本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種類bac5抗菌肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗生素的發(fā)現(xiàn)曾給人類帶來巨大的福利。然而，隨著抗生素的大量使用和濫用，細菌耐藥性不斷產(chǎn)生，獸藥殘留危害事件不斷發(fā)生，嚴重危害了人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展。尋找新的抗菌藥物變得更為迫切。在尋找過程中，人們逐漸將目光聚焦于抗菌肽?？咕?antimicrobialpeptides，amps)是生物機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，由10-60個氨基酸殘基構(gòu)成，具有抗細菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生物活性，因其分子量小、熱穩(wěn)定性好，水溶性好、抗菌譜廣、不易形成耐藥性等特性而備受人們關(guān)注，被認為是抗生素的最佳替代品。

目前，抗菌肽的研究與應(yīng)用已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域中的熱點，許多抗菌肽已經(jīng)被開發(fā)成臨床藥物?？咕腷ac5于1989年從牛中性粒細胞中分離得到，是由43個氨基酸組成的富含精氨酸和脯氨酸的抗菌肽，具有廣譜抗菌活性。然而，大部分的天然抗菌肽抑菌活性并不高，且在發(fā)揮抑菌效果的同時往往對正常的真核細胞也產(chǎn)生毒性，以及溶血作用，而且天然抗菌肽的產(chǎn)量低，這都限制了抗菌肽的發(fā)展應(yīng)用。根據(jù)抗菌肽的構(gòu)效關(guān)系及作用機制，以優(yōu)良抗菌肽為模板，進行已有抗菌肽的人工改造與設(shè)計是抗菌肽開發(fā)的一個重要方向。與天然抗菌肽相比，人工設(shè)計抗菌肽具有更好的靶細胞特異性和抗菌活性，甚至還具有低溶血性和對蛋白酶降解的低敏感性等特性。因此，本發(fā)明根據(jù)bac5設(shè)計了結(jié)構(gòu)簡單、化學(xué)合成容易、具有高抗菌活性的類bac5抗菌肽。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種類bac5抗菌肽及其應(yīng)用。本發(fā)明的類bac5抗菌肽對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌、沙門菌)都有高效的抗菌活性，抗菌作用快，具有低溶血性，不產(chǎn)生耐藥性。因此，本發(fā)明的類bac5抗菌肽在制備抗感染藥物、畜牧業(yè)發(fā)展、人類疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

為實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種類bac5抗菌肽，其氨基酸序列如下：

苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸(seqidno.1)。

根據(jù)上述的類bac5抗菌肽，所述類bac5抗菌肽有37個氨基酸殘基，其分子量為4480.51da，等電點為12.6。

本發(fā)明所述的類bac5抗菌肽可用于制備治療革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌感染的藥物。所述藥物包含上述類bac5抗菌肽，并混合有一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載體和/或添加劑。

本發(fā)明所述的類bac5抗菌肽還可用于制備飼料添加劑、消毒劑、防腐劑或化妝品添加劑。

本發(fā)明所述的類bac5抗菌肽采用自動多肽合成儀按照常規(guī)多肽固相法合成，合成方向為從c端到n端，其合成的詳細步驟為：

a、溶漲樹脂：將fmoc-pro-wangresin樹脂加入自動多肽合成儀反應(yīng)器內(nèi)，并加入二甲基甲酰胺dmf進行溶漲，1gfmoc-leu-wangresinin樹脂加入dmf的量約為12ml(dmf應(yīng)完全浸沒樹脂)，溶漲時間為10～30min，溶漲可重復(fù)1～2次；

b、脫保護：樹脂溶漲后，將儲罐內(nèi)20％哌啶(20％哌啶是將哌啶溶于二甲基甲酰胺dmf中配制而成的)加入到反應(yīng)器內(nèi)，浸沒樹脂(1gfmoc-pro-wangresinin樹脂需要加入20％哌啶約為10ml)，使溶漲后的樹脂脫保護，時間約為30min，然后加入二甲基甲酰胺dmf進行洗滌；

c、縮合反應(yīng)：接著按照類bac5抗菌肽氨基酸序列的排序加入第二種氨基酸脯氨酸fmoc-pro，并加入縮合劑hctu(6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)和催化劑nmm(n-甲基嗎啡啉)或diea(n,n二異丙基乙胺)進行縮合反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后加入二甲基甲酰胺dmf進行反復(fù)洗滌，除去未反應(yīng)的氨基酸；所述脯氨酸與fmoc-pro-wangresinin樹脂的摩爾比為5:1；所述縮合劑hctu與脯氨酸fmoc-pro之間的摩爾比為1:1；所述催化劑nmm或diea與脯氨酸二者之間的摩爾比為4:1；

洗滌后所得產(chǎn)物按照步驟b同樣方法進行脫保護、洗滌，依照上述步驟c同樣方法依次加入氨基酸fmoc-arg、fmoc-phe、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-phe、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-phe、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-tyr、fmoc-phe、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-arg、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg和fmoc-phe進行縮合反應(yīng)、洗滌，最后一個縮合反應(yīng)、洗滌后，得到多肽產(chǎn)物；每次縮合反應(yīng)、洗滌后所得產(chǎn)物均按照步驟b的方法進行脫保護、洗滌，然后加入下一個氨基酸進行縮合反應(yīng)、洗滌(每次縮合反應(yīng)中，所加入氨基酸與fmoc-pro-wangresinin樹脂的摩爾比均為5:1；所述縮合劑hctu與每種所加氨基酸二者之間的摩爾比均為1:1；所述催化劑nmm或diea與每種所加氨基酸二者之間的摩爾比均為4:1)；

d、多肽產(chǎn)物的脫保護和裂解：在步驟c所得多肽產(chǎn)物中加入20％哌啶到反應(yīng)器內(nèi)，并浸沒多肽產(chǎn)物(對1g樹脂進行脫保護所用20％哌啶的量約為10ml)，使其對多肽產(chǎn)物進行脫保護；脫保護后，依次加入二甲基甲酰胺dmf、二氯甲烷dcm進行反復(fù)洗滌；洗滌后，加入三氟乙酸t(yī)fa進行裂解(對1g樹脂進行裂解所用tfa的體積約為20ml)，使多肽從樹脂上裂解下來；對裂解后的產(chǎn)物進行過濾(用砂心漏斗進行過濾)，得到濾液；

e、沉淀合成多肽：用冷乙醚對所得濾液進行洗滌、離心，以沉淀合成多肽，其過程為：在步驟d得到的濾液中加入其3倍體積的冷乙醚(預(yù)先保存于4℃)，密封后顛倒混勻，冰浴10min，在4000r/m下離心10min，棄上清液體，回收沉淀；用冷乙醚重懸沉淀，重復(fù)上述步驟三次，之后將所得沉淀干燥12～16h，得到合成肽粗品；

f、合成肽粗品的純化：采用半制備型高效液相色譜儀p2000對合成肽粗品進行過柱純化，收集純度≥95％的餾分，即得到純化后的類bac5抗菌肽，其純度≥95％。

半制備型高效液相色譜儀為p2000是由北京沃華創(chuàng)新科技有限公司提供，色譜柱為c18反相柱(4.6*250mm)，流動相a為0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml乙腈溶液中)，流動相b為0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml去離子水中)，使用上述處理柱，上樣后25min內(nèi)，流動相a的比例由27％逐步調(diào)至52％，流動相b的比例由73％逐步調(diào)至48％，25.1min時，流動相a的比例變?yōu)?00％，流動相b的比例變?yōu)?％，以1ml/min的流速進行30min的分離，檢測波長為220nm，收集純度≥95％的餾分(如附圖1所示)；

本發(fā)明所得類bac5抗菌肽的確認鑒定：采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(watersmicromasszq-2000)測定所得產(chǎn)品抗菌肽的分子量，經(jīng)測定：其分子量為4480.51da(如附圖2所示)。高效液相色譜條件：色譜柱為c18反相柱(4.6*250mm)，流動相a為0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml乙腈溶液中)，流動相b為0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml去離子水中)，上樣后25min內(nèi)，流動相a的比例由25％逐步調(diào)至50％，流動相b的比例由75％逐步調(diào)至50％，25.1min時，流動相a的比例變?yōu)?00％，流動相b的比例變?yōu)?％，以1ml/min的流速進行30min的分離，檢測波長為220nm。質(zhì)譜測定條件：采用正離子化模式，其毛細管電壓為3.00kv，毛細管出口電壓50v，碎裂電壓為5v，干燥氣流量為1.5l/min，干燥氣溫度為350℃，掃描范圍為400～1900m/z。

本發(fā)明具有的積極有益效果：

本發(fā)明的類bac5抗菌肽由37個氨基酸組成，富含精氨酸，對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌、沙門菌)和真菌都有高效的抗菌活性，抗菌作用快，抗菌活性強，具有低溶血性，不產(chǎn)生耐藥性。因此，本發(fā)明的類bac5抗菌肽在制備抗感染藥物、畜牧業(yè)發(fā)展、人類疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明類bac5抗菌肽的高效液相色譜圖。

圖2為本發(fā)明類bac5抗菌肽的質(zhì)譜圖。

圖3為類bac5抗菌肽的等電點分析結(jié)果。

圖4為類bac5抗菌肽對大腸桿菌最小抑菌濃度測定結(jié)果。

圖5為類bac5抗菌肽對沙門菌最小抑菌濃度測定結(jié)果。

圖6為類bac5抗菌肽對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度測定結(jié)果。

圖7為類bac5抗菌肽的溶血率測定結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但并不限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：

一種類bac5抗菌肽，其氨基酸序列如下：

苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸。

該類bac5抗菌肽含有37個氨基酸殘基，其分子量為4480.51da，等電點為12.6。所述類bac5抗菌肽富含精氨酸殘基(帶正電荷)，可吸引細菌表面的負電荷。

本實施例類bac5抗菌肽是采用自動多肽合成儀按照常規(guī)多肽固相法合成，最終合成類bac5抗菌肽經(jīng)半制備型高效液相色譜儀進行純化分析處理，其純度≥95％。

本發(fā)明所得類bac5抗菌肽產(chǎn)品的鑒定：

(1)分子量的測定：采用分析型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(watersmicromasszq-2000)測定所得類bac5抗菌肽的分子量，經(jīng)測定，其分子量為4480.51da，結(jié)果如附圖2所示。

具體的檢測條件為：①色譜條件為：色譜柱為c18反相柱(4.6*250mm)，流動相a為0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml乙腈溶液中)，流動相b為0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml去離子水中)，上樣后25min內(nèi)，流動相a的比例由25％逐步調(diào)至50％，流動相b的比例由75％逐步調(diào)至50％，25.1min時，流動相a的比例變?yōu)?00％，流動相b的比例變?yōu)?％，以1ml/min的流速進行30min的分離，檢測波長為220nm。②質(zhì)譜測定條件：采用正離子化模式，其毛細管電壓為3.00kv，毛細管出口電壓50v，碎裂電壓為5v，干燥氣流量為1.5l/min，干燥氣溫度為350℃，掃描范圍為400～1900m/z。

(2)氨基酸序列結(jié)構(gòu)測定：采用自動氨基酸測序儀測定類bac5抗菌肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。經(jīng)測定，類bac5抗菌肽含有37個氨基酸殘基，其氨基酸序列為：苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸。

(3)等電點分析：

打開dnastar軟件中的editseq，打開file，點擊“new”中的“newprotein”，輸入類bac5抗菌肽的氨基酸序列，另存為pro格式的文檔。然后再打開dnastar軟件中的protean，打開file，點擊“open”，選擇剛保存為pro格式的文檔，點擊“打開”，選擇“analysis”中的“titrationcurve”，即可以獲得等電點數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖3。經(jīng)測定，本發(fā)明類bac5抗菌肽的等電點分別為12.6。

實施例2：本發(fā)明類bac5抗菌肽的應(yīng)用實施

1、類bac5抗菌肽的抑菌活性分析

采用瓊脂平板擴散法測定類bac5抗菌肽的抑菌活性，其受試微生物菌株為：大腸桿菌atcc8099、沙門菌cvcc541、金黃色葡萄球菌atcc6538，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌購自南京便診生物科技有限公司，沙門菌購置中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

將上述3種受試微生物分別稀釋于50℃的底層培養(yǎng)基(tsb0.3g，超純的瓊脂糖0.1g，加超純水至10ml，ph7.4)中，倒滅菌平板，凝固，用打孔器打孔(孔徑約3mm)，酒精燈稍加熱進行封底，用移液器向每孔中加入5μl抗菌肽樣品，每個平板包括陽性對照和陰性對照。陽性對照：氨芐青霉素針對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌；陰性對照：pbs緩沖液。將平板靜置1h，使測試液擴散入瓊脂糖中。然后，再添加上層覆蓋培養(yǎng)基(tsb0.3g，超純的瓊脂糖0.1g，加超純水至10ml，ph7.4，50℃左右)。將培養(yǎng)平板在37℃倒置培養(yǎng)過夜，然后記錄孔周邊的透明圈的直徑，每個菌種重復(fù)測定三次，計算平均值。

表1類bac5抗菌肽的抑菌活性分析結(jié)果

由表1抗菌活性檢測結(jié)果顯示，本發(fā)明的類bac5抗菌肽對大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌均有較強的抗菌活性。因此，本發(fā)明的類bac5抗菌肽可望在制備治療動物和人細菌性疾病的藥物方面有著很好的應(yīng)用前景，同時，根據(jù)已知抗菌肽的一般特性，類bac5抗菌肽在飼料添加劑、消毒劑、防腐劑或化妝品添加劑等方面有良好的應(yīng)用潛能。

2、類bac5抗菌肽的最小抑菌濃度(mic)測定

受試微生物菌株為：大腸桿菌atcc8099、沙門菌cvcc541、金黃色葡萄球菌atcc6538，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌購自南京便診生物科技有限公司，沙門菌購置中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

將受試菌株在tsb液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，測菌液的od600值。當od值在0.6-0.8時，將菌液在6000r/min條件下離心10min，棄去上清，收集菌體沉淀，將菌體沉淀用等體積的pbs緩沖液(0.01m)重懸，再用mh培養(yǎng)基將細菌懸液稀釋到2×10⁶cfu/ml。用去離子水稀釋類bac5抗菌肽樣品，使其濃度為0.78-100μg/ml。在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔分別添加50μl不同濃度的類bac5抗菌肽和50μl稀釋的細菌溶液，每個濃度重復(fù)三孔，置于37℃培養(yǎng)16-18h，然后混勻每孔中的溶液，測定其od600值，以od值突然變化對應(yīng)的類bac5抗菌肽濃度為其mic，結(jié)果見圖4、圖5和圖6。

由圖4、圖5和圖6可知，類bac5抗菌肽對大腸桿菌的最小抑菌濃度(mic)為6.25μg/ml，對沙門菌的最小抑菌濃度(mic)為6.25μg/ml，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(mic)為12.5μg/ml。結(jié)果表明，該類bac5抗菌肽對常見的細菌的最小抑菌濃度均達到微克級，具有極強的抑菌活力。

3、類bac5抗菌肽的溶血性分析

取新鮮兔血液，用3.8％檸檬酸鈉抗凝，將抗凝血經(jīng)3000r/min離心10min，用磷酸鹽緩沖液(pbs)洗滌沉淀3次，至上清為無色、透明，再用pbs配制1％紅細胞。用pbs將類bac5抗菌肽的濃度調(diào)整為400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0.39μg/ml，加入等體積的紅細胞懸液。以pbs為陰性對照，以1％tritonx-100為陽性對照，37℃作用1h，1500r/min離心10min，將上清液依次加入96孔板，用酶標儀測540nm處的od值。然后根據(jù)計算公式溶血率(％)＝(檢測孔od值-陰性孔od值)/(陽性孔od值-陰性孔od值)×100％計算溶血率，其結(jié)果見圖7。

由圖7可知，在400μg/ml的高濃度條件下，類bac5抗菌肽的溶血率為4.29％，仍低于5％，說明類bac5抗菌肽有較好的安全性，臨床應(yīng)用前景巨大。

綜上所述，本發(fā)明類bac5抗菌肽產(chǎn)品不產(chǎn)生溶血性，抗菌譜廣，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌都具有高效的抗菌作用。所以，本發(fā)明產(chǎn)品類bac5抗菌肽在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌的藥物中能夠得到較佳的應(yīng)用，而且，還可用于制備飼料添加劑、消毒劑、防腐劑或化妝品添加劑。

sequencelisting

<110>河南科技學(xué)院

<120>一種類bac5抗菌肽及其應(yīng)用

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>37

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>1

<400>1

pheargproproileargargproproileargproprophetyrpro

151015

propheargproproileargproproilepheproproileargpro

202530

propheargpropro

35