針進(jìn)行合理配比和優(yōu)化，使實(shí)驗(yàn)條件達(dá)到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環(huán)節(jié)，大大提升了實(shí)驗(yàn)效率。該試劑盒經(jīng)測(cè)試特異性好，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便。有助于臨床上8p11骨髓增殖綜合征(ems)患者體內(nèi)bcr-fgfr1融合基因的微量殘留檢測(cè)，對(duì)于及時(shí)干預(yù)治療避免血液學(xué)復(fù)發(fā)、調(diào)整治療方案、評(píng)價(jià)治療效果、預(yù)測(cè)預(yù)后、預(yù)防臨床復(fù)發(fā)都具有重要意義。附圖說(shuō)明圖1為陽(yáng)性樣本(樣本1)的熒光pcr檢測(cè)結(jié)果。圖2為陰性樣本(樣本2)的熒光pcr檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。實(shí)施例1用于檢測(cè)樣本中bcr-fgfr1融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括檢測(cè)bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r和探針bcr-fgfr1-probe，其堿基序列為：bcr-fgfr1-f:tgcctatccctgtgcctg；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra。進(jìn)一步地，所述寡核苷酸還包括檢測(cè)abl內(nèi)參基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探針abl-probe，其堿基序列為：abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。一種檢測(cè)樣本中bcr-fgfr1融合基因的方法，其步驟如下所示：(1)提取樣本中的rna；(2)將(1)提取出的rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna；(3)加入(2)中所述的cdna到反應(yīng)管中，利用檢測(cè)bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1、下游引物bcr-fgfr1-r和探針bcr-fgfr1-probe檢測(cè)樣本中的bcr-fgfr1融合基因熒光信號(hào)；利用檢測(cè)abl內(nèi)參基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探針abl-probe檢測(cè)樣本中的abl內(nèi)參基因熒光信號(hào)，其中bcr-fgfr1-f:tgcctatccctgtgcctg；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra；abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。(4)根據(jù)(3)中的bcr-fgfr1融合基因熒光信號(hào)和abl內(nèi)參基因熒光信號(hào)，確定樣本中的bcr-fgfr1融合基因相對(duì)表達(dá)量。一種檢測(cè)樣本中bcr-fgfr1融合基因的試劑盒，包括：紅細(xì)胞裂解液：16μmol/l氯化銨、1mmol/l碳酸氫鉀和12.5μmol/ledta；樣本rna提取液：trizol、氯仿、異丙醇、75％乙醇、rnase-free水；檢測(cè)體系pcr反應(yīng)液：revertraaceqpcrrtkit(toyobo公司)；thnderbirdprobeqpcrmix(2×)、檢測(cè)bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r各0.8μm、探針bcr-fgfr1-probe0.4μm，以及檢測(cè)abl內(nèi)參基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r各0.8μm、探針abl-probe0.4μm；其中：bcr-fgfr1-f:tgcctatccctgtgcctg；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra；abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。陽(yáng)性對(duì)照品：含有bcr-fgfr1cdna序列的質(zhì)粒溶液。陰性對(duì)照品：不含有bcr-fgfr1cdna序列的質(zhì)粒溶液?？瞻讓?duì)照品：生理鹽水或不加任何物質(zhì)。實(shí)施例2本方法的檢測(cè)流程：(1)抽提血液中的組織rna：在潔凈的1.5ml的離心管中加入1ml紅細(xì)胞裂解液，取抗凝血0.5ml混勻。室溫靜置10min；5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細(xì)胞；再次加入0.5ml紅細(xì)胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細(xì)胞；向細(xì)胞中加入1mltrizol，反復(fù)吹打直至沉淀完全溶解，室溫靜止5min；加入0.2ml氯仿，震蕩均勻；14000rpm4℃離心10min，吸取上清層轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置10min；14000rpm4℃離心10min，棄上清，加入75％乙醇1ml，輕輕上下顛倒洗滌管壁；14000rpm4℃離心5min，棄乙醇；室溫干燥10-15min，加入20μlrnase-free水溶解沉淀。(2)參考toyobo公司的revertraaceqpcrrtkit試劑盒說(shuō)明書(shū)，將rna反轉(zhuǎn)為cdna。(3)試劑配置：按檢測(cè)人份數(shù)配置檢測(cè)體系pcr反應(yīng)液各xμl，每人份23μl分裝：x＝23μl反應(yīng)液×(8份內(nèi)參(標(biāo)準(zhǔn)曲線)+8份目的基因(標(biāo)準(zhǔn)曲線)+n份標(biāo)本+1份陽(yáng)性對(duì)照+1份陰性對(duì)照+1份空白對(duì)照)；(4)加樣：將(3)中的檢測(cè)體系pcr反應(yīng)液和步驟(2)中的cdna2μl加入到96孔板的孔或者反應(yīng)管中；陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照直接加2μl陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品；空白對(duì)照加2μl生理鹽水或不加任何物質(zhì)。(5)檢測(cè)：檢測(cè)在實(shí)時(shí)熒光pcr儀上進(jìn)行，可用儀器包括abi7300，7500(美國(guó)appliedbiosystems公司)等。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min；95℃15s，58℃35sec40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)于58℃35sec時(shí)采集。(6)結(jié)果判斷：將閾值線調(diào)整至背景信號(hào)及陰性擴(kuò)增線以上，系統(tǒng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和ct值自動(dòng)計(jì)算出拷貝數(shù)。1)內(nèi)參陽(yáng)性時(shí)，檢測(cè)結(jié)果才認(rèn)為有效；2)陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：，ct<36，為陽(yáng)性；35≤ct≤38，為疑似陽(yáng)性，需要再次驗(yàn)證；ct＞38，為陰性。(7)經(jīng)步驟(6)判斷為樣本陽(yáng)性后，根據(jù)步驟(5)采集到的bcr-fgfr1融合基因和abl內(nèi)參基因熒光信號(hào)，確定樣本中的bcr-fgfr1融合基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)施例3：靈敏度檢測(cè)結(jié)果將實(shí)施例1中的陽(yáng)性對(duì)照品，即將含有bcr-fgfr1cdna序列的質(zhì)粒，按10、102……..1010的稀釋倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)總€(gè)梯度稀釋得到的稀釋液分別作為cdna模板，按照實(shí)施例2中的步驟(3)～(7)方法進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增和檢測(cè)，同時(shí)在96孔板不同的孔中重復(fù)檢測(cè)10次，稀釋1010和1011倍時(shí)的檢測(cè)結(jié)果分別如表1和表2所示：表1稀釋1010時(shí)(濃度為16.9copies/μl)的檢測(cè)結(jié)果表2稀釋1011時(shí)(濃度為1.69copies/μl)的檢測(cè)結(jié)果96孔板的孔ct(bcr-fgfr1)a5undet.b5undet.c4undet.c5undet.d4undet.d5undet.e4undet.f4undet.g4undet.h4undet.表1和表2的左列是在重復(fù)檢測(cè)10次時(shí)每次所對(duì)應(yīng)的96孔的孔編號(hào)，右列是每次檢測(cè)時(shí)系統(tǒng)測(cè)出的ct值。由表1可知，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1010時(shí)，重復(fù)檢測(cè)10次，每次都產(chǎn)生典型的s型擴(kuò)增曲線。由表2可知，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1011時(shí)，重復(fù)檢測(cè)10次都沒(méi)有檢測(cè)出(undet.)。因此，可以確定本發(fā)明檢測(cè)的檢測(cè)下限(或者說(shuō)檢測(cè)靈敏度)為16.9copies/μl，即16.9×103copies/ml。實(shí)施例4陽(yáng)性樣本和陰性樣本驗(yàn)證因bcr-fgfr1融合基因比較少見(jiàn)，故本實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性樣本使用的是含有bcr-fgfr1cdna序列的質(zhì)粒溶液(記為樣本1)，陰性樣本則使用健康人的臨檢樣本(記為樣本2)，按實(shí)施例2中的方法進(jìn)行檢測(cè)。每份標(biāo)本加入檢測(cè)體系pcr反應(yīng)液中2μl。檢測(cè)時(shí)間僅為100分鐘。樣本1的檢測(cè)結(jié)果圖如圖1所示，內(nèi)參基因abl的擴(kuò)增信號(hào)顯示pcr系統(tǒng)穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果有效，樣本1的bcr-fgfr1型ct<36之前有擴(kuò)增信號(hào)，所以樣本1為bcr-fgfr1陽(yáng)性。樣本2的檢測(cè)結(jié)果圖如圖2所示，內(nèi)參基因abl的擴(kuò)增信號(hào)顯示被檢樣本基因組提取成功，檢測(cè)結(jié)果有效，樣本2的bcr-fgfr1型ct>38之后無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，所以樣本2為bcr-fgfr1陰性。實(shí)施例5臨床樣本檢測(cè)取待檢的臨床樣本20份，按實(shí)施例2所述方法提取樣本中的組織rna、配制試劑并檢測(cè)。每份樣本加入檢測(cè)體系pcr反應(yīng)液中2μl。用熒光pcr儀檢測(cè)，時(shí)間為100分鐘。20例臨床樣本中所有樣本的abl均起線，而bcr-fgfr1均不能檢測(cè)到，說(shuō)明20例樣本中無(wú)一例bcr-fgfr1陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表3所示：表320例臨床樣本bcr-fgfr1檢測(cè)結(jié)果sequencelisting<110>杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司<120>檢測(cè)bcr-fgfr1融合基因的寡核苷酸、方法和試劑盒<130><160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1gaagcctttgaaagccgc18<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gagtcccactggaggagagc20<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3tgatggccgaaccagaagaaccc23<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4gatacgaagggagggtgtacca22<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5ctcggccagggtgttgaa18<210>6<211>28<212>dna<213>人工序列<400>6gcttctgatggcaagctctacgtctcct28當(dāng)前第1頁(yè)12