本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬細小病毒的分離方法。

背景技術(shù)：

豬細小病毒(porcineparvovirus,ppv)屬于細小病毒科細小病毒屬成員，是一種自我復(fù)制型病毒。ppv是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔及母豬不育和新生仔豬大量死亡。ppv主要通過消化道和呼吸道感染，公豬、育肥豬、母豬的感染大多是因為接觸污染的飼料和飲水，ppv也可以通過生殖道進行傳播。帶毒豬是ppv的主要傳染源，帶毒豬的分泌物和排泄物中的病毒可保持感染數(shù)月，被其污染的圈舍至少在4個月內(nèi)仍具感染性，這主要是因為ppv對熱穩(wěn)定,對許多常用的消毒劑具有抵抗力，因此，污染的圈舍是ppv的主要儲藏所。豬是ppv唯一的易感動物，不同年齡、性別的家豬和野豬均可感染，此外牛、綿羊、貓、豚鼠、小鼠和大鼠等動物血清中也存在ppv的特異性抗體。從20世紀60年代中期分離確定ppv以來，相繼在歐洲、亞洲、美洲等地區(qū)分離到該病毒，目前該病毒已成世界性分布，導(dǎo)致全球養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟損失嚴重。

鑒于該病在世界范圍內(nèi)流行，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)，豬細小病毒的快速分離鑒定對于豬細小病毒病的控制具有重要作用，但傳統(tǒng)的病毒分離方法周期較長，病毒樣品處理過程較為繁瑣，而且易污染，分離的病毒純度還不高，不利于豬細小病毒病的及時診斷，因此，發(fā)明一種豬細小病毒的快速分離鑒定方法，對于該病的迅速診斷及研究具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明目的在于設(shè)計提供一種豬細小病毒快速分離鑒定方法的技術(shù)方案，該方法為豬細小病毒病的診斷及研究提供依據(jù)。

所述的一種豬細小病毒分離方法，其特征在于包括以下步驟：

1）取血管豐富、活力旺盛9-10日齡spf雞胚，胚體挑出來后，置于ph7.0-7.4含小檗堿的pbs溶液漂洗，去掉胚體的四肢、頭部及內(nèi)臟，將剩余的胚體剪成呈1mm³的小塊，經(jīng)pbs溶液漂洗后，按體積比80:1-120:1分別加入pbs溶液與2.5%的胰酶溶液，充分混勻，靜置3-5min后，再加入含2%-5%的胎牛血清終止消化，800-1200r/min離心8-10min，棄去上清，并用含2%-5%的胎牛血清將沉淀重懸，通過細胞過濾器過濾到細胞瓶中，取少量進行計數(shù)，然后分裝于細胞瓶中置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2）無菌采取母豬繁殖的死胎、木乃伊胎的實質(zhì)器官心、肝、脾、肺、腎，放置絞肉機中絞碎，向肉糜中加入肉糜總質(zhì)量1-3倍的d-hanks液，經(jīng)膠體磨充分研磨，混合均勻，將得到的混合液置于高壓勻質(zhì)機內(nèi)，在勻質(zhì)處理過程中溫度控制在25℃以下，即得到勻漿處理液，在勻漿處理液中按1:1-1:3加入d-hanks液，混合均勻，靜置20-30min后，進行分裝離心，3000-5000r/min，離心8-15min，取上清待用，將得到的上清液，首先通過孔徑150kd-200kd的中空纖維膜微濾系統(tǒng)進行微濾處理，收集微濾液，按1:8-1:10加入d-hanks液稀釋，將稀釋好的微濾液再通過0.22um的微孔濾膜進行過濾，收集濾液，即豬細小病毒原液；

3）在已培養(yǎng)24h的生長良好的原代cef細胞，棄去細胞培養(yǎng)液，將豬細小病毒原液與細胞培養(yǎng)液按體積比1:8-1:10加入，將細胞瓶置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育1h，棄掉病毒液，加入含2%胎牛血清的病毒維持液，繼續(xù)培養(yǎng)90-96h，每天觀察細胞病變，收集病變明顯的細胞液，置于-20℃保存。

所述的一種豬細小病毒分離方法，其特征在于所述的步驟1）中ph7.0-7.4含小檗堿的pbs溶液每1000ml由以下成分組成：氯化鈉6-10g、

氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、

含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g、小檗堿1-3mg；將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)0.22um濾膜進行過濾即得，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的一種豬細小病毒分離方法，其特征在于所述的步驟1）中ph7.0-7.4含小檗堿的pbs溶液每1000ml由以下成分組成：氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、

含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g、小檗堿1-3mg；將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)0.22um濾膜進行過濾即得，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的一種豬細小病毒分離方法，其特征在于所述的步驟1）中d-hanks液每1000ml由以下成分組成：氯化鈉8-10g、氯化鉀0.4-0.6g、含1個結(jié)晶水的磷酸氫二鈉0.04-0.08g、磷酸二氫鉀0.04-0.06g、碳酸氫鈉0.3-0.5g、

酚紅0.01-0.02g；將以上各成分充分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)0.22um濾膜進行過濾即得，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明所提出的一種豬細小病毒的分離方法，病料的處理方法無需凍融，經(jīng)過絞肉機、高壓勻質(zhì)機、中空纖維膜濾過系統(tǒng)等，機械化程度高，同時又保證了病毒的完整性，省時省力。

2、本發(fā)明所提出的一種豬細小病毒的分離方法，相比豬源細胞的制備，原代cef細胞制備簡單快速，成本低，大大縮短了病毒的分離周期，有利于豬細小病毒病的及時診斷和研究。

3、本發(fā)明所提出的一種豬細小病毒的分離方法，是將分離的病毒直接接種在分離的禽源的cef細胞中，其獲的病變明顯、病毒含量高的病毒，為豬細小病毒的培養(yǎng)尋找了一種新的易感細胞。

附圖說明

圖1為ppvpcr鑒定結(jié)果；

圖2為應(yīng)用鼠抗ppv的免疫血清對接種病毒的細胞培養(yǎng)物進行間接免疫熒光試驗圖；

圖3為應(yīng)用鼠抗ppv的免疫血清對接種正常的細胞培養(yǎng)物進行間接免疫熒光試驗圖。

圖1中：1:陰性對照；2：陽性對照；3：所分離的毒株；m：dl1000bp。

具體實施方式

為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按常規(guī)實驗方法進行。

實施例1：cef原代細胞的制備

取血管豐富、活力旺盛9-10日齡spf雞胚，消毒后用大頭鑷子將雞胚體氣室輕輕地敲破，暴露出胚體，小心翼翼地將胚體挑出來后，置于ph7.0含小檗堿的pbs溶液（每1000ml含有氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g、小檗堿1-3mg；將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)0.22um濾膜進行過濾即得，置于4℃保存?zhèn)溆茫换蚵然c6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g、小檗堿1-3mg）漂洗一次，然后去掉胚體的四肢、頭部及內(nèi)臟，將剩余的胚體剪成呈1mm³的小塊，經(jīng)pbs溶液漂洗后，按80:1、90:1或120:1（v:v）分別加入pbs溶液與2.5%的胰酶溶液，充分混勻，靜置5min后，再加入含2%的胎牛血清終止消化，之后按1000r/min離心8min，棄去上清，并用含2%的胎牛血清將沉淀重懸，通過細胞過濾器過濾到細胞瓶中，取少量進行計數(shù)，最后分裝于細胞瓶中置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實施例2病料的采集與處理

無菌采取繁殖母豬的死胎、木乃伊胎的實質(zhì)器官心、肝、脾、肺、腎，放置絞肉機中絞碎，向肉糜中加入肉糜總質(zhì)量2倍的d-hanks液，經(jīng)膠體磨充分研磨，混合均勻。將得到的混合液置于高壓均勻質(zhì)機內(nèi)，在勻質(zhì)處理過程中溫度控制在25℃以下，即得到勻漿處理液。在勻漿處理液中按1:1、1:2或1:3加入d-hanks液（每1000ml由以下成分組成：氯化鈉8-10g、氯化鉀0.4-0.6g、含1個結(jié)晶水的磷酸氫二鈉0.04-0.08g、磷酸二氫鉀0.04-0.06g、碳酸氫鈉0.3-0.5g、酚紅0.01-0.02g；將以上各成分充分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)0.22um濾膜進行過濾即得，置于4℃保存?zhèn)溆谩＃?，混合均勻，靜止25min后，進行分裝離心，按3000r/min，離心10min，取上清待用。將得到的上清液，首先通過孔徑200kd的中空纖維膜微濾系統(tǒng)（購買于天津膜天膜工程技術(shù)有限公司）進行微濾處理，收集微濾液，按1:8、1:9或1:10加入d-hanks液稀釋，將稀釋好的微濾液再通過孔徑在超濾系統(tǒng)，收集濾液再通過0.22um的微孔濾膜進行過濾，收集濾液，即豬細小病毒原液。

實施例3：病毒的細胞接種

將已培養(yǎng)24h生長良好的原代cef細胞，棄去細胞培養(yǎng)液，將病毒原液與細胞培養(yǎng)液按1:8、1:9或1:10（v:v）加入，同時設(shè)ppv的陽性對照和空白對照組，再置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育1h，棄掉病毒液，加入含2%胎牛血清的病毒維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至90h，每天觀察細胞病變，陰陽性對照組均成立，收集病變明顯的細胞液，置于-20℃保存。

試驗例豬細小病毒的分離鑒定

1材料

1.1豬細小病毒的分離

按本發(fā)明實施例1-3分離。

1.2dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清購于gibco公司。

1.30.5%豚鼠紅細胞，由浙江美保龍生物技術(shù)有限公司研發(fā)中心自制。

1.4豬細小病毒陽性血清、豬細小間接免疫熒光檢測試劑盒，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.5豬細小病毒陽性毒株，由浙江美保龍生物技術(shù)有限公司研發(fā)中心保存。

1.6pcr相關(guān)試劑，購于大連寶生物公司。

2方法

2.1病毒含量測定

將由實施例3收獲的ppv細胞病毒液，用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液作連續(xù)10倍稀釋，按0.1ml/孔轉(zhuǎn)入96孔鋪滿單層的cef細胞培養(yǎng)板中，置于37℃5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，每天觀察細胞病變并記錄，按reed-muench法計算tcid50。

2.2微量中和試驗

將豬細小病毒標準陽性血清、豬瘟陽性血清分別進行10倍梯度稀釋與200個tcid50的細胞病毒液混勻，置于37℃下，中和1h，接種到96孔細胞板中，每個稀釋度8孔，每空100ul，并設(shè)有未經(jīng)血清處理的陽性對照和正常細胞陰性對照，連續(xù)觀察5d。

2.3血凝試驗

將收獲的病毒細胞培養(yǎng)物，在96孔u板上用pbs按1:2、1:4、1:8…等倍比稀釋病毒原液，用0.5%的豚鼠紅細胞作血凝試驗，每孔加紅細胞50ul，以50%紅細胞凝集為終點，樣品出現(xiàn)凝集終點的最高稀釋度為ha滴度，同時設(shè)紅細胞對照。

2.4pcr鑒定

本試驗根據(jù)genbank發(fā)表的豬細小病毒參考毒株nadl-2株vp2基因核苷酸序列，應(yīng)用oligo6.0及primer5.0等軟件，設(shè)計出一對引物，上游引物（p1）：tggtctccttctgtggtagg，下游引物（p2）：cagaatcagcaacctcac，擴增片段為445bp。利用dna抽提試劑盒提取病毒dna，以病毒dna為模板，采用25ul的pcr反應(yīng)體系：pcrmastermix12.5ul，上、下游引物各１ul，模板dna１ul，ddh2o8.5ul，反應(yīng)程序為：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃5min，并將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果，同時設(shè)陰陽性對照。

2.5免疫熒光試驗

取接種病毒和未接種病毒60h的細胞培養(yǎng)物，棄去培養(yǎng)上清液，按照豬細小病毒間接免疫試劑盒說明書進行試驗，同鼠抗ppv血清37℃作用1h，進行免疫熒光染色，鏡檢觀測，并拍照記錄。

3結(jié)果

3.1tcid50含量測定結(jié)果

利用reed-muench法對所分離毒株的半數(shù)細胞感染量進行測定，各稀釋度病毒cpe結(jié)果見表1，經(jīng)計算得出:tcid50=10^-5.375/0.1ml

表1病毒毒價測定結(jié)果

3.2微量中和試驗結(jié)果

結(jié)果顯示，ppv標準陽性血清可明顯抑制細胞出現(xiàn)cpe，且能夠特異中和所分離病毒；而豬瘟陽性血清對照孔及陽性對照孔均出現(xiàn)cpe，陰性細胞對照無cpe孔出現(xiàn)，以上結(jié)果表明，所分離病毒為豬細小病毒。

3.3血凝試驗結(jié)果

cef細胞培養(yǎng)的分離的細小病毒能夠凝集0.5%豚鼠紅細胞，對該病毒液進行倍比稀釋，按常規(guī)微量法進行血凝試驗，檢測血凝效價為1：256，

表2血凝試驗結(jié)果

注：“++++”表示強陽性；“+++”表示陽性；“+-”表示弱陽性；“-”表示陰性

3.4pcr鑒定結(jié)果

以所分離豬細小病毒dna為模板，pcr擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外燈光下觀察，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。由圖1可見，所分離病毒擴增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，均為455bp。

3.5免疫熒光試驗

應(yīng)用鼠抗ppv的免疫血清對接種病毒的細胞培養(yǎng)物和未接種病毒的對照細胞培養(yǎng)物進行間接免疫熒光試驗，結(jié)果表明，接種病毒的細胞培養(yǎng)物多數(shù)細胞在其胞漿和細胞膜上出現(xiàn)綠色閃亮熒光圖2；正常的細胞未見有綠色熒光圖3。

4結(jié)論

綜上所述，本發(fā)明所提出的豬細小病毒的分離方法，機械化程度高，簡單方便快捷，大大縮短病毒鑒定時間，不僅可以獲得病毒含量、純化水平高的病毒，還為豬細小病毒的培養(yǎng)尋找了一種新的易感細胞。