本發(fā)明涉及考古檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
蠶絲是一種天然高分子蛋白質(zhì)纖維，主要分為家蠶絲和柞蠶絲兩大類。我國是最早利用柞蠶和放養(yǎng)柞蠶的國家，但其起源問題一直籠罩在迷霧中，迫切需要一種更科學(xué)的方法來鑒定出土的絲織品。蠶絲的常規(guī)檢測方法主要有傅里葉紅外光譜、拉曼光譜、x-射線衍射等，但蠶絲長期處于墓葬或遺址環(huán)境中會受到多種因素影響，從而出現(xiàn)蛋白質(zhì)降解及大分子鏈斷裂等問題，采用傳統(tǒng)的一些方法很難檢測到絲素蛋白的存在。因此如何采用自然科學(xué)的先進(jìn)手段，建立絲織品微痕檢測技術(shù)體系，從印痕，殘留物，土壤中提取古代絲綢的信息，對研究絲綢的起源至關(guān)重要。當(dāng)前蛋白質(zhì)檢測的先進(jìn)技術(shù)是基于抗體-抗原的westernblotting或elisa法，柞蠶絲素蛋白抗體的制備是該研究的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前已出現(xiàn)了柞蠶絲素蛋白的多克隆抗體，抗體的特異性取決于抗原分子的決定簇，抗原分子具有很多抗原決定簇，因此免疫動物產(chǎn)生的抗體為多種抗體的混合物，要把這些不同的抗體分開十分困難，同時多克隆抗體存在純度低、理化性狀不均一、與抗原結(jié)合特異性不強(qiáng)等問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明方法制備的抗體具有很強(qiáng)的特異性，且其在應(yīng)用過程中操作簡單快捷，檢測準(zhǔn)確性高。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：
a）稱取柞蠶絲并將其以1:23-27的浴比添加至去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至2.5-3.0，于98-102℃水浴中恒溫加熱55-65min進(jìn)行脫膠，然后加入nahco3調(diào)節(jié)ph至中性，按上述方法至少重復(fù)脫膠一次；將脫膠后的柞蠶絲加入至去離子水中浸泡1.5-2.5h，然后在55-65℃下烘干，制得柞蠶絲素蛋白樣品。
b）稱取9-11gfecl2，加入48-52ml去離子水溶解后再滴加14-16ml的亞氨基二琥珀酸四鈉，充分混合后定容至100ml，得到混合溶液。
本發(fā)明采取fecl2與亞氨基二琥珀酸四鈉混合配比溶液較現(xiàn)有方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：易生物降解，對生態(tài)系統(tǒng)無毒無害；亞氨基二琥珀酸四鈉對金屬離子螯合能力強(qiáng)使試劑對蛋白質(zhì)的提取效果更優(yōu)。
c）將步驟a）所得柞蠶絲素蛋白樣品按固液比0.9-1.1g/15ml加入到步驟b）所得混合溶液中，在55-65℃水浴中攪拌保溫55-65min，取出待冷卻后，將溶液置于45-55khz的超聲波下處理25-35min，同時用乙酸緩慢調(diào)節(jié)ph為8.5-9.0；然后將溶液裝入透析袋中進(jìn)行透析，每2.5-3.5h換一次水值至袋內(nèi)溶液ph小于7，將袋內(nèi)溶液冷凍干燥后得到純化的柞蠶絲素蛋白，磨粉后制得柞蠶絲素蛋白完全抗原，備用。
本發(fā)明在提取過程中使用超聲處理，與傳統(tǒng)方法相比就具有提取得率更高和生產(chǎn)周期更短的優(yōu)點(diǎn)。
d）用生理鹽水溶解步驟c）所得柞蠶絲素蛋白完全抗原，控制濃度為1-2mg/ml，然后與quickantibody-rabbit8w按體積比0.9-1.1:1混合，制得抗原佐劑混合溶液；選取2只的大白兔進(jìn)行初次免疫，用抗原佐劑混合溶液對每只兔的后大腿和皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射；在完成初次免疫后的第3周使用同樣的抗原佐劑混合溶液對兔子進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，進(jìn)行加強(qiáng)免疫；第5周選取免疫后效價相對較高的大白兔進(jìn)入單克隆抗體制備。
e）用0.4-0.6mg步驟c）所得柞蠶絲素蛋白完全抗原對選取的大兔進(jìn)行靜脈注射，7天后在無菌條件下取出脾臟，在無菌培養(yǎng)皿中將脾臟清理干凈，用1640培養(yǎng)液沖洗，將洗凈后的脾臟放入無菌皿中，加入1640培養(yǎng)液10ml，將脾臟碾碎過篩網(wǎng)，然后用1640培養(yǎng)液懸浮，在10000-14000rpm下離心4-6min，移除上清液，再洗滌一次，得到細(xì)胞懸液，并將其濃度稀釋為含有1×108個脾淋巴細(xì)胞的懸液，備用，在細(xì)胞融合試驗(yàn)前5天，另行取骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
f）取步驟e）培養(yǎng)得到的脾淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按1.8-2.2:1的數(shù)量比混勻，加培養(yǎng)液后在10000-14000rpm下離心4-6min，棄上清液，在35-39℃水浴中恒溫加熱，并緩緩加入聚乙二醇-1500，再加入1640培養(yǎng)液稀釋，在10000-14000rpm下離心，棄上清液后將細(xì)胞用20%hat選擇培養(yǎng)液懸浮。
g）步驟f）所得細(xì)胞融合10天后，用間接elisa法選出分泌抗體呈陽性，抗體分泌能力強(qiáng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，用hat培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用有限稀釋法在96孔板內(nèi)進(jìn)行克隆化，選擇單個細(xì)胞集落孔的培養(yǎng)上清作抗體檢測，陽性者用同樣方法再次克隆，直至克隆后有雜交瘤細(xì)胞生長的抗體分泌陽性率為100%，利用篩選出的細(xì)胞進(jìn)行大轉(zhuǎn)生產(chǎn)，收集兔單克隆抗體進(jìn)入純化階段。
h）ph7.4的pbs溶液的制備。
i）對步驟g）所得兔單克隆抗體進(jìn)行純化：用10ml，0.5mol/l的nacl溶液和10ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液對蛋白柱進(jìn)行清洗，清洗流速為58-62ml/h；用30ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液將收集到的兔單克隆抗體稀釋，稀釋后上樣，重復(fù)上樣一次；用20ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液清洗柱子，清洗的流速為115-125ml/h，使其在280nm處的紫外吸收接近基線；用0.5mol/l的nacl溶液和0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液進(jìn)行洗脫；洗脫完成后用0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液洗滌多肽柱，獲得純化后的柞蠶絲素蛋白單克隆抗體，在1-5℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明采用的上述純化方法與現(xiàn)有方法相比，具有操作簡單快捷，所得抗體純度高，生物活性好的優(yōu)點(diǎn)。
作為優(yōu)選，步驟c）中，所述透析袋的規(guī)格為截留分子量8000。
作為優(yōu)選，步驟d）中，所述大白兔為14-16周齡。
作為優(yōu)選，步驟d）中，初次免疫和加強(qiáng)免疫時抗原佐劑混合溶液的注射量為100μl。
作為優(yōu)選，步驟h）中，所述ph7.4的pbs溶液的之制備方法為：稱取0.27g磷酸二氫鉀，1.42g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉和0.2g氯化鉀，加入到800ml去離子水中，然后混合攪拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶進(jìn)行定容，調(diào)節(jié)溶液的ph為7.4。
上述方法制得的柞蠶絲素蛋白單克隆抗體在文物樣品質(zhì)地鑒定中的應(yīng)用，方法如下：
取待檢文物的部分作為檢測樣品，對檢測樣品提取蛋白后干燥粉碎；對其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的濃度在酶標(biāo)板中包被11-13h，每孔用200μl的ph7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在35-39℃下封閉110-130min；每孔用200μl的ph7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次，然后將柞蠶絲素蛋白單克隆抗體分別用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀釋1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μl柞蠶絲素蛋白單克隆抗體稀釋液，35-39℃下孵育50-70min，用ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗滌5次；每孔加入100μl的辣根過氧化酶標(biāo)二抗，35-39℃下孵育55-65min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀釋5000倍；最后每孔加入100μl的1wt%的四甲基聯(lián)苯胺溶液于黑暗處顯色，9-11min后，加入100μl，2mol/l的h2so4終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測定od450nm，當(dāng)od值達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)時就可以確定檢測樣品中含有柞蠶絲；根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，可以判斷柞蠶絲素蛋白的存在。
與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明的有益效果是：
1）采用柞蠶絲直接提取的絲素蛋白制備出來的單克隆抗體具有很強(qiáng)的特異性，能夠與柞蠶絲素蛋白具有明顯的免疫反應(yīng)，靈敏度很高。
2）采用柞蠶絲素蛋白制備出來的單克隆抗體能夠?qū)糯z制品中的柞蠶絲素蛋白分子做出檢測，為中國早期墓葬中絲織物的檢測提供了一種敏感、特異、快捷的辨識方法，為探究柞蠶絲的起源問題提供了一種科學(xué)的方法。
3）采取fecl2與亞氨基二琥珀酸四鈉混合配比溶液的易生物降解，對生態(tài)系統(tǒng)無毒無害；亞氨基二琥珀酸四鈉對金屬離子螯合能力強(qiáng)使試劑對蛋白質(zhì)的提取效果更優(yōu)。
4）使用超聲處理與傳統(tǒng)方法相比提取得率更高和生產(chǎn)周期更短。
5）采用的抗體純化方法操作簡單快捷，所得抗體純度高，生物活性好的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例一
a）稱取10g柞蠶絲以1:25的浴比加入去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至2.5，于100℃水浴下恒溫60min進(jìn)行脫膠，水浴結(jié)束后加入nahco3調(diào)節(jié)ph至中性，反復(fù)操作3次。脫膠后的柞蠶絲加入至200ml去離子水中浸泡2h，然后在60℃下烘干。
b）稱取10gfecl2，加入50ml去離子水溶解后滴加15ml的亞氨基二琥珀酸四鈉，充分混合后定容至100ml。
c）稱取1g步驟a）中所得絲素蛋白樣品，加入15ml步驟b）中配得的混合溶液,在60℃水浴上攪拌保溫60min。取出待冷卻后，將溶液置于30khz的超聲波下處理30min，同時用乙酸緩慢調(diào)節(jié)ph為8.5。中和后的溶液裝入透析袋（截留分子量8000）進(jìn)行透析，每3小時換一次水至袋內(nèi)溶液ph小于7，對剩余溶液進(jìn)行冷凍干燥得到純化的柞蠶絲素蛋白，磨成粉末作為完全抗原備用。
d）用適量的生理鹽水溶解步驟c）中所得柞蠶絲素蛋白粉，稀釋為1mg/ml，然后與quickantibody-rabbit8w按體積比1:1混合。選取2只大白兔（14-16周齡）進(jìn)行初次免疫。用上述制得的抗原佐劑混合溶液對每只兔的后大腿和皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，注射量為100μl。在完成初次免疫后的第3周使用同樣的抗原佐劑混合溶液對兔子進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，注射量為100μl，進(jìn)行加強(qiáng)免疫；第5周選取免疫后效價相對較高的大白兔進(jìn)入單克隆抗體制備。
e）用0.5mg步驟c）中所得柞蠶絲素蛋白完全抗原對選取的大兔進(jìn)行靜脈注射，7天后在無菌條件下取出脾臟，在無菌培養(yǎng)皿中將脾臟清理干凈，用1640培養(yǎng)液沖洗。將洗凈后的脾臟放入無菌皿中，加入1640培養(yǎng)液10ml，將脾臟碾碎過不銹鋼篩網(wǎng)，然后用1640培養(yǎng)液懸浮，在12000rpm下離心5min。移除上清，再洗滌一次。得到細(xì)胞懸液，并將其濃度稀釋為含有1×108個脾淋巴細(xì)胞的懸液，備用，在細(xì)胞融合試驗(yàn)前5天，另行取骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
f）取步驟e）培養(yǎng)得到的脾淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按2:1的數(shù)量比混勻，加培養(yǎng)液后在12000rpm下離心5min,棄上清。在37℃水浴中恒溫加熱，并緩緩加入聚乙二醇-1500，再加入1640培養(yǎng)液稀釋，在12000rpm下離心，棄上清后將細(xì)胞用20%hat選擇培養(yǎng)液懸浮。
g）步驟f）中細(xì)胞融合10天后，用間接elisa法選出分泌抗體呈陽性，抗體分泌能力強(qiáng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，用hat培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用有限稀釋法在96孔板內(nèi)進(jìn)行克隆化，選擇單個細(xì)胞集落孔的培養(yǎng)上清作抗體檢測，陽性者用同樣方法再次克隆，直至克隆后有雜交瘤細(xì)胞生長的抗體分泌陽性率為100%。利用篩選出的細(xì)胞進(jìn)行大轉(zhuǎn)生產(chǎn)，收集兔單克隆抗體進(jìn)入純化階段。
h）稱取0.27g磷酸二氫鉀，1.42g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉和0.2g氯化鉀，加入到800ml去離子水中，然后混合攪拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶進(jìn)行定容，調(diào)節(jié)溶液的ph為7.4，得到ph7.4的pbs溶液。
i）對步驟g）中所得單抗進(jìn)行純化：用10ml，0.5mol/l的nacl溶液和10ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs對蛋白柱進(jìn)行清洗，清洗流速為60ml/h；用30ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液將收集到的兔單克隆抗體稀釋，稀釋后上樣，重復(fù)上樣一次；用20ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs清洗柱子，清洗的流速為120ml/h，使其在280nm處的紫外吸收接近基線；用0.5mol/l的nacl溶液和0.05mol/l，ph7.4的pbs進(jìn)行洗脫；洗脫完成后用0.05mol/l，ph7.4的pbs洗滌多肽柱，獲得純化后的柞蠶絲素蛋白單克隆抗體，在4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>
j）特異性檢測：取待檢文物的部分作為檢測樣品，對檢測樣品提取蛋白后干燥粉碎；對其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的濃度在酶標(biāo)板中包被12h，每孔用200μl的ph7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在37℃下封閉120min；每孔用200μl的ph7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次，然后將柞蠶絲素蛋白單克隆抗體分別用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀釋1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μl柞蠶絲素蛋白單克隆抗體稀釋液，35-39℃下孵育50-70min，用ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗滌5次；每孔加入100μl的辣根過氧化酶標(biāo)二抗，37℃下孵育60min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀釋5000倍；最后每孔加入100μl的1wt%的四甲基聯(lián)苯胺溶液于黑暗處顯色，10min后，加入100μl，2mol/l的h2so4終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測定od450nm，當(dāng)od值達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)時就可以確定檢測樣品中含有柞蠶絲；根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，可以判斷柞蠶絲素蛋白的存在。
實(shí)施例二
a)稱取10g柞蠶絲以1:25的浴比加入去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至3，于100℃水浴下恒溫60min進(jìn)行脫膠，水浴結(jié)束后加入nahco3調(diào)節(jié)ph至中性，反復(fù)操作3次。脫膠后的柞蠶絲加入至200ml去離子水中浸泡2h，然后在60℃下烘干。
b)稱取10gfecl2，加入50ml去離子水溶解后滴加15ml的亞氨基二琥珀酸四鈉，充分混合后定容至100ml。
c)稱取1g步驟a）中所得絲素蛋白樣品，加入15ml步驟b）中配得的混合溶液,在60℃水浴上攪拌保溫60min。取出待冷卻后，將溶液置于50khz的超聲波下處理30min，同時用乙酸緩慢調(diào)節(jié)ph為9。中和后的溶液裝入透析袋（截留分子量8000）進(jìn)行透析，每3小時換一次水至袋內(nèi)溶液ph小于7，對剩余溶液進(jìn)行冷凍干燥得到純化的柞蠶絲素蛋白，磨成粉末作為完全抗原備用。
d)用適量的生理鹽水溶解步驟c）中所得柞蠶絲素蛋白粉，稀釋為1.5mg/ml，然后與quickantibody-rabbit8w按體積比1:1混合。選取2只大白兔（14-16周齡）進(jìn)行初次免疫。用上述制得的抗原佐劑混合溶液對每只兔的后大腿和皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，注射量為100μl。在完成初次免疫后的第3周使用同樣的抗原佐劑混合溶液對兔子進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，注射量為100μl，進(jìn)行加強(qiáng)免疫；第5周選取免疫后效價相對較高的大白兔進(jìn)入單克隆抗體制備。
e)用0.5mg步驟c）中所得柞蠶絲素蛋白完全抗原對選取的大兔進(jìn)行靜脈注射，7天后在無菌條件下取出脾臟，在無菌培養(yǎng)皿中將脾臟清理干凈，用1640培養(yǎng)液沖洗。將洗凈后的脾臟放入無菌皿中，加入1640培養(yǎng)液10ml，將脾臟碾碎過不銹鋼篩網(wǎng)，然后用1640培養(yǎng)液懸浮，在12000rpm下離心5min。移除上清，再洗滌一次。得到細(xì)胞懸液，并將其濃度稀釋為含有1×108個脾淋巴細(xì)胞的懸液，備用，在細(xì)胞融合試驗(yàn)前5天，另行取骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
f)取步驟e）培養(yǎng)得到的脾淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按2:1的數(shù)量比混勻，加培養(yǎng)液后在12000rpm下離心5min,棄上清。在37℃水浴中恒溫加熱，并緩緩加入聚乙二醇-1500，再加入1640培養(yǎng)液稀釋，在12000rpm下離心，棄上清后將細(xì)胞用20%hat選擇培養(yǎng)液懸浮。
g)步驟f）中細(xì)胞融合10天后，用間接elisa法選出分泌抗體呈陽性，抗體分泌能力強(qiáng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，用hat培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用有限稀釋法在96孔板內(nèi)進(jìn)行克隆化，選擇單個細(xì)胞集落孔的培養(yǎng)上清作抗體檢測，陽性者用同樣方法再次克隆，直至克隆后有雜交瘤細(xì)胞生長的抗體分泌陽性率為100%。利用篩選出的細(xì)胞進(jìn)行大轉(zhuǎn)生產(chǎn)，收集兔單克隆抗體進(jìn)入純化階段。
h)稱取0.27g磷酸二氫鉀，1.42g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉和0.2g氯化鉀，加入到800ml去離子水中，然后混合攪拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶進(jìn)行定容，調(diào)節(jié)溶液的ph為7.4，得到ph7.4的pbs溶液。
i)對步驟g）中所得單抗進(jìn)行純化：用10ml，0.5mol/l的nacl溶液和10ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs對蛋白柱進(jìn)行清洗，清洗流速為60ml/h；用30ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液將收集到的兔單克隆抗體稀釋，稀釋后上樣，重復(fù)上樣一次；用20ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs清洗柱子，清洗的流速為120ml/h，使其在280nm處的紫外吸收接近基線；用0.5mol/l的nacl溶液和0.05mol/l，ph7.4的pbs進(jìn)行洗脫；洗脫完成后用0.05mol/l，ph7.4的pbs洗滌多肽柱，獲得純化后的柞蠶絲素蛋白單克隆抗體，在4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>
j)特異性檢測：取待檢文物的部分作為檢測樣品，對檢測樣品提取蛋白后干燥粉碎；對其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的濃度在酶標(biāo)板中包被11h，每孔用200μl的ph7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在35℃下封閉130min；每孔用200μl的ph7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次，然后將柞蠶絲素蛋白單克隆抗體分別用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀釋1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μl柞蠶絲素蛋白單克隆抗體稀釋液，35℃下孵育70min，用ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗滌5次；每孔加入100μl的辣根過氧化酶標(biāo)二抗，35℃下孵育65min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀釋5000倍；最后每孔加入100μl的1wt%的四甲基聯(lián)苯胺溶液于黑暗處顯色，9min后，加入100μl，2mol/l的h2so4終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測定od450nm，當(dāng)od值達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)時就可以確定檢測樣品中含有柞蠶絲；根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，可以判斷柞蠶絲素蛋白的存在。
實(shí)施例三
a)稱取10g柞蠶絲以1:25的浴比加入去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至3，于100℃水浴下恒溫60min進(jìn)行脫膠，水浴結(jié)束后加入nahco3調(diào)節(jié)ph至中性，反復(fù)操作3次。脫膠后的柞蠶絲加入至200ml去離子水中浸泡2h，然后在60℃下烘干。
b)稱取10gfecl2，加入50ml去離子水溶解后滴加15ml的亞氨基二琥珀酸四鈉，充分混合后定容至100ml。
c)稱取1g步驟a）中所得絲素蛋白樣品，加入15ml步驟b）中配得的混合溶液,在60℃水浴上攪拌保溫60min。取出待冷卻后，將溶液置于40khz的超聲波下處理30min,同時用乙酸緩慢調(diào)節(jié)ph為8.5。中和后的溶液裝入透析袋（截留分子量8000）進(jìn)行透析，每3小時換一次水至袋內(nèi)溶液ph小于7，對剩余溶液進(jìn)行冷凍干燥得到純化的柞蠶絲素蛋白，磨成粉末作為完全抗原備用。
d)用適量的生理鹽水溶解步驟c）中所得柞蠶絲素蛋白粉，稀釋為2mg/ml，然后與quickantibody-rabbit8w按體積比1:1混合。選取2只大白兔（14-16周齡）進(jìn)行初次免疫。用上述制得的抗原佐劑混合溶液對每只兔的后大腿和皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，注射量為100μl。在完成初次免疫后的第3周使用同樣的抗原佐劑混合溶液對兔子進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，注射量為100μl，進(jìn)行加強(qiáng)免疫；第5周選取免疫后效價相對較高的大白兔進(jìn)入單克隆抗體制備。
e)用0.5mg步驟c）中所得柞蠶絲素蛋白完全抗原對選取的大兔進(jìn)行靜脈注射，7天后在無菌條件下取出脾臟，在無菌培養(yǎng)皿中將脾臟清理干凈，用1640培養(yǎng)液沖洗。將洗凈后的脾臟放入無菌皿中，加入1640培養(yǎng)液10ml，將脾臟碾碎過不銹鋼篩網(wǎng)，然后用1640培養(yǎng)液懸浮，在12000rpm下離心5min。移除上清，再洗滌一次。得到細(xì)胞懸液，并將其濃度稀釋為含有1×108個脾淋巴細(xì)胞的懸液，備用，在細(xì)胞融合試驗(yàn)前5天，另行取骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
f)取步驟e）培養(yǎng)得到的脾淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按2:1的數(shù)量比混勻，加培養(yǎng)液后在12000rpm下離心5min,棄上清。在37℃水浴中恒溫加熱，并緩緩加入聚乙二醇-1500，再加入1640培養(yǎng)液稀釋，在12000rpm下離心，棄上清后將細(xì)胞用20%hat選擇培養(yǎng)液懸浮。
g)步驟f）中細(xì)胞融合10天后，用間接elisa法選出分泌抗體呈陽性，抗體分泌能力強(qiáng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，用hat培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用有限稀釋法在96孔板內(nèi)進(jìn)行克隆化，選擇單個細(xì)胞集落孔的培養(yǎng)上清作抗體檢測，陽性者用同樣方法再次克隆，直至克隆后有雜交瘤細(xì)胞生長的抗體分泌陽性率為100%。利用篩選出的細(xì)胞進(jìn)行大轉(zhuǎn)生產(chǎn)，收集兔單克隆抗體進(jìn)入純化階段。
h)稱取0.27g磷酸二氫鉀，1.42g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉和0.2g氯化鉀，加入到800ml去離子水中，然后混合攪拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶進(jìn)行定容，調(diào)節(jié)溶液的ph為7.4，得到ph7.4的pbs溶液。
i)對步驟g）中所得單抗進(jìn)行純化：用10ml，0.5mol/l的nacl溶液和10ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs對蛋白柱進(jìn)行清洗，清洗流速為60ml/h；用30ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液將收集到的兔單克隆抗體稀釋，稀釋后上樣，重復(fù)上樣一次；用20ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs清洗柱子，清洗的流速為120ml/h，使其在280nm處的紫外吸收接近基線；用0.5mol/l的nacl溶液和0.05mol/l，ph7.4的pbs進(jìn)行洗脫；洗脫完成后用0.05mol/l，ph7.4的pbs洗滌多肽柱，獲得純化后的柞蠶絲素蛋白單克隆抗體，在4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>
j)特異性檢測：取待檢文物的部分作為檢測樣品，對檢測樣品提取蛋白后干燥粉碎；對其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的濃度在酶標(biāo)板中包被13h，每孔用200μl的ph7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在39℃下封閉110min；每孔用200μl的ph7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次，然后將柞蠶絲素蛋白單克隆抗體分別用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀釋1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μl柞蠶絲素蛋白單克隆抗體稀釋液，39℃下孵育50min，用ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗滌5次；每孔加入100μl的辣根過氧化酶標(biāo)二抗，39℃下孵育55min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀釋5000倍；最后每孔加入100μl的1wt%的四甲基聯(lián)苯胺溶液于黑暗處顯色，11min后，加入100μl，2mol/l的h2so4終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測定od450nm，當(dāng)od值達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)時就可以確定檢測樣品中含有柞蠶絲；根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，可以判斷柞蠶絲素蛋白的存在。
本發(fā)明方法中柞蠶絲素蛋白的提取率，可達(dá)75%以上。
本發(fā)明中所用原料、設(shè)備，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常用原料、設(shè)備；本發(fā)明中所用方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。