本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種aldh2基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是指dna序列中單個堿基的差別，堿基對由于排列方式不同，結(jié)合不同的脫氧核酸形成核苷酸對，這些核苷酸對構(gòu)成密碼子，密碼子則以不同的排列順序編碼蛋白質(zhì)，從而形成自然界多種多樣的生命。在基因組dna中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此snp既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上。

snp與許多疾病相關(guān)，決定了人類疾病的易感性和藥物反應(yīng)的差異性。因此，snp在分析診斷、臨床檢驗、法醫(yī)學(xué)、病原檢測、遺傳疾病和新藥研發(fā)等方面具有重要的應(yīng)用價值。

乙醛脫氫酶2(aldehydedehydrogenase2,aldh2)是酒精代謝的關(guān)鍵酶，它能催化乙醇代謝的有毒、致癌的乙醛脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的乙酸。此外，aldh2還兼具硝酸酯酶活性，是硝酸甘油的有效代謝物一氧化氮形成的關(guān)鍵。

aldh2基因的主要多態(tài)性位點是rs671(g>a)，正常的等位基因記為aldh2*1，單堿基突變的等位基因記為aldh2*2。研究發(fā)現(xiàn)，aldh2*1/aldh2*1基因型(野生型)具有aldh2的正?；盍?，aldh2*1/aldh2*2基因型(雜合型)存在6％的酶活力，而aldh2*2/aldh2*2基因型(突變型)則完全喪失酶的活力，使硝酸甘油無法產(chǎn)生一氧化氮，難以發(fā)揮藥效。aldh2位點的多態(tài)性為先天遺傳，與任何疾病的發(fā)生無關(guān)，與年齡無關(guān)。

綜上所述，aldh2基因多態(tài)性檢測將為硝酸甘油的用藥、飲酒指導(dǎo)及相關(guān)高風(fēng)險疾病的提示提供有效的參考依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用意義。

目前，檢測aldh2基因rs671位點基因型的方法有pcr-pflp、sanger雙脫氧鏈終止法測序、熒光定量pcr、焦磷酸測序、基因芯片等，除pcr-rflp法外，其他方法均需昂貴設(shè)備，操作相對繁瑣，檢測周期長，檢測成本高，部分方法還存在結(jié)果不穩(wěn)定、重復(fù)性差等缺點。相反，pcr-rflp法操作簡單，對儀器設(shè)備要求低，但該受內(nèi)切酶的活性、酶切時間、酶切體系等影響很大，可能造成酶切不全導(dǎo)致基因型誤判。此外，以上方法均需要提取樣本dna，從抽血到提純dna至少需要4個小時，到最終得到檢測結(jié)果至少需要8小時，且對儀器設(shè)備要求高、檢測環(huán)境要求嚴格。因此，難以滿足臨床上對疾病簡便、快速、準確診斷的要求。

為解決以上問題，需建立一種簡便、快速、準確鑒別aldh2基因型的方法，組裝成可滿足臨床診斷需求的aldh2基因型鑒別診斷試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、快速省時且特異性高、靈敏度好的分型檢測方法，的aldh2基因多態(tài)性快速檢測所涉及的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：aldh2基因多態(tài)性快速檢測的試劑盒，包括pcr反應(yīng)混合液；pcr反應(yīng)混合液的原料及終濃度為，

dna聚合酶0.05-0.09u/μl；

dntps0.2mm；

5xpcr緩沖液1.1x；

mgcl21.5-2.5mm；

十二烷基硫酸鈉0.0005-0.015％(w/v)；

聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03％(w/v)；

上游引物0.4-0.5μm；

下游引物0.4-0.5μm；

突變型分子信標0.4-0.5μm；

野生型分子信標0.3-0.4μm；

其用于檢測細胞樣品。

采用本發(fā)明技術(shù)方案的aldh2基因多態(tài)性快速檢測的試劑盒，本發(fā)明采用的是一種mg²⁺依賴性dna聚合酶，以dna為復(fù)制模板，將dna由5'端開始復(fù)制到3'端。dntp是deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脫氧核糖核苷三磷酸)的縮寫，dntps則是由四種脫氧核苷酸(datp、dgtp、dttp、dctp)以相同的比例混合而成，是dna復(fù)制的原料。上游引物、下游引物作為dna復(fù)制的起始點，在dna合成中dna聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的dna鏈上，因此，在核酸合成反應(yīng)中，引物作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用。mgcl2的作用是提供mg²⁺，與dntp以及dna模板結(jié)合形成復(fù)合體，只有這種復(fù)合體才能被dna聚合酶識別。pcr緩沖液的作用是有助于酶的穩(wěn)定，給dna聚合酶提供一個最適合酶催化反應(yīng)條件。細胞裂解液(由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成)的作用是溶解細胞質(zhì)和細胞膜，溶解之后產(chǎn)生的雜質(zhì)對pcr反應(yīng)的影破壞分子間許多微弱的化學(xué)鍵，分解一些蛋白酶，降低細胞裂響。

在現(xiàn)有的pcr反應(yīng)中，以細胞直接作為模板的pcr反應(yīng)，通常無法徹底裂解細胞，并且裂解后的細胞碎片及一些細胞內(nèi)容物(如蛋白酶)對pcr反應(yīng)有抑制，最終導(dǎo)致分型結(jié)果不穩(wěn)定，甚至失敗。

本發(fā)明的細胞裂解液的原料由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成。聚乙二醇辛基苯基醚是一種非離子型表面活性劑，十二烷基硫酸鈉是一種能夠使蛋白質(zhì)變性的強陰離子去污劑。在細胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域，十二烷基硫酸鈉(簡稱sds)經(jīng)常被用于核酸抽提操作中破壞細胞壁及裂解核酸與蛋白復(fù)合物，在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與dna的結(jié)合，使dna釋放出來。聚乙二醇辛基苯基醚(簡稱tritonx-100)被用于分解蛋白酶，聚乙二醇辛基苯基醚在基因工程中還作為限制性內(nèi)切酶的緩沖液的成分之一。實驗過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過sds和tritonx-100混合組成，配合與基因相關(guān)的原料終濃度，在增強細胞裂解程度的同時還降低了這些潛在的抑制劑對pcr的抑制作用(通過溶解細胞質(zhì)和細胞膜，破壞分子間微弱的化學(xué)鍵，分解一些蛋白酶)可快速解決污染樣品的問題。減少了dna提取過程，且避免污染樣品，從而節(jié)約時間，整個檢測過程僅需要1h，進而為臨床的快速診斷帶來依據(jù)，實現(xiàn)精準用藥。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有操作簡便、耗時短、無需專業(yè)人員、檢測結(jié)果準確、結(jié)果判讀簡單、無創(chuàng)取樣等優(yōu)點，適合基層臨床檢測，對檢測環(huán)境要求低、可以實現(xiàn)對aldh2的快速、高效且準確的分型檢測，為硝酸甘油治療心絞痛的及時治療、飲酒指導(dǎo)、相關(guān)癌癥的發(fā)生等提供參考，解決了現(xiàn)有方法有創(chuàng)采血、檢測周期長、檢測成本高及需專業(yè)檢測人員等缺點。

由實驗可知，pcr反應(yīng)混合液的原料、特異性引物及分子信標的終濃度范圍為上述范圍時檢測結(jié)果均正確。其中，5x反應(yīng)緩沖液1x的原料為5x反應(yīng)緩沖液，指的是初始濃度為5倍的反應(yīng)緩沖液，1x是指的應(yīng)用的終濃度。

進一步，所述的pcr反應(yīng)混合液的原料終濃度為：

dna聚合酶0.09u/μl；

dntps0.2mm；

5xpcr緩沖液1.1x；

mgcl22.5mm；

十二烷基硫酸鈉0.005％w/v；

聚乙二醇辛基苯基醚0.01％w/v；

上游引物0.4μm；

下游引物0.4μm；

突變型分子信標0.4μm；

野生型分子信標0.3μm。

由實驗可知，pcr反應(yīng)混合液的原料、特異性引物及分子信標的終濃度范圍為上述范圍時檢測結(jié)果最準確，且成功率最高。

進一步，所述的細胞樣品為口腔黏膜脫落細胞。本發(fā)明以直接刮取的口腔黏膜脫落細胞為樣本，操作方便。

進一步，還包括有提純的人類基因組dna基因序列。試劑盒中包括質(zhì)控品，為提純的人類基因組dna基因序列，是在測定時為了做平行試驗，來測定試劑結(jié)果的有效性。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，本發(fā)明試劑盒中的aldh2基因多態(tài)性快速檢測的引物，

上游引物5’-3’的基因序列為：acagggtcaactgctatgat；

下游引物5’-3’的基因序列為：agcaggtcccacactca。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，試劑盒中引物檢測的aldh2基因多態(tài)性快速檢測的分子信標，野生型分子信標的5’-3’的基因序列為：aggcatacac+t+gaagt；

突變型分子信標的5’-3’的基因序列為：caggcatacac+t+aaagt；

且野生型分子信標和突變型分子信標基因序列的5’端或3’端分別設(shè)有熒光基團和與熒光基團配合的淬滅基團或非熒光淬滅基團；

+為鎖核酸修飾的堿基。

進一步，所述的野生型分子信標的熒光基團為fam標記基團，淬滅基團為非熒光淬滅基團，并進行mgb修飾；突變型分子信標熒光基團為texasred標記基團，淬滅基團為非熒光淬滅基團，并進行mgb修飾。本發(fā)明中所使用的熒光基團和非熒光淬滅基團，當(dāng)然，也可用其他熒光基團和與其配合的淬滅基團代替，不影響檢測結(jié)果。

本技術(shù)方案使用的分子信標是taqman-mgb探針，是一種寡核苷酸探針，taqman-mgb探針采用非熒光淬滅基團，并對探針進行mgb修飾，可在較短的堿基數(shù)量下達到較高的tm值，增強雜交特異性。taqman-mgb探針用于snp檢測是利用兩條由不同熒光基團標記，且可與這些位點不同堿基互補的taqman-mgb探針與擴增片段進行特異性雜交。雜交過程中taqdna聚合酶運用5’-3’核酸外切酶活性將探針酶切降解，致使熒光基團與淬滅基團分離從而釋放熒光信號。隨著擴增片段數(shù)量的積累，熒光信號也得到相應(yīng)的增加并被儀器采集。通過配套軟件對采集的熒光信號進行分析，即可獲得所檢測樣本的基因型。根據(jù)aldh2基因rs671多態(tài)性位點及周邊序列，分別設(shè)計野生型分子信標和突變型分子信標，分子信標要求在適宜的退火溫度下，野生型分子信標可與未突變序列結(jié)合，不與突變序列結(jié)合；且突變型分子信標可與突變序列結(jié)合，而不與未突變序列結(jié)合。

檢測的原理為：在aldh2基因突變位點(rs671)兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計一對引物，并在突變位點序列處分別設(shè)計兩個taqman-mgb分子信標：aldh2突變型分子信標和aldh2野生型分子信標。aldh2野生型分子信標與未突變序列結(jié)合，aldh2突變型分子信標與突變位點序列結(jié)合。野生型分子信標、突變型分子信標5′端均用熒光素標記，3′端均用淬滅基團標記。在適宜的pcr退火溫度下，野生型分子信標與未突變的序列結(jié)合，不與突變序列結(jié)合；而突變型分子信標與有突變位點的序列結(jié)合，不與未突變的序列結(jié)合。在分子信標與靶序列結(jié)合后，隨著擴增的進行，探針可被dna聚合酶運用5’-3’核酸外切酶活性將探針酶切降解，致使熒光基團與淬滅基團分離從而釋放熒光信號。本發(fā)明中，利用綠色熒光基團標記野生型分子信標，利用紅色熒光基團標記突變型分子信標，從而可通過熒光的顏色來判斷所檢測基因的基因型。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，利用上述的引物、分子信標及試劑盒進行的aldh2基因多態(tài)性快速檢測方法，操作方法為：

(1)取樣前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；

(2)取取樣裝置的取樣部近90°接觸口腔內(nèi)腮壁，均勻刮拭5次，上、下為1次；

(3)取樣后將取樣裝置的取樣部插入pcr反應(yīng)混合液中，混勻；

(4)取1μl提純的人類基因組dna基因序列加入到另一支pcr反應(yīng)混合液中，混勻；

(5)將完成加樣的pcr反應(yīng)液放入熒光pcr儀中，運行反應(yīng)程序。

進一步，熒光pcr儀的反應(yīng)程序為：

a、預(yù)變性：溫度95℃，5min，1個循環(huán)；

b、變性：95℃，8s；

c、退火及延伸：56℃，35s；

d、b及c程序操作50個循環(huán)。

進一步，所述的熒光pcr儀為雙通道，激發(fā)波長分別為450-500nm和550-600nm。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例一的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖2是本發(fā)明實施例一的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖3是本發(fā)明實施例一的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖4是本發(fā)明實施例二的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖5是本發(fā)明實施例二的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖6是本發(fā)明實施例二的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖7是本發(fā)明實施例三的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖8是本發(fā)明實施例三的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖9是本發(fā)明實施例三的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖10是本發(fā)明實施例四的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖11是本發(fā)明實施例四的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖12是本發(fā)明實施例四的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖13是本發(fā)明實施例五的刮取3次的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖14是本發(fā)明實施例五的刮取3次的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖15是本發(fā)明實施例五的刮取3次的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖16是本發(fā)明實施例五的刮取5次的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖17是本發(fā)明實施例五的刮取5次的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖18是本發(fā)明實施例五的刮取5次的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖19是本發(fā)明實施例五的刮取7次的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖20是本發(fā)明實施例五的刮取7次的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖21是本發(fā)明實施例五的刮取7次的第三個樣品檢測擴增曲線圖。

圖22是本發(fā)明質(zhì)控品-提純的人類基因組dna基因序列的檢測擴增曲線圖。

具體實施方式

以下是本發(fā)明aldh2基因多態(tài)性快速檢測試劑盒中的各實施例的原料終濃度，如表1所示：

表1

以下為本發(fā)明aldh2基因多態(tài)性快速檢測的具體操作方式：

一、細胞裂解液的配制

配置1000ul的細胞裂解液試劑，十二烷基硫酸鈉(sds)和聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)購自上海普洛麥格生物制品有限公司，初始濃度分別為0.1g/ml、1.0655g/ml。

細胞裂解液配方均為在pcr反應(yīng)體系中的最終濃度，由于此濃度非常小，配制少量此濃度的裂解液加樣時誤差會增大，所以為了配制的裂解液的濃度準確，采用對上述四個配方中的十二烷基硫酸鈉(sds)和聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)的濃度擴大，在加樣時，將其擴大的濃度加一定體積量，使其滿足上述終濃度的要求，如果定義上述四個配方中的最終濃度為1倍(1×)，則將濃度擴大為200倍(200×)，細胞裂解液在加入pcr反應(yīng)體系時稀釋200倍，使其終濃度為1倍即可，200×的細胞裂解液在配制好后震蕩混勻，-4℃保存。

不同終濃度的細胞裂解液均配制成為200×的儲存液，因為每一支反應(yīng)液所需原料少，加之聚乙二醇辛基苯基醚為粘稠液體，不易精準吸取。

所有試劑配制均在滅菌后的超凈工作臺進行。

(1)實施例一中200x細胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入10μl十二烷基硫酸鈉和1.88μl聚乙二醇辛基苯基醚，再加入988.12μl無核酸酶的水至總體積1000μl，使十二烷基硫酸鈉的終濃度達到0.1％，使聚乙二醇辛基苯基醚的終濃度達到0.2％，即為200×的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

(2)實施例二和實施例五中200x細胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入100μl十二烷基硫酸鈉和18.78μl聚乙二醇辛基苯基醚，再加入881.22μl無核酸酶的水至總體積1000μl，使十二烷基硫酸鈉的終濃度達到1％，使聚乙二醇辛基苯基醚的終濃度達到2％，即為200x的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

(2)實施例三中200x細胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入200ul十二烷基硫酸鈉(sds)和37.56ul聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)，再加入762.44ul無核酸酶的水至總體積1000ul，使sds的終濃度達到2％，使tritonx-100的終濃度達到4％，即為200x的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。細胞裂解液在加入pcr反應(yīng)體系時稀釋200倍，使其終濃度為1倍。

(3)實施例四中200x細胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入300ul十二烷基硫酸鈉(sds)和56.34ul聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)，再加入643.66ul無核酸酶的水至總體積1000ul，使sds的終濃度達到3％，使tritonx-100的終濃度達到6％，即為200x的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。細胞裂解液在加入pcr反應(yīng)體系時稀釋200倍，使其終濃度為1倍。

上游引物5’-3’的基因序列為：acagggtcaactgctatgat；

下游引物5’-3’的基因序列為：agcaggtcccacactca。

野生型分子信標5’-3’的基因序列為：

fam標記-aggcatacac+t+gaagt-mgb修飾；

突變型分子信標5’-3’的基因序列為：

texasred標記-caggcatacac+t+aaagt-mgb修飾。

上述原料，除上游引物、下游引物、細胞裂解液外，均購自上海普洛麥格生物制品有限公司。上游引物和下游引物均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。野生型分子信標和突變型分子信標均由上海占標生物科技有限公司合成。

二.pcr反應(yīng)混合液配制

各原料的加入量如表2所示。所有配制均在滅菌后的超凈工作臺的冰盒上進行，保證低溫且無污染。

表2

三、aldh2基因型檢測

aldh2基因型快速檢測試劑盒由9支分裝好的試劑管組成，每個被測者檢測3次重復(fù)(一次一支反應(yīng)液)，每測試9支試劑，同時測試一次質(zhì)控品，質(zhì)控品即為提純的人類dna樣品，作為平行測試。該質(zhì)控品為aldh2突變雜合型，當(dāng)結(jié)果如圖22所示時，表明試劑能有效地進行分型，表示其他試劑測試結(jié)果同樣可信。

將配制好的pcr反應(yīng)混合液分裝于試劑管中，實施例一、二、三、四、五每支分裝23.5μl，-20℃避光保存；

(1)取樣前用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，盡量避免口腔內(nèi)壁殘留唾液；

(2)取出一次性使用無菌拭子(專利授權(quán)公告號：cn205359515u)及反應(yīng)液，拔掉反應(yīng)液塞子及拭子端蓋；

(3)使拭子端部近90°接觸口腔內(nèi)腮壁，實施例一、二、三、四均勻刮拭5次(上下為1次)，實施例五分別均勻刮拭3、5、7次(上下為1次)，力度以腮部微突為宜；

(4)取樣后立即將拭子插入反應(yīng)液中，按壓使其與試劑管密封，避光暫存；

(5)按壓頂部使其與試劑管密封，而后輕彈試劑管使樣本與反應(yīng)液充分混勻；

(6)用移液器取1μl質(zhì)控品加入到一支反應(yīng)液中，輕彈試劑管并混勻；

(7)將完成加樣的反應(yīng)液放入om-1000型熒光pcr儀器(專利授權(quán)公告號：cn103820306b)中，并運行表3中程序。

在20s內(nèi)連續(xù)完成步驟(2)～(4)。

表3

(7)得到擴增曲線和熒光顏色，分析結(jié)果。

四、結(jié)果分析

因為人類基因組為二倍體，每一基因座位上含有兩個等位基因。因此結(jié)果共有三種，分別是“gg”、“ga”或“aa”，其中陰性結(jié)果是“gg”，陽性結(jié)果是“ga”和“aa”。圖中g(shù)線表示aldh2未突變基因擴增情況，a線表示aldh2突變基因擴增情況。

實施例一的檢測結(jié)果為：

由圖1可知：只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型gg，檢測結(jié)果正確；

由圖2可知：只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合變異型aa，檢測結(jié)果正確；

由圖3可知：g線和a線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是雜合變異型ga，檢測結(jié)果正確；

實施例二的檢測結(jié)果為：

由圖4可知：只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型gg，檢測結(jié)果正確；

由圖5可知：只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合變異型aa，檢測結(jié)果正確；

由圖6可知：g線和a線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是雜合變異型ga，檢測結(jié)果正確；

實施例三的檢測結(jié)果為：

由圖7可知：只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型gg，檢測結(jié)果正確；

由圖8可知：只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合變異型aa，檢測結(jié)果正確；

由圖9可知：只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變型，檢測結(jié)果錯誤。

實施例四的檢測結(jié)果為：

由圖10可知：只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型gg，檢測結(jié)果正確；

由圖11可知：只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合變異型aa，檢測結(jié)果正確；

由圖12可知：g線和a線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是雜合變異型ga，檢測結(jié)果正確；

實施例五檢測結(jié)果為：

由圖13可知：取樣3次時，只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型gg，檢測結(jié)果正確；

由圖14可知：取樣3次時，只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合變異型aa，檢測結(jié)果正確；

由圖15可知：取樣3次時，g線和a線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是雜合變異型ga，檢測結(jié)果正確；

由圖16可知：取樣5次時，只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型gg，檢測結(jié)果正確；

由圖17可知：取樣5次時，只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合變異型aa，檢測結(jié)果正確；

由圖18可知：取樣5次時，g線和a線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是雜合變異型ga，檢測結(jié)果正確；

由圖19可知：取樣7次時，只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型gg，檢測結(jié)果正確；

由圖20可知：取樣7次時，只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合變異型aa，檢測結(jié)果正確；

由圖21可知：取樣7次時，g線和a線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是雜合變異型ga，檢測結(jié)果正確；

綜合實施例一、實施例二、實施例四和實施例五分型結(jié)果均正確，實施例三分型結(jié)果錯誤。說明本發(fā)明的各原料終濃度的均可檢測正確，超出本發(fā)明原料的終濃度檢測不準確。綜合應(yīng)該強度、ct值及曲線擬合情況，最終選擇實施例二組合為最佳原料配比。實施例五的分型結(jié)果均正確，說明刮取次數(shù)對檢測結(jié)果無影響。

核苷酸序列表如下：

<110>重慶京因生物科技有限責(zé)任公司

<120>aldh2基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

acagggtcaactgctatgat

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

agcaggtcccacactca

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

aggcatacac+t+gaagt

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

caggcatacac+t+aaagt。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。

<110>重慶京因生物科技有限責(zé)任公司

<120>aldh2基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法

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