本發(fā)明屬于植物線蟲鑒定領(lǐng)域，具體涉及用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的分子標(biāo)記；還涉及用于鑒定該線蟲的特異性引物，以及利用該分子標(biāo)記或特異性引物鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的方法。

背景技術(shù)：

長嶺發(fā)墊刃線蟲(trichotylenchuschanglingensis)是一種遷移性植物外寄生線蟲，屬于發(fā)墊刃線蟲屬(trichotylenchus)。2011年該線蟲首次在馬鈴薯的根際土壤中發(fā)現(xiàn)(xucletal.,nematology,2011，13(1):45-49)。該線蟲能引起玉米葉片黃化、植株矮化、莖基部開裂、莖節(jié)縮短等癥狀(郭寧等.植物保護(hù)學(xué)報(bào).2015,42(6):884-8910)，對玉米的危害十分嚴(yán)重。

國內(nèi)外對長嶺發(fā)墊刃線蟲的研究較少，傳統(tǒng)的鑒定方法主要是基于形態(tài)特征，但是這種方法對操作人員的技術(shù)要求高，必須具有高度的線蟲分類學(xué)專業(yè)技能，而一般操作人員不具備這種能力；此外，通常線蟲樣品數(shù)量少，有時僅有1個，也增加了鑒定難度，因此，通過形態(tài)特征對線蟲進(jìn)行鑒定的難度極大。以pcr為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)為線蟲鑒定提供了新的途徑，本發(fā)明人曾以its區(qū)和28s區(qū)為靶標(biāo)區(qū)，采用線蟲通用引物對長嶺發(fā)墊刃線蟲進(jìn)行pcr鑒定，但是由于通用引物缺少特異性，檢測單條線蟲效果較差(葛建軍等，植物病理學(xué)報(bào)，2007，37(5)：472-478)，因此，利用通用引物無法實(shí)現(xiàn)對長嶺發(fā)墊刃線蟲的準(zhǔn)確鑒定。

雙重pcr(duplexpcr)是指同一反應(yīng)體系里含有兩對引物，同時擴(kuò)增兩個核酸片段的pcr反應(yīng)。雙重pcr不僅具有普通pcr的高靈敏度，而且有更高的特異性。雙重pcr已廣泛用于線蟲的分類鑒定，如專利申請《一對用于貝西滑刃線蟲pcr檢測的特異性引物及其使用方法》(cn105603060a)公開了利用雙重pcr鑒定貝西滑刃線蟲的特異性引物和鑒定方法。

經(jīng)檢索，沒有發(fā)現(xiàn)用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的分子標(biāo)記或特異性引物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對長嶺發(fā)墊刃線蟲形態(tài)鑒定對操作人員技術(shù)要求高，以及利用通用引物進(jìn)行pcr檢測鑒定效果差等問題，本發(fā)明目的在于提供一種用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的分子標(biāo)記。

本發(fā)明另一目的在于提供用于擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的引物。

本發(fā)明第三目的在于提供用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的pcr檢測試劑盒。

本發(fā)明第四目的在于提供利用上述引物鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的方法。

本發(fā)明第五目的在于提供一種用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的雙重分子標(biāo)記。

本發(fā)明第六目的在于提供一種用于擴(kuò)增上述雙重分子標(biāo)記的雙重引物。

本發(fā)明第七目的在于提供用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的雙重pcr檢測試劑盒。

本發(fā)明第八目的在于提供一種利用上述雙重引物鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記由seqidno.1所示的核苷酸序列組成。

所述的分子標(biāo)記的dna片段大小為520bp。

本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的引物，所述的引物由tc-f1和tc-r1組成；其中所述的tc-f1由seqidno.2所示的核苷酸序列組成；所述的tc-r1由seqidno.3所示的核苷酸序列組成；

tc-f1：5’-attgtgtgtcctgtctgcg-3’(seqidno.2)，

tc-r1：5’-gcaaagcaccatcctcaag-3’(seqidno.3)。

本發(fā)明還提供了用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的pcr檢測試劑盒，所述的試劑盒中含有上述引物tc-f1和tc-r1；其中所述的tc-f1由seqidno.2所示的核苷酸序列組成；所述的tc-r1由seqidno.3所示的核苷酸序列組成。

上述pcr檢測試劑盒，還包括10×extaqbuffer(mg²⁺)、5u/μlextaq聚合酶、2.5mmol/ldntpsmixture和ddh2o。

上述引物在長嶺發(fā)墊刃線蟲(trichotylenchuschanglingensis)鑒定或檢測上的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中所述的引物由seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列組成。

本發(fā)明還提供了利用上述引物鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的方法，包括提取待測線蟲dna；以待測線蟲dna為模板，以tc-f1和tc-r1為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，如果所得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物大小為520bp，即為長嶺發(fā)墊刃線蟲。

上述方法中所述的待測線蟲dna，可以通過單條線蟲提取。

上述方法中所述的引物tc-f1由seqidno.2所示的核苷酸序列組成；所述的引物tc-r1由seqidno.3所示的核苷酸序列組成。

上述方法中所述的pcr反應(yīng)體系(25μl)為：12.5μl2*estaqmastermix，模板dna0.5μl，正反引物(10μmol·l^-1)各0.3μl，最后補(bǔ)足ddh2o至25μl。

上述方法中所述的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃4min；95℃30s，62℃45s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃10min。

本發(fā)明還提供了用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的雙重分子標(biāo)記，包括上述分子標(biāo)記，還包括由seqidno.4所示的核苷酸序列組成的分子標(biāo)記2。

所述分子標(biāo)記2的dna片段大小為780bp。

本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增上述雙重分子標(biāo)記的雙重引物，所述的雙重引物包括上述引物tc-f1和tc-r1，還包括引物d2a和d3b；其中所述的tc-f1由seqidno.2所示的核苷酸序列組成；所述的tc-r1由seqidno.3所示的核苷酸序列組成；所述的d2a由seqidno.5所示的核苷酸序列組成；所述的d3bd3b由seqidno.6所示的核苷酸序列組成；

d2a：5’-acaagtaccgtgagggaaagttg-3’(seqidno.5)；

d3b：5’-tcggaaggaaccagctacta-3’(seqidno.6)。

用于長嶺發(fā)墊刃線蟲的雙重pcr檢測試劑盒，包括引物tc-f1和tc-r1，以及引物d2a和d3b；其中所述的d2a由seqidno.5所示的核苷酸序列組成；所述的d3b由seqidno.6所示的核苷酸序列組成。

上述雙重pcr檢測試劑盒，還包括10×extaqbuffer(mg²⁺)、5u/μlextaq聚合酶、2.5mmol/ldntpsmixture和ddh2o。

用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的雙重pcr方法，包括提取待測線蟲dna；以待測線蟲dna為模板，以tc-f1和tc-r1、以及d2a和d3b為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然在將擴(kuò)增產(chǎn)物在在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，如果所得的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分別為520bp和780bp的2個核苷酸片段，即為長嶺發(fā)墊刃線蟲。

上述雙重pcr方法中所述的待測線蟲dna，可以通過單條線蟲提取。

上述雙重pcr方法中所述的pcr反應(yīng)體系為：10×extaqbuffer(mg²⁺)2.5μl、5u/μlextaq聚合酶0.2μl、模板dna0.5μl，2.5mmol/ldntpsmixture2μl、引物tc-f1/tc-r1各0.5μl、d2a/d3b(10μmol·l^-1)各1μl，最后補(bǔ)足ddh2o至25μl。

上述雙重pcr方法中所述的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃4min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃10min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)、本發(fā)明針對長嶺發(fā)墊刃線蟲設(shè)計(jì)的引物特異性強(qiáng)，對長嶺發(fā)墊刃線蟲的鑒定準(zhǔn)確度高、可靠性強(qiáng)；(2)、本發(fā)明方法檢測靈敏度高，單條線蟲dna的1/32×(濃度0.125ng/μl)時，都能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定的條帶，(3)本發(fā)明檢測方法簡單、檢測速度快、效率高；(4)本發(fā)明對操作人員要求低，不需要具備線蟲分類專業(yè)知識，一般的技術(shù)人員皆可完成。

附圖說明

圖1為以tc-f1/tc-r1為引物檢測長嶺發(fā)墊刃線蟲的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；其中m為dnamarkerdl2000；1為heb1；2為heb2；3為heb3；4為sy1；5為cc1；6為qd1；7為zb1；8為xt1；9為d1；10為m1；11為h1；12為p1；13為c1；14為ddh2o陰性對照。

圖2為本發(fā)明雙重pcr方法檢測長嶺發(fā)墊刃線蟲的電泳圖譜；其中m為dnamarkerdl2000；1為heb1；2為heb2；3為heb3；4為sy1；5為cc1；6為qd1；7為zb1；8為xt1；9為d1；10為m1；11為h1；12為p1；13為c1；14為ddh2o陰性對照。

圖3為雙重pcr方法中長嶺發(fā)墊刃線蟲模板底物濃度的靈敏度試驗(yàn)電泳圖譜；其中m為dnamarkerdl2000；1為1/4×；2為1/8×；3為1/16×；4為1/32×；5為1/64×；6為1/128×；7為1/256×；8為1/512；9為ddh2o陰性對照。

具體實(shí)施方式

主要試劑:蛋白酶k、10xpcrbuffer、10xextaqbuffer、dntpmix、extaq、dh5ɑ、pmd19-tvector購自寶生物工程有限公司；2xeasytaqsupermix購自北京全式金生物技技有限公司；50xtae生工生物工程股份有限公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

實(shí)施例1、本發(fā)明長嶺發(fā)墊刃線蟲特異性引物的設(shè)計(jì)及引物特異性的pcr檢測試驗(yàn)

按照如下方進(jìn)行：

(一)試驗(yàn)材料及來源

1、長嶺發(fā)墊刃線蟲：heb1、heb2、heb3、sy1、cc1、qd1、zb1和xt1共8個。

2、其他線蟲：小桿線蟲c1、莖線蟲d1、根結(jié)線蟲m1、孢囊線蟲h1和短體線蟲p1。

以上線蟲均保存于河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

(二)試驗(yàn)方法

(1)單條線蟲dna提取。將線蟲置于滅菌去離子水中清洗，挑取單條線蟲放入10μl裂解緩沖液(1×pcrbuffer(mg²⁺)、1μg蛋白酶k)中，65℃水浴1min，液氮處理2min，反復(fù)凍融數(shù)次后，56℃孵育20min，95℃加熱10min，得到dna提取液，可直接用于pcr擴(kuò)增或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)特異性引物的設(shè)計(jì)。根據(jù)測序獲得的長嶺發(fā)墊刃線蟲群體its區(qū)核酸序列，同時檢索下載genbank數(shù)據(jù)庫中與該線蟲同源性比例高的線蟲，通過clustalx1.81軟件進(jìn)行序列比對分析差異位點(diǎn)，利用primer5.0設(shè)計(jì)長嶺發(fā)墊刃線蟲特異性引物。所設(shè)計(jì)的特異性引物序列如下：

tc-f1：5’-attgtgtgtcctgtctgcg-3’(seqidno.2)；

tc-r1：5’-gcaaagcaccatcctcaag-3’(seqidno.3)。

(3)pcr擴(kuò)增。以步驟(1)中提取的線蟲dna為模板，以tc-f1和tc-r1為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物。其中pcr反應(yīng)體系(25μl)為：其中12.5μl2*estaqmastermix，模板dna0.5μl，正反引物(10μmol·l^-1)各0.3μl，最后補(bǔ)足ddh2o至25μl；設(shè)無模板陰性對照。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃4min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35個循環(huán)；最后72℃10min。

(4)將步驟(3)中所得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，每個樣品取5ul在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳40min，電壓為160v；然后將凝膠放入eb染液中染色15min，再置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

結(jié)果8個長嶺發(fā)墊刃線蟲(見圖1泳道1-8)中均擴(kuò)增出1條長度為520bp的特異dna片段，而其他種類線蟲(見圖1泳道9-13)及陰性對照(ddh2o)(見圖1泳道14)中無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。說明tc-f1/tc-r1引物是長嶺發(fā)墊刃線蟲的特異性引物。

(5)將步驟(4)中的特異性片段回收，送交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，再進(jìn)行blast比對。

測序結(jié)果見seqidno.1所示的核苷酸序列。blast比對結(jié)果證明520bp的pcr產(chǎn)物即為長嶺發(fā)墊刃線蟲的特有dna片段，即分子標(biāo)記。

上述結(jié)果說明上述tc-f1/tc-r1引物即為長嶺發(fā)墊刃線蟲的特異性引物；上述520bp的特異dna片段即為鑒別長嶺發(fā)墊刃線蟲的分子標(biāo)記。

實(shí)施例2、本發(fā)明雙重pcr方法檢測長嶺發(fā)墊刃線蟲特異性試驗(yàn)

(一)試驗(yàn)材料：同實(shí)施例1的(一)。

(二)試驗(yàn)方法：

(1).單條線蟲dna提取。同實(shí)施例1的(二)(1)。

(2).雙重pcr擴(kuò)增。以線蟲dna為模板，以tc-f1/tc-r1、d2a/d3b為引物進(jìn)行雙重pcr擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物。其中pcr反應(yīng)體系為25μl：其中10×extaqbuffer(mg²⁺)2.5μl，5u/μlextaq聚合酶0.2μl，模板dna0.5μl，2.5mmol/ldntpsmixture2μl，引物tc-f1/tc-r1各0.5μl，d2a/d3b(10μmol·l^-1)各1μl，最后補(bǔ)足ddh2o至25μl，設(shè)無模板陰性對照。pcr反應(yīng)程序：95℃4min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃10min；16℃保存。其中所述的引物d2a和d3b為28s區(qū)的通用引物，作為內(nèi)標(biāo)引物：

d2a：5’-acaagtaccgtgagggaaagttg-3’(seqidno.5)；

d3b：5’-tcggaaggaaccagctacta-3’(seqidno.6)。

(3).電泳檢測。同實(shí)施例1。

結(jié)果(見圖2)8個長嶺發(fā)墊刃線蟲(泳道1-8)均擴(kuò)增出2條清晰、穩(wěn)定的條帶，其中大小為780bp的條帶是由內(nèi)標(biāo)引物d2a/d3b擴(kuò)增產(chǎn)生，大小為520bp的條帶是由長嶺發(fā)墊刃線蟲特異性引物tc-f1/tc-r1擴(kuò)增產(chǎn)生；在其它植物寄生線蟲(泳道9-13)中只有內(nèi)標(biāo)引物d2a/d3b擴(kuò)增產(chǎn)生條帶，無長嶺發(fā)墊刃線蟲特異性引物條帶出現(xiàn)，陰性對照(ddh2o)(泳道14)中無擴(kuò)增條帶，說明本發(fā)明雙重pcr方法對長嶺發(fā)墊刃線蟲的檢測特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、可靠性強(qiáng)。

將所得的780bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果獲得seqidno.4所示的核苷酸序列。

實(shí)施例3、本發(fā)明雙重pcr方法檢測靈敏度試驗(yàn)

(一)試驗(yàn)材料

以單條線蟲dna按1/4×、1/8×、1/16×、1/32×、1/64×、1/128×、1/256×、1/512×進(jìn)行濃度梯度稀釋。

(二)試驗(yàn)方法

(1).heb1單條線蟲dna提取方法同實(shí)施例1。

(2).雙重pcr擴(kuò)增方法同實(shí)施例2。

(3).電泳檢測同實(shí)施例1。

結(jié)果(見圖3)單條線蟲dna為1/4×(濃度1ng/μl)至1/32×(濃度0.125ng/μl)(見圖3泳道1-4)時，都能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定的條帶，即在很低的0.125ng/μl模板濃度下都可以進(jìn)行檢測，說明本發(fā)明雙重pcr檢測方法靈敏度高。

sequencelisting

<110>河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>用于鑒定長嶺發(fā)墊刃線蟲的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>520

<212>dna

<213>trichotylenchuschanglingensis

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ccaagtacccgtaccgctgaacacggtgcgcccacagagccaaaatgcaagaacactaat120

gcataaacagacgtataccacaatacatgctgctcaacaaacaaggaacagcacgtaaaa180

cgccttgcctttcaagcagaatgcaaaagtgagctcgcacatgcattacacacaaacgca240

ttgtgttttatgattatgaccctgaaccaggcgtgccagaggaaaaatccaatggcgcaa300

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